木朝宇，張曉梅，徐 珍，姚慧琳，范德勝，劉培明

宮頸癌(cervical cancer,CC)是女性中最常見(jiàn)的癌癥之一，由于宮頸篩查在中國(guó)尚未廣泛實(shí)施，2012年CC的發(fā)病率為每10萬(wàn)人62例，其中約50%導(dǎo)致CC相關(guān)死亡(每10萬(wàn)人30例)[1]。在全球范圍內(nèi)，中國(guó)占新CC病例的11.9%，每年死亡率為11.1%[2]。流行病學(xué)評(píng)估在無(wú)干預(yù)的情況下，中國(guó)新發(fā)CC的發(fā)生率從2010年至2050年可能會(huì)增加40%～50%[3]。

人乳頭瘤病毒(HPV)屬于高度異質(zhì)性的DNA病毒，可引起皮膚和黏膜上皮內(nèi)細(xì)胞內(nèi)瘤變。HPV可根據(jù)其與癌前病變的關(guān)聯(lián)性分為高危型(high-risk,HR)和低危型(low-risk,LR)，而依據(jù)病毒不同的感染狀態(tài)又可分為單一亞型的感染和多重亞型的混合感染(包括二重感染、三重感染以及更多亞型感染)，其中臨床上多重感染以二重感染最為常見(jiàn)。臨床上不同HPV亞型的致病性不同,有報(bào)道[4]指出HPV高危型持續(xù)或反復(fù)感染是CC以及癌前病變進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素。此外,HPV亞型之間外殼蛋白差異性較大,產(chǎn)生的抗體基本不具備交叉保護(hù)作用,因此易出現(xiàn)多種亞型混合感染以及反復(fù)感染[4]。而對(duì)于HPV多重亞型混合感染是否促進(jìn)宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展,目前尚且存在爭(zhēng)議。LEE等[5]報(bào)道HPV單一亞型感染可提高CC的患病風(fēng)險(xiǎn)至19.9倍，而HPV多重亞型混合感染可使該風(fēng)險(xiǎn)上升到31.8倍。此外，也有報(bào)道[6]顯示在CC的高危年輕群體中,HPV多亞型混合感染率明顯高于單一亞型的感染,HPV持續(xù)感染的病人感染其他亞型的可能性亦較大。但也有文獻(xiàn)[7]報(bào)道,隨著宮頸病變程度的提高,多亞型混合感染率趨于降低,且宮頸鱗癌傾向于HR-HPV單一感染。

本研究通過(guò)分析HPV多重亞型混合感染的不同年齡段女性病人中不同級(jí)別宮頸病變的分布,探討HPV多重亞型混合感染在CC和癌前病變發(fā)生的影響,為臨床宮頸癌的防治提供風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 2017年3月至2019年5月淮北礦工總醫(yī)院婦科就診、篩查和體檢并接受HPV分型檢測(cè)的女性6 382例，年齡19～90歲，中位年齡46.01歲。根據(jù)HPV檢測(cè)結(jié)果，僅有1種亞型感染者定義為單一感染，而2種及以上亞型混合感染者定義為多重混合感染。HPV多重混合感染包括高?；旌闲?、高低?；旌闲鸵约暗臀；旌闲?種類型，并根據(jù)液基細(xì)胞學(xué)(TCT)和陰道鏡下病理組織活檢結(jié)果進(jìn)行分組。

1.2 主要試劑及儀器 HPV核酸擴(kuò)增分型檢測(cè)試劑盒、核酸分子快速雜交儀，均為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司配套儀器和試劑；核酸擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI7500 PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 宮頸樣本由婦科醫(yī)生通過(guò)細(xì)胞刷獲得，并將采集的宮頸上皮脫落細(xì)胞標(biāo)本置于樣本保存液中，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 核酸抽提 將樣品混合加入帶有1 mL細(xì)胞保存溶液的1.5 mL離心管中，以12 000 r/min離心3 min，除去上清液，向沉淀物加入1 mL 0.9%氯化鈉溶液后渦旋混勻，以12 000 r/min離心3 min，再次除去上清液，并將100 μL變性試劑(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)加入到沉淀中并渦旋混勻。然后，將樣品在100 ℃溫育10 min，并以12 000 r/min離心3 min，收集上清液并使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度，所得核酸用于實(shí)驗(yàn)或于-20 ℃中保存待用。

1.3.3 PCR-DNA反向點(diǎn)雜交技術(shù) PCR循環(huán)條件反應(yīng)條件為95 ℃、15 min，95 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、40 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃、7 min，4 ℃維持，即可得到擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物。然后，將擴(kuò)增的產(chǎn)物純化，變性并雜交。核酸分子雜交及HPV基因分型的顯色結(jié)果判定分析等過(guò)程均參考試劑盒說(shuō)明書。試劑盒檢測(cè)的亞型中包括15種高危亞型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)、三種可能高危亞型(26、53和66)以及10種低危亞型(6、11、40、42、43、44、54、61、81和83)。

1.3.4 TCT和宮頸組織病理檢查 TCT包括未見(jiàn)上皮內(nèi)病變或惡性細(xì)胞(NILM)、無(wú)確定診斷意義的非典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)和不能排除高級(jí)別上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-H)、 低級(jí)別上皮內(nèi)病變(LSIL)、高級(jí)別上皮內(nèi)病變(HSIL)、鱗狀癌(SCC)、不典型腺上皮細(xì)胞(AGC)、腺原位癌(AIS)。宮頸組織病理活檢包括宮頸慢性炎癥、LSIL、 HSI和浸潤(rùn)性癌(ICC)等。本研究中TCT和宮頸組織病理檢查數(shù)據(jù)由本院病理科提供。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HPV多重感染的流行病學(xué)表現(xiàn) 本研究中6 382例樣本基因分型檢測(cè)顯示HPV感染率為16.4%(1 044/6 382)，其中HPV單一感染陽(yáng)性占比67.0%(700/1 044)，感染率為11.0%(700/6 382)；而多重混合感染陽(yáng)性占比33.0%(344/1 044)，感染率為5.4%(344/6 382)。此外，344例多重混合感染樣本中，HR-HPV和LR-HPV基因型的頻數(shù)分別為310和222。多重混合感染以二重感染為主(220例,63.9%)，其次是三重感染(68例,19.8%)、四重感染(28例,8.1%)、五重感染(20例,5.8%)等，最高多達(dá)八重感染。多亞型混合感染隨著混合種類的增加，感染的占比逐漸降低。在多亞型混合感染病例中，高低?；旌闲透腥菊急茸罡?4.65%(188/344)，其次為高危亞型混合感染35.47%(122/344)，而低危混合型最低9.88%(34/344)，三者感染差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=156.17，P<0.01)。

2.2 HPV多重感染亞型分布 本研究中，HPV 28種亞型均被檢出，排前5位的亞型依次為HPV52 11.7%、HPV40 8.4%、HPV44 7.7%、HPV16 6.8%、HPV58和HPV53 5.9%。其中高危亞型流行的前3名依次為HPV52、HPV16、HPV58型，低危亞型流行的前3名依次為HPV40、HPV44、HPV54型。HPV52感染頻次與其他各型相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；HPV16感染頻次與其他各型相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 HPV多重感染亞型頻數(shù)分布(n=909)

2.3 HPV多重感染及宮頸病變的年齡分布情況 不同年齡段婦女人群HPV多重感染構(gòu)成比位次前3的年齡段依次為41～50歲年齡段占35.8%、51～60歲年齡段占28.2%和31～40歲年齡段占15.4%。隨著年齡的增加，感染頻次波動(dòng)上升(χ2=18.34，P<0.01)(見(jiàn)表2)。41～50歲是HPV多重感染例數(shù)和HR亞型頻數(shù)分布最多的年齡段，位次前3的亞型依次是HPV52占18.2%、HPV16占10.6%、HPV58占9.2%；不同于HPV52、16亞型(41～50歲)，HPV58亞型分布最多的是51～60歲的年齡組；HPV多重感染病人中宮頸病變的分布也主要集中在41～50歲年齡段，其次是51～60歲年齡段。但不同年齡組中宮頸病變的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.97，P>0.05)(見(jiàn)表3)。多重混合感染中，除31～40歲年齡組外，其余年齡段均以高低?；旌闲透腥緸橹鳎呶；旌闲痛沃臀；旌闲妥钌佟３?1歲年齡組外，其余年齡組3種混合感染差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.20，P>0.05)(見(jiàn)表4)。LSIL與HSIL分布隨年齡段增大而增加，在41～50歲達(dá)到最高，隨后降低；而CC分布則在51～60歲年齡段達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢(shì)，41～50歲與51～60歲年齡段低級(jí)別宮頸病變(LSIL)與嚴(yán)重宮頸病變(HSIL+CC)的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.20，P>0.05)(見(jiàn)表5)。

表2 不同年齡段HPV多重感染分布情況[n；構(gòu)成比(%)]

表3 不同年齡段HPV多重感染的高危亞型及宮頸病變分布情況[n；構(gòu)成比(%)]

表4 不同年齡段HPV多重混合感染類型分布情況(n)

表5 不同年齡組HPV多重感染LSIL、HSIL及CC分布情況(n)

2.4 HPV多重混合感染中宮頸病變的分布情況 344例HPV多重混合感染行TCT和陰道鏡下病理組織活檢結(jié)果顯示，正常組305例，LISL組22例，HSIL組12例以及CC組5例(見(jiàn)表6)。344例多重混合感染中高危混合型122例、高低危混合型188例、低?；旌闲?4例。高?；旌闲蛯m頸病變率為21.31%高于低?；旌闲偷?.94%和高低危混合型的6.39%(P<0.01)，低危混合型與高低?；旌闲蛧?yán)重宮頸病變率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表7)。此外，39例宮頸病變病人HPV多重感染的高危亞型分布結(jié)果：LSIL組分布有13種高危亞型，感染頻次較高的亞型依次為HPV52、HPV31、HPV56、HPV33；HSIL組分布有11種高危亞型，感染頻次較高的亞型依次為HPV33、HPV16及HPV82；CC組分布有10種亞型，感染頻次較高的亞型依次為HPV58、HPV16、HPV39、HPV52、HPV53和HPV66。

表6 HPV多重感染中的宮頸病變分布[n；構(gòu)成比(%)]

表7 HPV 3種混合感染中的宮頸病變分布[n；構(gòu)成比(%)]

3 討論

HPV多重感染表明機(jī)體免疫機(jī)制清除病毒不力，預(yù)示病情進(jìn)展，而HPV絕大部分會(huì)在半年時(shí)間內(nèi)通過(guò)自身免疫清除感染,大部分宮頸病變會(huì)在2年的時(shí)間內(nèi)消退[8]。近年來(lái)，有研究[9]報(bào)道HPV多亞型混合感染與不同程度的宮頸病變具有明顯的相關(guān)性，隨著宮頸病變程度的嚴(yán)重性升高，多亞型混合感染率呈上升現(xiàn)象(宮頸癌除外)。亦有文獻(xiàn)[7]表明隨宮頸病變程度的加重，多亞型混合感染率趨于下降，且SCC的傾向于單一HR-HPV感染。此外，盧洪勝等[10]認(rèn)為HPV多亞型感染可能會(huì)對(duì)病毒的致病力產(chǎn)生影響,并最終影響到CC病程的進(jìn)展和嚴(yán)重性。而趙紅霞等[11]認(rèn)為HPV多亞型感染與CC的發(fā)生沒(méi)有顯著相關(guān)性，HPV亞型數(shù)目與宮頸病變是否發(fā)生無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性，可能存在與病變后的病情進(jìn)展和癌病程度相關(guān)性。同樣，也有研究[12]提示HPV亞型數(shù)目與宮頸病變是否發(fā)生以及宮頸病變的嚴(yán)重程度沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián)性，而HPV基因型的致病能力與宮頸病變、宮頸病變后進(jìn)展以及癌病程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果亦顯示，344例HPV多亞型感染陽(yáng)性病人中，隨著宮頸病變程度加重，多亞型混合感染占比呈下降趨勢(shì)，且隨著HPV多重感染亞型數(shù)增加，LSIL、HSIL及CC組的多重感染占比也呈下降趨勢(shì)。研究結(jié)果說(shuō)明，HPV多重感染與不同程度的宮頸病變無(wú)明顯的相關(guān)性，與上述文獻(xiàn)[12]研究結(jié)果相似。

CC的發(fā)病年齡各國(guó)報(bào)道不一。在多數(shù)國(guó)家的女性人群中，宮頸浸潤(rùn)癌發(fā)病率在20歲以前很低,20～29 歲開(kāi)始增長(zhǎng)。我國(guó)女性CC發(fā)病率<25歲處于較低水平,25～40歲呈持續(xù)大幅度上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)城市婦女宮頸癌發(fā)病率在45歲達(dá)到頂峰后緩慢下降,農(nóng)村婦女宮頸癌發(fā)病在55歲左右出現(xiàn)峰值[12]。本研究結(jié)果亦顯示,41～50歲是HPV多重感染例數(shù)、HR亞型頻數(shù)以及宮頸病變的分布最多的年齡段。LSIL與HSIL分布隨年齡段增大而增加，在41～50歲達(dá)到最高，隨后降低；而CC分布則在51～60歲年齡段達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢(shì)。 提示41～50歲是宮頸病變的高風(fēng)險(xiǎn)年齡段，而51～60歲是宮頸癌發(fā)病的危險(xiǎn)年齡段。

HR-HPV持續(xù)感染是誘發(fā)子宮頸上皮內(nèi)瘤變的重要因素，HR-HPV持續(xù)性感染會(huì)進(jìn)展為CC[4]。有研究[13]表明HR-HPV與HR-HPV混合感染引起高級(jí)別內(nèi)瘤變的危險(xiǎn)性比高危單一亞型感染要高3倍；另有報(bào)道[14]顯示HR-HPV混合型感染時(shí)致癌風(fēng)險(xiǎn)增加，高低?；旌闲鸵约暗臀Ｐ突旌细腥緯r(shí)，增加宮頸LSIL的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究中HPV多重混合感染包括高?；旌闲?22例(正常組96例、宮頸病變組26例)、高低?；旌闲?88例(正常組176例、宮頸病變組12例)以及低?；旌闲?4例(正常組33例、宮頸病變組1例)。高危混合型與高低?；旌闲蛯m頸病變(LSIL、HSIL)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，高?；旌闲团c高低?；旌闲蛧?yán)重宮頸病變(HSIL+CC)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，本研究中39例宮頸病變病人HPV多重感染的高危亞型在不同宮頸病變組中的分布顯示感染頻次HPV52亞型在LSIL中最高，HPV33、HPV16在HSIL中分布較高，而HPV58在CC中分布最高，但各高危亞型在不同等級(jí)宮頸病組分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上，HPV多亞型混合感染與宮頸病變無(wú)明顯的相關(guān)性，隨著宮頸病變嚴(yán)重程度升高，多亞型混合感染率趨于下降。HPV感染亞型數(shù)目與宮頸病變是否發(fā)生以及宮頸病變的嚴(yán)重程度也無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性，而HPV基因型的致病能力與宮頸病變、宮頸病變后病情進(jìn)展密切相關(guān)。此外，年齡因素如41～50歲是宮頸病變的高風(fēng)險(xiǎn)年齡段，而51～60歲是CC發(fā)病的危險(xiǎn)年齡段?？紤]到本研究對(duì)象范圍的有限性，地域性差異以及HPV檢測(cè)方法學(xué)等因素的影響，有待進(jìn)一步加大研究范圍及樣本量，進(jìn)行更深入的研究。