徐衛(wèi)強(qiáng)，關(guān) 翰，陳志軍

前列腺癌長(zhǎng)期以來(lái)一直是美國(guó)男性最常見的腫瘤之一，目前是僅次于肺癌的第二大癌癥相關(guān)死亡類的腫瘤[1]。在評(píng)估的世界范圍內(nèi)前列腺癌的死亡數(shù)與中國(guó)的前列腺癌死亡數(shù)分別為位列第五位和第十位[2]，亞洲人群中前列腺癌的發(fā)病率低于西方人群。但是，近年來(lái)中國(guó)的發(fā)病率和死亡率迅速增長(zhǎng)，發(fā)病率的急劇上升導(dǎo)致每年25 000人死亡，5年生存率約54%[3-4]。因此，探究新的腫瘤形成的分子機(jī)制對(duì)前列腺癌的診斷、治療及預(yù)后是十分迫切的。微小RNA(microRNA，miR)是一種非編碼基因，它是通過(guò)靶向信使RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的互補(bǔ)修飾進(jìn)而影響基因的表達(dá)水平[5]。miR的表達(dá)在人類癌癥中廣泛失調(diào)，表明了其在癌癥的發(fā)生、進(jìn)展和治療耐藥中發(fā)揮著潛在的作用[6]。已經(jīng)有研究表明miR-107能夠促進(jìn)結(jié)腸癌和胃癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮著原癌基因的作用[7-8]，然而miR-107在宮頸癌、胰腺癌和乳腺癌的形成中卻發(fā)揮著抑癌基因的角色[9-11]。本研究的目的是探討miR-107在前列腺癌中的功能和明確其調(diào)控的靶基因，為前列腺癌的發(fā)生和潛在機(jī)制提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 本研究使用ATCC細(xì)胞庫(kù)(Manassas,VA,USA)的人前列腺癌細(xì)胞株(PC3和LNCaP)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和100單位/毫升青霉素-鏈霉素抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中并放置在37 ℃含5%二氧化碳和95%空氣的加濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)使用成熟的miR樣本:由GenePharma公司(中國(guó)·上海)合成Hsa-miR-107模擬物(miR-107)和陰性對(duì)照(miR-NC)，轉(zhuǎn)染過(guò)程使用Lipo2000和Opti-MEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染效率通過(guò)熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)檢測(cè)。

1.2 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的前列腺癌細(xì)胞(500個(gè)/孔)種植到6孔板中，3～4 d進(jìn)行細(xì)胞換液，在細(xì)胞培養(yǎng)8～12 d后，觀察陽(yáng)性克隆團(tuán)塊形成(>50細(xì)胞/團(tuán)塊)后甲醇固定15 min，然后用結(jié)晶紫進(jìn)行染色20 min后拍照。

1.3 劃痕及侵襲實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞漸漸融合鋪滿后，使用10 μL的槍頭和移液槍在標(biāo)尺定位后進(jìn)行細(xì)胞劃痕。然后用PBS沖洗2次，去除脫落細(xì)胞，分別于0 h、24 h在倒置顯微鏡下拍照(40×)，劃痕后的細(xì)胞培養(yǎng)在含2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞遷移(細(xì)胞傷口愈合率)是通過(guò)計(jì)算傷口邊緣距離的變化來(lái)評(píng)估。侵襲實(shí)驗(yàn)是使用Transwell小室在24孔板中進(jìn)行，在小室的基底膜上層加入均勻的基質(zhì)膠。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞(5×104個(gè)/孔)種植于小室上層，24 h后用棉簽輕柔去除上層非侵襲性細(xì)胞后，用甲醇固定小室下層侵襲的細(xì)胞15 min，然后用結(jié)晶紫染色20 min。在活細(xì)胞工作站高倍顯微鏡下(200×)，記錄每個(gè)小室中5個(gè)不同區(qū)域視野的侵襲染色后的細(xì)胞。

1.4 生物信息學(xué)靶基因預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 用TargetScan(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-107的潛在靶基因，最終本研究選擇了TPD52作為靶基因。在24孔板中利用Lipofectamine 2000進(jìn)行前列腺癌細(xì)胞LNCaP和PC3的miR-107模擬物及陰性對(duì)照片段的轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染含有TPD52野生型和突變型的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，在生長(zhǎng)24 h細(xì)胞融合達(dá)到80%后獲取蛋白質(zhì)，加入熒光底物，測(cè)定熒光素酶的活性。計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度，并比較轉(zhuǎn)染了miR-107模擬物及陰性對(duì)照組之間的熒光素酶活性變化。

1.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 48 h后從轉(zhuǎn)染的LNCaP和PC3細(xì)胞中提取蛋白并進(jìn)行BCA蛋白濃度測(cè)定。上樣緩沖液(5×)與蛋白按照1∶4進(jìn)行混勻后在沸水浴中5 min使蛋白質(zhì)變性。使用碧云天公司生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配置10%的分離膠，電泳時(shí)的電壓設(shè)置為80 V運(yùn)行約30 min后觀察彩色蛋白分子量標(biāo)志物的條帶分離后將電壓調(diào)增至110 V。轉(zhuǎn)PVDF膜時(shí)電流設(shè)置為200 mA運(yùn)行90～120 min。封閉使用5%的脫脂奶粉，搖床2～3 h。孵育一抗使用的抗體分為：內(nèi)參-小鼠來(lái)源的β-actin(1-1 000,AA128，碧云天公司)，目的-兔來(lái)源的TPD52(1∶10 000,EPR14220,Abcam公司)。孵育二抗使用的抗體有：羊抗小鼠(1∶1 000,A0216，碧云天公司)，羊抗兔(1∶10 000,BL003A，biosharp公司)。最后使用Bio-Rad公司的曝光儀進(jìn)行條帶發(fā)光顯影。

1.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后使用玻片在六孔板內(nèi)均勻布孔，使細(xì)胞密度在50%～70%后按照各試劑廠家說(shuō)明書進(jìn)行固定，透膜和封閉。然后輕柔地取出玻片至于載玻片上并進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)記，將目的抗體兔來(lái)源的TPD52(EPR14220,Abcam公司)按照合適的比例(1∶200)進(jìn)行稀釋后均勻地滴加到玻片上，輕柔地放入濕盒，過(guò)夜保存。次日，水浴鍋37℃孵育熒光二抗(羊抗兔-Dylight 594，A23420，Abbkine公司)30 min，使用比例為1∶200。然后用Hoechst 33342(C1022，碧云天公司)室溫10 min，進(jìn)行細(xì)胞核染色標(biāo)記。最后用活細(xì)胞工作站在高倍鏡頭下(200×)進(jìn)行熒光拍照，每張玻片隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 miR-107的轉(zhuǎn)染效率評(píng)估及miR-107抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力 本研究瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)熒光標(biāo)記的siRNA(FAM-siRNA)檢測(cè)后顯示miR-107的轉(zhuǎn)染效率高于90%(見圖1，綠色熒光細(xì)胞占比>90%)。劃痕與侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-107組與miR-NC組對(duì)前列腺癌細(xì)胞(LNCaP和PC3)的傷口愈合和侵襲能力的影響顯示，miR-107組的傷口愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)目小于miR-NC組(P<0.01)(見圖2、3及表1)。

表1 miR-107組與miR-NC組對(duì)前列腺癌細(xì)胞的傷口愈合與侵襲能力比較

2.2 miR-107抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)顯示，miR-107組前列腺癌細(xì)胞的增殖能力小于miR-NC組(P<0.01)(見表2、圖4)。

表2 miR-107組與miR-NC組對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖能力變化

2.3 miR-107與TPD52特異性結(jié)合并抑制TPD52的表達(dá) 利用生物信息學(xué)分析軟件TargetScan顯示miR-107與TPD52的結(jié)合位點(diǎn)(見圖5)，在TPD52野生型(WT)組中miR-107組的熒光素酶活性明顯低于miR-NC組(P<0.01)，而在TPD52突變型(MUT)組中2組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，miR-107組的TPD52表達(dá)明顯小于miR-NC組(P<0.01)(見表3及圖6、7)。

表3 miR-107組與miR-NC組的熒光素酶活性及TPD52表達(dá)量變化

3 討論

miR作為研究熱點(diǎn)，其在前列腺癌中的調(diào)節(jié)機(jī)制已經(jīng)被廣泛報(bào)道，近年來(lái)仍有許多高分文獻(xiàn)發(fā)表，如miR-346和長(zhǎng)鏈非編碼RNA NORAD可互相作用來(lái)平衡調(diào)節(jié)前列腺癌中的DNA損傷和修復(fù)，在晚期前列腺癌和轉(zhuǎn)錄過(guò)度活躍的癌細(xì)胞中若NORAD顯著減少，miR-346可作為特效治療劑[12]；環(huán)狀RNA 0003258通過(guò)與IGF2BP3和海綿吸附miR-653-5p復(fù)合物促進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移[13]；miR-26a通過(guò)靶向SHC4、PFDN4和CHORDC1調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的胞外囊泡分泌[14]。以上研究均表明miR未來(lái)有很大的潛力成為前列腺癌的治療新方向。本研究中為探究miR-107在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用，采用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-107模擬物，使其在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，為驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染帶FAM熒光的miR-NC，并使用熒光顯微鏡觀察，確保轉(zhuǎn)染效率>90%后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)了miR-107過(guò)表達(dá)后可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，初步考慮其在前列腺癌中發(fā)揮抑癌功能。此外，因miRNA并不直接發(fā)揮功能，作用方式為靶向結(jié)合下游mRNA的3′UTR區(qū)，通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件結(jié)合參考文獻(xiàn)，考慮TPD52可能為miR-107的靶基因，通過(guò)Western blotting及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證miR-107直接靶向作用TPD52并呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，過(guò)表達(dá)miR-107后顯著降低了TPD52在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。

在人類許多腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，都涉及miR-107的異常表達(dá)。如miR-107通過(guò)靶向HIF-1β抑制尤文氏肉瘤細(xì)胞的增殖[15]，miR-107在人食管鱗癌中靶向Cdc42起抑癌作用[16]，miR-107通過(guò)靶向HMGB1抑制乳腺癌細(xì)胞的自噬、增殖和遷移[17]，miR-107抑制膠質(zhì)瘤的血管生成和VEGF表達(dá)[18]。這些研究均證實(shí)了miR-107結(jié)合不同的靶基因在不同類型腫瘤中發(fā)揮著相應(yīng)的功能。然而，目前還鮮有研究發(fā)現(xiàn)miR-107直接與TPD52結(jié)合并抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究結(jié)果則表明了miR-107的上調(diào)削弱了TPD52的表達(dá)，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，本研究表明miR-107在前列腺癌中通過(guò)靶向TPD52抑制細(xì)胞的增殖和侵襲。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)的miR-107與TPD52的負(fù)反饋關(guān)系，可能成為前列腺癌的新的監(jiān)測(cè)和治療靶點(diǎn)。此外，進(jìn)一步利用活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究miR-107在體內(nèi)對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響將是必要的，仍需進(jìn)一步研究。