周 杰，張 莉，楊書才，張 揚(yáng)，康文榮，葉麗嫻，王革非

B族鏈球菌(group B streptococcus,GBS)是革蘭陽(yáng)性兼性厭氧菌，常存在于胃腸道和泌尿生殖道內(nèi)，為條件致病菌[1]。圍生期孕婦陰道或直腸內(nèi)GBS的定植率為10%～35%[2-3]。約有50%的GBS攜帶孕婦會(huì)把該菌傳播給新生兒，在沒有產(chǎn)前抗菌藥物預(yù)防的情況下，1%～2%的新生兒會(huì)出現(xiàn)早發(fā)型GBS感染，表現(xiàn)為重癥肺炎、敗血癥及化膿性腦膜炎，如不及時(shí)治療會(huì)造成新生兒死亡或神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥等嚴(yán)重不良后果[4-5]。美國(guó)自20世紀(jì)90年代開始對(duì)圍生期孕婦進(jìn)行GBS篩查，對(duì)攜帶GBS的孕婦產(chǎn)前應(yīng)用抗菌藥物預(yù)防，極大降低了新生兒GBS感染率[6]。細(xì)菌培養(yǎng)法是GBS篩查的金標(biāo)準(zhǔn)，目前圍生期孕婦陰道/直腸拭子篩查GBS的方法主要為血平板培養(yǎng)法、顯色平板培養(yǎng)法。但培養(yǎng)法存在耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、影響因素多等缺點(diǎn)。本研究擬通過比較熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法與顯色平板培養(yǎng)法篩查圍生期孕婦陰道/直腸拭子的陽(yáng)性率，分析熒光PCR法篩查GBS的可行性。現(xiàn)作報(bào)道。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2020年4-12月產(chǎn)科門診孕婦標(biāo)本1 143份，年齡18～45歲，孕35～37周，由產(chǎn)科醫(yī)生先用一次性棉拭子采集孕婦陰道下1/3處分泌物，再將同一拭子插入肛門內(nèi)1～3 cm，旋轉(zhuǎn)一圈后取出，1 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 VITEK-2型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀及鑒定卡(法國(guó)梅里埃)，ABI7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI)；GBS增菌肉湯管(江門凱琳)，GBS顯色平板(鄭州安圖)，GBS核酸檢測(cè)試劑(深圳優(yōu)康)。

1.2.2 顯色平板培養(yǎng)法 實(shí)驗(yàn)室接到樣本后，將拭子放入GBS增菌肉湯管，于35 ℃培養(yǎng)箱增菌18～24 h。將增菌管內(nèi)肉湯混勻，用一次性接種環(huán)取10 μL肉湯接種GBS顯色平板，三區(qū)劃線后將平板放入35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。經(jīng)24～48 h培養(yǎng)，從顯色平板挑取紅色或紫紅色菌落轉(zhuǎn)種血瓊脂平板培養(yǎng)18～24 h，挑取菌落制備菌懸液后用細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.2.3 熒光PCR法 將接種后的增菌肉湯管放4 ℃冰箱冷藏，顯色平板培養(yǎng)為陽(yáng)性的增菌肉湯管用熒光PCR法單獨(dú)檢測(cè)。培養(yǎng)為陰性的增菌肉湯管，各吸取100 μL肉湯到無菌管中，每5個(gè)增菌肉湯管組成1組樣本，用熒光PCR法檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)為GBS陽(yáng)性的混合樣本，再單獨(dú)對(duì)每個(gè)增菌肉湯管進(jìn)行檢測(cè)。熒光PCR法具體操作步驟如下：將含有增菌液的無菌管12 000 r/min離心5 min，取沉淀加入50 μL核酸提取液，震蕩后3 000 r/min 離心10 s，100 ℃孵育10 min，12 000 r/min離心5 min，上清液供PCR擴(kuò)增用。陰性、陽(yáng)性對(duì)照直接取50 μL，加入50 μL核酸提取液，其余操作步驟同樣本。在準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管中加入GBS反應(yīng)液35.2 μL、Taq酶0.8 μL，然后分別加入4 μL待測(cè)樣本和陰性、陽(yáng)性對(duì)照處理液，蓋上管蓋3 000 r/min離心10 s。熒光PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 3 min 1個(gè)循環(huán)，94 ℃ 15 s ，60 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)結(jié)果按照CT值≤38.0判為陽(yáng)性，CT值>38.0～<40的樣本重新上機(jī)，重做結(jié)果CT值<40者為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.2.4 CAMP試驗(yàn) GBS通常產(chǎn)生CAMP因子，該因子能增強(qiáng)金黃色葡萄球菌的β溶血素溶解紅細(xì)胞的能力，CAMP試驗(yàn)是指GBS和金黃色葡萄球菌的交界處溶血能力增加，出現(xiàn)箭矢型的透明溶血區(qū)。CAMP試驗(yàn)具體操作流程：用ATCC25923金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上劃一條橫線，GBS靠近金黃色葡萄球菌劃一條豎線，然后將血瓊脂平板放35 ℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察其協(xié)同溶血現(xiàn)象。

1.2.5 基因檢測(cè) CAMP試驗(yàn)陰性的GBS菌株送上海派諾森公司進(jìn)行16SrDNA菌株測(cè)序，將測(cè)序數(shù)據(jù)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，并利用MEGA7.0軟件對(duì)同源相近的鏈球菌的16SrDNA序列構(gòu)建進(jìn)化樹。為驗(yàn)證這些菌株是否為編碼CAMP因子的cfb基因缺失所致，參照文獻(xiàn)[7]中報(bào)道的cfb基因設(shè)計(jì)引物，引物序列為F:5′-ATG ATG TAT CTA TCT GGA ACT CTA GTG-3′；R:5′-CGC AAT GAA GTC TTT AAT TTT TC-3′。對(duì)分離的CAMP陰性GBS、2株臨床分離CAMP陽(yáng)性GBS、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行cfb基因檢測(cè)，預(yù)期目的基因片段大小為260 bp?；驍U(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳，將基因擴(kuò)增產(chǎn)物送上海派諾森公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 2種方法檢測(cè)結(jié)果比較 GBS顯色平板培養(yǎng)出146株GBS，陽(yáng)性率為12.77%，熒光PCR法檢出191例陽(yáng)性標(biāo)本，陽(yáng)性率為16.71%，2種方法陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；熒光PCR法與顯色平板培養(yǎng)法相比，敏感性為93.15%、特異性為94.48%、符合率為94.31%(見表1)。顯色平板培養(yǎng)法與熒光PCR法檢測(cè)GBS陽(yáng)性結(jié)果見圖1。

表1 熒光PCR法與顯色平板培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果比較(n)

2.2 CAMP試驗(yàn)結(jié)果 顯色平板培養(yǎng)法檢出146株GBS，其中10株熒光PCR法檢測(cè)為陰性，將這10份GBS菌株的增菌肉湯管取出重新鑒定，均為GBS。對(duì)這10株GBS、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行CAMP試驗(yàn)，10株GBS和陰性對(duì)照菌株為陰性，陽(yáng)性對(duì)照菌株為陽(yáng)性。陰性對(duì)照選用糞腸球菌ATCC29212，陽(yáng)性對(duì)照選用B族鏈球菌ATCC13183(見圖2)。

2.3 CAMP試驗(yàn)陰性GBS菌株基因檢測(cè)結(jié)果 進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，10株CAMP陰性菌株(GBS1-GBS10)與GBS(AB596948)聚為一類(見圖3)。電泳結(jié)果顯示，2株CAMP陽(yáng)性GBS和陽(yáng)性對(duì)照有特異性條帶，10株CAMP陰性GBS和陰性對(duì)照未出現(xiàn)特異性條帶。陽(yáng)性對(duì)照測(cè)序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，與cfb基因符合率為100%(見圖4)。 2株CAMP陽(yáng)性菌株含有cfb基因，10株CAMP陰性GBS未擴(kuò)增出cfb基因，證實(shí)10株GBS表現(xiàn)為CAMP試驗(yàn)陰性是由cfb基因缺失導(dǎo)致。

3 討論

GBS可引起牛乳腺炎，最早為獸醫(yī)界所關(guān)注。1938年首次報(bào)道3例病人死于GBS感染，證實(shí)該菌也可以感染人類。嚴(yán)重的圍生期GBS感染最初被描述于20世紀(jì)60年代。20世紀(jì)70年代，GBS成為美國(guó)新生兒感染和死亡的主要病原菌[8]。圍生期孕婦陰道/直腸攜帶的GBS，通過分娩時(shí)傳播給新生兒，是新生兒感染GBS的主要途徑。美國(guó)CDC于1996年發(fā)布了“預(yù)防圍生期B族鏈球菌病指南”，該指南在2002年和2010年進(jìn)行了更新，指南中明確指出對(duì)圍生期孕婦進(jìn)行陰道/直腸拭子GBS篩查，如為陽(yáng)性，在產(chǎn)時(shí)進(jìn)行抗菌藥物預(yù)防，以降低新生兒感染率和死亡率[9]。20世紀(jì)90年代，美國(guó)通過基于圍生期GBS篩查與產(chǎn)時(shí)抗菌藥物使用來預(yù)防新生兒GBS感染，新生兒GBS早發(fā)型感染率從20世紀(jì)90年代初期的1.8/1 000下降到2010年的0.26/1 000[10]。

已有研究[11]顯示，不同地區(qū)的孕婦GBS攜帶率有較大差異，非洲地區(qū)為18.1%～26.7%，美洲地區(qū)為16.7%～22.7%，歐洲地區(qū)為16.1%～22.0%，東南亞地區(qū)為6.8%～15.3%，這可能與GBS在不同人群攜帶率有差異和檢測(cè)方法的不同有關(guān)。另一篇納入多篇中國(guó)研究共44 716例孕婦的薈萃分析顯示，中國(guó)孕婦GBS定植率為11.3%[12]，本次的顯色平板培養(yǎng)法12.77%的陽(yáng)性率與之接近，但是低于熒光PCR法16.71%的陽(yáng)性率。

細(xì)菌培養(yǎng)法雖然是GBS篩查的金標(biāo)準(zhǔn)，但是存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜等特點(diǎn)，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有敏感度高、檢測(cè)周期短等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)。本次采用的熒光PCR法與顯色平板培養(yǎng)法相比，敏感性、特異性及符合率均高于90%，是一種可以代替培養(yǎng)的方法。本次顯色平板共分離出146株GBS，低于熒光PCR法檢測(cè)出191份陽(yáng)性標(biāo)本，分析原因有以下兩個(gè)方面，首先是顯色平板培養(yǎng)法受方法學(xué)限制，只能取10 μL左右增菌肉湯進(jìn)行培養(yǎng)，不然不利于單個(gè)菌落的分離，這遠(yuǎn)低于熒光PCR法用100 μL增菌肉湯進(jìn)行基因擴(kuò)增；其次是GBS增菌肉湯管只抑制革蘭陰性桿菌，對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌沒有抑制作用，當(dāng)標(biāo)本中含有大量糞腸球菌和其他鏈球菌而只有少量GBS時(shí)，這些細(xì)菌通過競(jìng)爭(zhēng)抑制GBS的增殖，從而在培養(yǎng)時(shí)造成漏檢。

CAMP反應(yīng)是指GBS特異性地增加金黃色葡萄球菌對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶解能力[13]。因CAMP反應(yīng)具有很高的特異性，很久以來人們一直將是否出現(xiàn)CAMP現(xiàn)象作為實(shí)驗(yàn)室診斷GBS的一個(gè)重要依據(jù)[14]。以往文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道，絕大多數(shù)GBS含有編碼CAMP因子的cfb基因，因此許多實(shí)驗(yàn)室和公司將cfb基因作為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，通過分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)圍生期孕婦陰道/直腸拭子中GBS，本次熒光PCR法檢測(cè)試劑也選用cfb基因設(shè)計(jì)引物。 CAMP試驗(yàn)雖然是GBS的重要鑒別試驗(yàn)，但CAMP陰性的GBS偶爾也有報(bào)道，目前認(rèn)為小于2%的GBS表現(xiàn)為CAMP陰性[17]。本次培養(yǎng)法分離的146株GBS中有10株為CAMP陰性，檢出率為6.8%，并且這些菌株是編碼CAMP因子的cfb基因缺失導(dǎo)致。GBS編碼CAMP因子的cfb基因較高比例的缺失，說明本地區(qū)不宜采用cfb基因作為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)引物檢測(cè)圍生期孕婦GBS，也不宜將CAMP試驗(yàn)作為鑒定GBS的特異性試驗(yàn)。

CAMP是一種重要的致病因子，在活體動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)純化的CAMP因子可導(dǎo)致兔及小鼠死亡[18]。但HENSLER等[19]通過對(duì)cfb 基因進(jìn)行等位基因替換后的體外及體內(nèi)試驗(yàn)研究認(rèn)為，CAMP因子在GBS的毒力系統(tǒng)中不是必須的。因此，CAMP因子在感染過程中的作用還存在爭(zhēng)議。

綜上，熒光PCR法和顯色平板培養(yǎng)法相比，可有效提高圍生期孕婦GBS篩查的陽(yáng)性率，有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)推廣普及。本地區(qū)CAMP試驗(yàn)陰性GBS占比較高，應(yīng)避免將該試驗(yàn)作為GBS的鑒別試驗(yàn)。因存在缺失cfb基因GBS，GBS分子檢測(cè)試劑不應(yīng)選擇該段基因設(shè)計(jì)引物。