李旻昊，袁 梅，夏加增，巢 琳

急危重癥胰腺炎(SAP)是臨床常見的急腹癥，其病情發(fā)展迅猛，病死率極高，且SAP常常會并發(fā)腸屏障功能受損，引起腸道菌群或內(nèi)毒素移位，造成胰腺外感染,啟動全身炎癥反應(yīng)，引起機體多器官功能障礙[1-2]。有學(xué)者[3]認(rèn)為，SAP的最重要的治療干預(yù)措施就是預(yù)防其并發(fā)癥的發(fā)生，尤其是并發(fā)的腸功能障礙。腺苷作為遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷，對全身多個系統(tǒng)都具有調(diào)節(jié)作用，腺苷及其類似物能夠擴張腸道血管，增加腸血流量，腺苷可通過受體介導(dǎo)參與腸道血管的擴張[4]。SAP并發(fā)腸屏障功能障礙主要與腸道缺血再灌注損傷有關(guān)，SAP發(fā)生時，會引起腸道血管強烈收縮，導(dǎo)致腸道血流量減少，從而導(dǎo)致腸黏膜的缺血-再灌注損傷(IRI)[5]。本研究觀察大鼠SAP腸屏障損傷時小腸組織的形態(tài)學(xué)變化，并給予腺苷干預(yù)以研究其對大鼠SAP腸屏障損傷的保護作用，進一步探討其相關(guān)的線粒體保護機制?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗用成年健康雄性SD大鼠64只(250～280 g)，購于北京大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動物實驗中心屏障實驗室。腺苷(南京春秋生物工程有限公司)，環(huán)孢素A(CsA)注射液(美國諾華公司)，?；悄懰徕c(美國Sigma公司)，糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)(Ser9) 抗體、Total-GSK-3β抗體(美國cell signaling 公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發(fā)光檢測試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。電泳儀(Invitrogen公司)；生物圖像采集系統(tǒng)(美國UVP公司)；電鏡(日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及動物模型制備 64只健康雄性Wistar大鼠，隨機分為假手術(shù)組8只、SAP組40只(分為0、3、6、12、24 h不同時間點處理組，每組8只)、腺苷處理組(Ade-Ⅳ組)8只、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)移孔(mPTP)抑制劑CsA組8只。

所有大鼠術(shù)前12 h禁食，飲水不受限。SAP組模型制備：采用腹腔內(nèi)注射戊巴比妥溶液麻醉、固定，選擇上腹正中切口入腹，找到十二指腸，輕柔地提起，用小號動脈夾分別夾在十二指腸段和肝門部胰膽管部，用一次性靜脈留置針經(jīng)十二指腸大乳頭處逆行穿刺胰膽管，穿刺成功后接注射器，緩慢注射牛黃膽酸鈉0.5 g/100 g,持續(xù)約1 min，后停留5 min，然后拔出留置針，去除動脈夾，可以觀察到，大鼠胰腺組織充血、水腫，然后將腸組織放回腹腔，分層縫合腹壁并消毒，整個手術(shù)過程要做到迅速且輕柔，然后將大鼠放入籠中，自由進食、飲水。Ade-Ⅳ組于造模成功后5 min將10 g/ L腺苷溶液(20 mg/kg)通過陰莖背靜脈給藥，CsA組于術(shù)前經(jīng)腹腔注射CsA注射液(3 mg/kg)(我們既往研究[6]發(fā)現(xiàn)，大鼠SAP在12 h時間點損傷最為嚴(yán)重，下文實驗結(jié)果中也會有提及，所以Ade-Ⅳ 及CsA組只針對12 h時間點，在這里稍加說明，以便于理解)。假手術(shù)組僅打開腹腔,翻動胰腺組織后關(guān)腹。SAP組所有大鼠在術(shù)后相應(yīng)時間點打開腹腔，找到下腔靜脈，真空負(fù)壓抽取血液并離心取血清送檢胰淀粉酶。

1.2.2 標(biāo)本的病理學(xué)觀察 取胰腺及回腸末端組織，多聚甲醛溶液固定，然后作HE染色及電鏡下觀察腸道組織的病理改變。

1.2.3 線粒體分離及Ca2+誘導(dǎo)的腫脹實驗 本實驗利用Ca2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹試驗測定各組mPTP的開放程度，CsA作為mPTP的抑制劑，只出現(xiàn)在了線粒體腫脹實驗中，進行此項實驗包含SAP、Ade-Ⅳ 及CsA三個組。首先分離大鼠腸組織細(xì)胞，用差速離心法提取腸組織細(xì)胞線粒體，采用BCA蛋白定量試劑盒分析線粒體濃度，純凈的線粒體懸浮于腫脹緩沖液中(KCl 120 mmol/L，Tris-HCl 10 mmol/L，KH2PO45 mmol/L，MOPS 20 mmol/L，4 ℃)使線粒體終濃度達到0.3 mg/mL,并接種于96孔板中，加入200 μmol/L CaC12誘導(dǎo)mPTP的開放，線粒體的腫脹程度的判定采用分光光度法測量520 nm吸光度降低的百分率來評價。

1.2.4 Werstern blotting檢測磷酸化-GSK-3β蛋白表達 采用液氮研磨大鼠小腸組織，并經(jīng)過一系列勻漿、離心、裂解等步驟提取腸組織蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定，電泳并轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，并加一抗(磷酸化-GSK-3β)4 ℃ 孵育過夜，然后二抗室溫孵育 1 h后進行ECL 熒光顯色。用總蛋白(Total-GSK-3β) 進行內(nèi)參檢測。所有膠片用掃描儀采集圖像，保存好后用Image J分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 腺苷對大鼠SAP腸屏障的影響

2.1.1 血清胰淀粉酶在不同時間點的水平變化 SAP組造模成功后，抽血送檢血清胰腺淀粉酶，發(fā)現(xiàn)0～12 h隨時間延長，SAP組40只大鼠胰淀粉酶逐漸升高，且12 h達到高峰，24 h下降至最低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表1)。

表1 血清胰淀粉酶在不同時間點的水平變化

2.1.2 胰腺和小腸組織的病理學(xué)改變 肉眼觀察：假手術(shù)組胰腺組織無明顯變化，SAP組胰腺可見片狀壞死，胰周及網(wǎng)膜出現(xiàn)點狀、塊狀皂化斑，并伴有大量血性腹水。

光鏡下觀察：SAP 組3、6 h可見胰腺間質(zhì)擴張充血，伴有少量的炎細(xì)胞浸潤，12 h胰腺小葉、胰管大面積出血壞死，分葉結(jié)構(gòu)模糊，伴有大量的炎細(xì)胞浸潤及纖維素滲出。24 h胰腺出血壞死區(qū)明顯減少，小葉纖維組織及小胰管增生明顯，表現(xiàn)出明顯的修復(fù)作用，且血清胰淀粉酶在12 h升高最為顯著，這些也都間接提示12 h損傷最為嚴(yán)重，所以我們選取12 h組給藥后進行后續(xù)觀察。與SAP組比較，Ade-Ⅳ組肉眼可見血性腹水明顯減少，胰腺充血、水腫等較SAP組減輕，有少量血性腹水，未發(fā)現(xiàn)鈣化斑。小腸蠕動良好。光鏡下觀察SAP 組可見小腸黏膜固有層充血、水腫，柱狀上皮細(xì)胞壞死脫落，絨毛增粗水腫，排列紊亂，部分絨毛出現(xiàn)斷裂、缺損;與SAP 組比較，Ade-Ⅳ組光鏡下腸黏膜上皮及絨毛形態(tài)基本完整，絨毛排列基本整齊(見圖 1～3)。

2.1.3 腺苷對小腸組織超微結(jié)構(gòu)的影響 大鼠SAP造成了小腸組織的線粒體損傷，主要為線粒體腫脹，部分出現(xiàn)空泡變性，而腺苷組可見線粒體腫脹減輕，空泡變性減少，線粒體損傷較前者明顯減輕(見圖4)。

2.2 腺苷對mPTP開放的影響 線粒體520 nm處的吸光度為CsA組

表2 腺苷對mPTP開放的影響

2.3 腺苷對GSK-3β磷酸化的影響 與SAP組(4637.75±193.42)比較，Ade-Ⅳ組P-GSK-3β(10 128.88±591.82)的表達明顯增加(t=24.95，P<0.01)。

3 討論

腸屏障指的是腸道上皮具有分隔腸腔內(nèi)物質(zhì)，防止致病性物質(zhì)，如細(xì)菌和毒素等侵入的功能。研究[7]發(fā)現(xiàn)，在大鼠腸道缺血早期，腸黏膜缺血、缺氧會引起大量酸性代謝產(chǎn)物堆積，導(dǎo)致細(xì)胞代謝障礙。SAP常常會導(dǎo)致腸屏障功能受損，從而啟動全身炎癥反應(yīng)，誘發(fā)多器官功能障礙綜合征的發(fā)生。

一些中藥制劑等能夠明顯減輕SAP并發(fā)的腸黏膜損傷[8-10]，不僅如此，腺苷作為人體細(xì)胞普遍存在的內(nèi)源性核苷，可通過擴張腸黏膜血管從而發(fā)揮腸道保護作用[11]。但是這些藥物發(fā)揮腸道保護作用的具體細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制仍不是很清楚，尤其是關(guān)于線粒體保護途徑的研究更是甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，在給予腺苷預(yù)處理后，肉眼觀察，大鼠血性腹水減少，小腸組織充血水腫明顯減輕，腸蠕動良好，光鏡下，小腸黏膜上皮及絨毛形態(tài)相對完整，排列基本整齊，與假手術(shù)組比較有明顯差別，說明腺苷能夠改善腸屏障功能，減輕SAP并發(fā)的腸損傷。

在正常生理條件下，mPTP呈關(guān)閉狀態(tài)，但是當(dāng)機體處于應(yīng)激條件下(如缺血缺氧、鈣超載、氧化應(yīng)激損傷等)，mPTP會開放，這時某些離子和代謝產(chǎn)物就會進入線粒體內(nèi)，從而破壞線粒體的結(jié)構(gòu)而引起線粒體的壞死或凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞的功能障礙。本研究電鏡結(jié)果顯示，腺苷能夠減輕腸黏膜線粒體的腫脹、空泡化，證實腺苷的腸黏膜保護作用與線粒體有關(guān)。不僅如此，腺苷還能夠模擬mPTP抑制劑CsA，顯著抑制 Ca2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹，進一步說明腺苷可通過抑制mPTP開放，從而發(fā)揮腸屏障的保護作用。

GSK-3β是一種多功能的絲/蘇氨酸類激酶，該酶參與了多條細(xì)胞信號通路，對細(xì)胞增殖、分化及凋亡，腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等過程發(fā)揮重要作用[12-13]。與大多數(shù)蛋白激酶不同的是，GSK-3β受兩個不同位點磷酸化的調(diào)節(jié)，Tyr216 磷酸化使 GSK-3β活性增高，相反，Ser9磷酸化使GSK-3β活性降低[14]。GSK-3β Ser9位點的磷酸化表達增加，能夠阻止mPTP的開放，從而發(fā)揮線粒體的保護作用[15]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，腺苷能夠使GSK-3β Ser9的磷酸化表達明顯增加，提示抑制GSK-3β活性，阻止mPTP開放，是腺苷發(fā)揮腸道保護作用的機制之一。