李慧平，侯寶洲，魏思忱，穆宗瑋，李麗娟，田樹(shù)英

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是導(dǎo)致肝炎的主要原因，HBV感染與肝纖維化、肝硬化甚至肝癌發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系[1-2]。臨床診斷乙型病毒性肝炎(乙肝)及相關(guān)肝臟疾病方式較多，肝臟超聲可反映組織的形態(tài)學(xué)改變，但其通常在細(xì)胞和組織功能障礙之后才有明顯表現(xiàn)[3-4]。肝臟穿刺或者手術(shù)切除后病理檢查是疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但創(chuàng)傷性較大，不易推廣。HBV相關(guān)性肝病病人的外周循環(huán)血液中多種細(xì)胞因子異常表達(dá)，與疾病發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有強(qiáng)效誘導(dǎo)新生血管的作用，在肝臟損傷修復(fù)、纖維化形成等方面有重要作用[5]?？扇苄孕剀占っ?1(thymidine kinase-1，TK-1)被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生和臨床預(yù)后密切相關(guān)[6]。T淋巴細(xì)胞亞群是參與抗病毒的主要成分，與疾病發(fā)生和發(fā)展、抗病毒療效以及生存預(yù)后直接相關(guān)[7-8]?；诖?，本研究分析血清VEGF、TK-1和T淋巴細(xì)胞亞群與HBV相關(guān)性肝病的發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)系，為疾病診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用臨床前瞻性病例對(duì)照研究的方法，選擇2020年3月至2021年10月入我院確診乙肝病人188例，其中單純乙肝52例，肝纖維化40例，肝硬化56例，肝癌40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲；(2)符合《乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)，入院明確診斷為乙肝；(3)病人簽署研究同意書，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并丙肝、肝功能衰竭，既往肝臟外傷、手術(shù)、放化療史；(2)入院前已經(jīng)接受相關(guān)肝病藥物的治療；(3)嚴(yán)重心肺腎功能障礙、自身免疫性疾病、營(yíng)養(yǎng)代謝性疾?。?4)妊娠、哺乳期女性。另選擇30名健康體檢者作為對(duì)照組。單純乙肝組男32例，女20例，年齡36～65歲；肝纖維化組男26例，女14例，年齡39～71歲；肝硬化組男35例，女21例，年齡38～71歲；肝癌組男28例，女12例，年齡35～74歲；對(duì)照組男17名，女13名，年齡36～62歲。各組性別、年齡均有可比性。本研究取得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法 入院24 h內(nèi)采集空腹外周靜脈血12 mL于抗凝管中，2 500 r/min離心10 min分離上層血清和下層細(xì)胞沉淀，另轉(zhuǎn)移至EP抗凝管中-80 ℃保存待檢。采用PCR法檢測(cè)HBV-DNA負(fù)荷量，試劑和儀器來(lái)源于達(dá)安基因診斷中心，按說(shuō)明書進(jìn)行操作。常規(guī)生化法檢測(cè)肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)，采用德國(guó)ROCHE公司試劑和儀器進(jìn)行檢測(cè)。ELISA法檢測(cè)VEGF和TK-1水平，試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群，包括CD3+、CD4+、CD8+百分比和CD4+/CD8+，淋巴細(xì)胞亞群分析試劑購(gòu)自美國(guó)BD公司，按試劑說(shuō)明書要求操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組病人HBV-DNA負(fù)荷量及ALT、AST水平比較 單純乙肝組、肝纖維化組、肝硬化組、肝癌組HBV-DNA負(fù)荷量及ALT、AST水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 各組病人HBV-DNA負(fù)荷量及ALT、AST水平比較

2.2 各組VEGF和TK-1水平比較 肝癌組、肝硬化組、肝纖維化組、單純乙肝組、對(duì)照組VEGF和TK-1水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

表2 各組VEGF和TK-1水平比較

2.3 各組T淋巴細(xì)胞亞群比較 肝癌組、肝硬化組、肝纖維化組、單純乙肝組、對(duì)照組CD4+/CD8+水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各組CD3+、CD4+和CD8+水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 各組T淋巴細(xì)胞亞群比較

2.4 HBV相關(guān)性肝病病人血清中VEGF、TK-1、CD4+/CD8+相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示，HBV相關(guān)性肝病病人血清中VEGF與TK-1呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.745，P<0.01)，VEGF與CD4+/CD8+呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.217，P<0.01)，TK-1與CD4+/CD8+呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.208，P<0.01)。

3 討論

HBV感染呈世界性流行，全球約有2.57億慢性HBV感染者，每年死于HBV感染相關(guān)肝病的病人有88.7萬(wàn)[10]。相關(guān)研究[11-13]顯示，乙肝、肝纖維化、肝硬化和肝癌存在漸進(jìn)式發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系，及時(shí)辨別乙肝病人病情轉(zhuǎn)變進(jìn)程對(duì)改善病人生存預(yù)后有十分重要的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)血清VEGF、TK-1和CD4+/CD8+變化與HBV相關(guān)性肝病的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，可通過(guò)關(guān)注乙肝病人VEGF、TK-1和CD4+/CD8+變化情況及時(shí)對(duì)其病情發(fā)展進(jìn)行人工干預(yù)，具有一定的創(chuàng)新意義和臨床指導(dǎo)價(jià)值。

ALKHARSAH[14]指出，一些病毒被認(rèn)為是人類腫瘤和其他嚴(yán)重疾病的直接或間接病原體。致癌病毒如HBV缺乏自身的VEGF，它們依賴于在腫瘤進(jìn)展中招募宿主細(xì)胞基因進(jìn)行血管生成。MAO等[15]研究表明，乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)和VEGF在HBV相關(guān)性肝癌中廣泛表達(dá)，HBx可能通過(guò)上調(diào)VEGF促進(jìn)HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展。SUN 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子-1α/VEGF信號(hào)通路誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生。VIZIO等[17]研究還證明，VEGF-A對(duì)肝臟結(jié)構(gòu)內(nèi)的復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要，并協(xié)同血小板生成素促進(jìn)從肝硬化到肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。本研究中，通過(guò)對(duì)乙肝病人不同病情進(jìn)行分組發(fā)現(xiàn)，與健康體檢者比較，單純乙肝組、肝纖維化組、肝硬化組和肝癌組病人VEGF水平升高，且不同乙肝病情進(jìn)展病人，其VEGF水平保持肝癌組>肝硬化組>肝纖維化組>單純乙肝組變化趨勢(shì)。

WANG等[18]指出，TK-1能夠催化胸腺嘧啶核苷的初始磷酸化合成dTTP，dTTP是DNA的重要組成部分。TK-1是一種細(xì)胞溶質(zhì)酶，在細(xì)胞周期的S期具有最高水平。在癌細(xì)胞中TK-1上調(diào)，過(guò)量的TK1泄漏到血液中。因此，血清TK-1被用作癌癥診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。PAOLETTI等[19]開(kāi)展的SWOG S0226臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，激素受體陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人一線內(nèi)分泌治療中，基線高水平TK-1與較差的預(yù)后相關(guān)。在本研究中，不同乙肝病情病人，TK-1水平保持肝癌組>肝硬化組>肝纖維化組>單純乙肝組變化趨勢(shì)。許琴等[20]研究表明，乙肝病人Th1細(xì)胞因子、T 淋巴細(xì)胞亞群及特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，可監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展、病毒復(fù)制狀態(tài)和轉(zhuǎn)歸，對(duì)指導(dǎo)抗病毒治療和評(píng)價(jià)療效有重要意義。在本研究中，不同乙肝病情進(jìn)展病人，CD4+/CD8+保持肝癌組<肝硬化組<肝纖維化組<單純乙肝組變化趨勢(shì)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，單純乙肝組、肝纖維化組、肝硬化組和肝癌組病人HBV-DNA負(fù)荷量、ALT水平、AST水平、CD3+、CD4+和CD8+百分比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示單純依賴病毒學(xué)和肝功能檢測(cè)無(wú)法準(zhǔn)確判斷肝病進(jìn)程[21]。

通過(guò)對(duì)HBV相關(guān)性肝病病人血清中VEGF、TK-1和CD4+/CD8+水平進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，VEGF與TK-1呈明顯正相關(guān)關(guān)系，VEGF與CD4+/CD8+呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，TK-1與CD4+/CD8+呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示隨著肝病病人血清VEGF與TK-1表達(dá)上調(diào)、CD4+/CD8+下降，病人存在乙型肝炎向肝纖維化、肝硬化甚至肝癌轉(zhuǎn)變的可能，需及時(shí)進(jìn)行人工干預(yù)。

綜上所述，HBV相關(guān)性肝病病人血清中VEGF、TK-1和CD4+/CD8+與疾病的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，VEGF和TK-1表達(dá)升高，CD4+/CD8+下降可能參與了乙肝、肝纖維化、肝硬化和肝癌的發(fā)生與進(jìn)展。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)是篩查出與HBV相關(guān)性肝病進(jìn)展的敏感性標(biāo)志物VEGF、TK-1和CD4+/CD8+，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的HBV-DNA載量、ALT和AST水平在HBV相關(guān)性肝病中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明這些指標(biāo)對(duì)分析HBV相關(guān)性肝病進(jìn)展有一定的局限性。但是本研究無(wú)法進(jìn)一步說(shuō)明VEGF、TK-1與CD4+/CD8+變化的內(nèi)在關(guān)系，有待后續(xù)動(dòng)物模型或體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明。