江從軍，周艷梅

銀屑病是一種常見的慢性皮膚病，除了累及皮膚外，合并癥的風險也很高，包括銀屑病關節(jié)炎、克羅恩病、惡性腫瘤、肥胖癥和心血管疾病，對病人的生活質(zhì)量造成重大影響[1]。雖然銀屑病的發(fā)病機制仍未完全闡明，但Th17細胞已被認為在銀屑病免疫炎癥中起關鍵作用[2]；相反，調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)主要負責抑制免疫炎癥反應，其數(shù)量和功能缺陷也參與銀屑病的發(fā)病[3-4]。雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)近年來備受關注，具有強大的藥用價值，其對自身免疫性疾病和腫瘤的治療具有強效作用，且無明顯不良反應[5]。DHA抑制MRL/lpr狼瘡小鼠脾細胞中Toll樣受體4信號轉導通路的激活和Ⅰ型干擾素和抗ds-DNA的產(chǎn)生，以改善狼瘡性腎炎的病理損傷[6]。DHA通過調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶點(mammalian marget of rapamycin,mTOR)途徑下調(diào)Th17細胞，上調(diào)Treg細胞，從而抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE) 的發(fā)生[7]。此外，DHA衍生物DC32通過抑制 IL-6 恢復Th17/Treg平衡，從而抑制類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA) 滑膜炎中的免疫系統(tǒng)失衡和淋巴細胞浸潤[8]。然而，DHA對銀屑病的作用鮮有報道。基于以上研究，我們推測DHA對銀屑病具有治療作用，并基于Th17/Treg平衡角度初步探討DHA調(diào)控銀屑病的作用機制，為銀屑病提供新的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/c小鼠(雌性，18～20 g，6～8 周齡)購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司；咪喹莫特(imiquimod,IMQ)乳膏(H20030129)購自四川明欣藥業(yè)有限公司；DHA(71939-50-9)、羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethyl cellulos，CMC-Na)(9004-32-4)購自MCE公司，PMA/Ionomycin Mixture(CS1001)、BFA/Monensin Mixture(CS1002)購自聯(lián)科生物技術有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；流氏細胞術所需抗體PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 Antibody(100220)、FITC anti-mouse CD4 Antibody(100406)、APC anti-mouse CD25 Antibody(101910)、PE anti-mouse FOXP3 Antibody(126404)、PE anti-mouse IL-17A Antibody(506904)購于美國Biolegend公司；anti-Ki67 Antibody (ab16667)購自ABcam公司；小鼠淋巴細胞分離液及ELISA試劑盒購自于深圳達科為生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及藥物干預 將24只雌性BALB/c小鼠隨機分為4組，每組6只：空白對照組(Control 組)、模型組(Model組)、25 mg/kg DHA治療組(DHA-L組)、50 mg/kg DHA治療組(DHA-H組)。所有小鼠用剃須刀剔除背部毛發(fā)(2 cm×3 cm)，然后用脫毛膏進一步去除殘余毛發(fā)，飼養(yǎng)1 d后開始造模，Model組和DHA治療組每天脫毛區(qū)域給予62.5 mgIMQ外涂，Control組給予等量的白凡士林外涂。DHA溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，分別配成終濃度為2.5 mg/mL和5 mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，以防沉淀。各組小鼠均灌胃給藥，外涂IMQ或凡士林前1 h給藥，每只小鼠灌胃體積為10 mL·kg-1·d-1，Control組和Model組灌胃相應體積的0.5%CMC-Na溶液，連續(xù)給藥6 d。參照銀屑病面積嚴重程度指數(shù)(psoriasis area severity index,PASI)對鱗屑、紅斑和皮膚厚度進行評分[9]，計算PASI累積評分，以反映皮損的嚴重程度，評分范圍為0～12分。在連續(xù)6 d DHA治療后的第7天實驗結束時，對所有動物腹腔注射巴比妥麻醉，眼眶采血后脫頸椎處死。

1.2.2 HE染色觀察皮膚病理改變 用眼科剪小心獲取小鼠皮膚，制成石蠟切片，常規(guī)HE染色。使用Olympus顯微鏡觀察拍照，測量表皮厚度，并采用銀屑病病理(Baker)評分系統(tǒng)進行評分[10]。

1.2.3 免疫組織化學染色Ki67觀察表皮增生情況 首先用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)緩沖液修復皮膚組織石蠟切片，并在3%過氧化氫溶液中孵育；切片與一抗anti-Ki67 Antibody在4 ℃的潮濕室中孵育過夜；沖洗后，切片與二抗(HRP-山羊抗兔IgG)孵育1 h，然后二氨基聯(lián)苯胺顯色。為了定量分析Ki67陽性細胞，每張切片在光學顯微鏡視野下使用Olympus顯微鏡隨機取每個樣品的3個區(qū)域進行拍照，使用ImagePro Plus 6軟件計數(shù)表皮基底層Ki67陽性細胞的數(shù)量(不計數(shù)毛囊中的Ki67陽性細胞)。

1.2.4 流式細胞術檢測Th17細胞和Treg細胞比例 采用小鼠淋巴細胞分離液分離獲取脾淋巴細胞。取1×106個脾淋巴細胞用于Treg細胞檢測；另取1×106個脾淋巴細胞加入24孔版中，每孔體積約1 mL，分別加入PMA/Ionomycin Mixture和BFA/Monensin Mixture各4 μL，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，用于Th17細胞檢測。之后進行小鼠脾淋巴細胞染色，按照說明書先加入PE/Cyanine7 anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4和APC anti-mouse CD25抗體進行表面染色，固定破膜后加入PE anti-mouse IL-17A 或PE anti-mouse FOXP3抗體進行細胞內(nèi)染色，上機檢測后使用 FlowJo 10軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 ELISA檢測血清細胞因子 小鼠麻醉后摘取眼球取血，室溫靜置30 min后，4 ℃、2 000 r/min離心獲取血清。血清IL-17A和TNF-α通過商品化ELISA試劑盒測定。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 各組小鼠6 d后PASI評分比較 Control組小鼠皮膚外觀正常，Model組小鼠出現(xiàn)紅斑、鱗屑和皮膚增厚，DHA治療后皮損改善(見圖1)；治療6 d后，DHA-L和DHA-H組的評分均明顯低于未用DHA的Model組(P<0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠6d后PASI評分比較

2.2 各組小鼠組織病理學表現(xiàn)及表皮厚度、Baker評分及表皮Ki67陽性細胞數(shù)比較 組織病理學分析顯示，與Control組相比，Model組小鼠的表皮增厚、角化過度、表皮突延長、毛細血管擴張和充血以及細胞浸潤明顯增多。與Model組小鼠相比，接受DHA治療的小鼠皮膚病理逐漸恢復，表皮厚度和Baker評分下降(P<0.05)；此外，免疫組織化學染色顯示，與 Model組小鼠相比，DHA-L組和DHA-H組表皮Ki67陽性細胞均減少(P<0.05)(見圖2、表2)。

表2 各組小鼠表皮厚度、Baker評分及表皮Ki67陽性細胞數(shù)比較

2.3 各組小鼠脾Th17 細胞和Treg細胞比例比較 與Control組相比，Model組小鼠脾Th17細胞比例升高(P<0.05)，DHA治療降低了Th17細胞比例，DHA-L和DHA-H組均較Model組降低(P<0.05)；與Model組相比，DHA-L組和DHA-H組小鼠脾Treg細胞比例升高(P<0.05)(見表3)。

表3 各組小鼠脾Th17 細胞和Treg細胞比例比較

2.4 各組小鼠血清IL-17A和TNF-α水平比較 與Control組相比，Model組血清IL-17A和TNF-α水平均升高(P<0.05)；與Model組相比，DHA-L組和DHA-H組血清IL-17A水平均降低(P<0.05)，而DHA-H組血清TNF-α水平降低(P<0.05)(見表4)。

表4 各組小鼠血清IL-17A和TNF-α水平比較

3 討論

銀屑病是一種常見的慢性皮膚病，確切病因仍未完全了解，但有證據(jù)表明它是一種自身免疫性疾病[11]。銀屑病的傳統(tǒng)治療主要包括免疫抑制劑，如甲氨蝶呤和環(huán)孢素。然而，傳統(tǒng)的免疫抑制藥物可能會引起各種不良反應，包括腎毒性、腫瘤和感染[12]。最近，生物治療包括抑制IL-17和其他促炎細胞因子的抗體，已被證明比傳統(tǒng)的免疫抑制劑更有效[13]。不幸的是，它們也比傳統(tǒng)藥物貴得多,而且也存在較高的感染風險[14-15]。因此，需要尋求一種有效、安全且廉價的藥物來治療這種慢性皮膚炎癥。青蒿素是一種從中草藥青蒿中分離出的活性成分，幾十年來一直用于治療瘧疾。由于青蒿素的溶解性差和半衰期短，研究人員開發(fā)了其具有更好生物利用度的衍生物。DHA是青蒿素的衍生物，比青蒿素具有更好的生物利用度[16]，在實驗動物模型中已證實對腦脊髓炎、甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等炎癥性疾病具有免疫抑制作用[7,17-18]。盡管DHA改善自身免疫性疾病的機制在很大程度上仍然未知，但現(xiàn)有的研究表明其作用機制主要包括抑制氧化應激和NF-κB炎癥通路以及通過調(diào)控 mTOR 信號轉導調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡[7,16,19]。本研究首次證明DHA可以通過調(diào)節(jié)Th17/Treg 平衡改善IMQ誘導的銀屑病小鼠皮損。

本研究中，為了確定DHA是否會改善銀屑病小鼠皮膚炎癥，我們建立了IMQ誘導的銀屑病小鼠模型。未涂抹IMQ的對照小鼠皮膚正常，沒有任何炎癥或病變跡象，而模型組小鼠皮膚表現(xiàn)出與銀屑病外觀高度相似的紅斑、鱗屑和皮膚增厚跡象，皮膚組織病理也與銀屑病組織病理學特征相一致，而這些特征在正常對照組小鼠中沒有出現(xiàn)。用低劑量或高劑量DHA治療均可減輕皮膚病變的嚴重程度，減少紅斑、鱗屑和皮膚厚度，組織病理角化過度和角化不全減少，表皮厚度變薄，與CHEN等報道結果一致[20]。角質(zhì)形成細胞的增生和分化異常是銀屑病的重要病理改變。因為Ki67在細胞周期進展的所有活躍階段都表達，但在靜息階段(G0)不表達，它經(jīng)常被用作細胞增殖的標志。為了確定DHA是否可以改善角質(zhì)形成細胞的過度增殖，采用免疫組織化學染色的方法檢測小鼠表皮Ki67蛋白表達水平。結果表明，DHA治療可以明顯減少小鼠表皮中Ki67陽性細胞數(shù)，證明DHA確實可以通過抑制角質(zhì)形成細胞的增殖達到治療銀屑病的作用。

已經(jīng)證實DHA可以通過調(diào)節(jié)Th17細胞及其相關細胞因子的產(chǎn)生從而防止EAE的發(fā)生[9]。Th17細胞參與了IMQ誘導的銀屑病小鼠皮損的形成，為了評估DHA 治療是否影響銀屑病中的Th17細胞，本研究檢測了DHA治療前后銀屑病小鼠脾Th17細胞比例，發(fā)現(xiàn)DHA治療能降低銀屑病小鼠脾臟中Th17細胞的比例。這些發(fā)現(xiàn)表明DHA確實抑制了銀屑病小鼠Th17細胞的生成，與LIU等的研究結果相一致[21]。與Th17細胞的促炎作用不同，Treg細胞具有抗炎作用，其數(shù)量或功能異常導致不能有效抑制炎癥[22],通過恢復其數(shù)量或功能有望發(fā)揮抗銀屑病的作用，常見的免疫抑制劑甲氨蝶呤已被證明有此作用[23]。 Treg細胞在IMQ誘導的銀屑病小鼠模型中同樣發(fā)揮重要的作用，其可以通過抑制γδT細胞以及IL-17A和TNF-α來發(fā)揮抗銀屑病的作用，去除Treg細胞明顯加重了銀屑病小鼠的癥狀[24]。因此，我們探討了DHA是否會通過上調(diào)Treg細胞來發(fā)揮其對銀屑病的治療作用。我們通過流式細胞術分析檢測了小鼠脾臟中Treg細胞比例，發(fā)現(xiàn)DHA增加脾臟中Treg細胞的比例。研究[25]發(fā)現(xiàn)，DHA在炎癥性腸病小鼠模型中可以通過上調(diào)Treg細胞發(fā)揮抗炎作用。因此，在我們的研究中，DHA通過增加Treg細胞數(shù)量來減輕銀屑病皮膚損傷和炎癥也很正常。DHA促進Treg細胞生成的確切機制仍有待未來研究確定,先前的研究表明，DHA可能通過抑制mTOR信號轉導誘導Treg細胞的表達[7]；DHA也有可能通過抑制促炎細胞因子的表達來維持 Treg細胞的數(shù)量，因為一些促炎細胞因子，如 IL-6，會影響FOXP3 的表達[8]。本研究沒有對其機制做進一步的研究，這也是筆者未來將要研究的內(nèi)容?？傊覀兊难芯拷Y果首次證明，DHA不僅可以抑制Th17細胞，也可以通過上調(diào)Treg 細胞的途徑，達到治療銀屑病皮損的目的。

IL-23/Th17 通路是銀屑病發(fā)病機制的關鍵軸，IL-17A 是該通路的主要效應物，IL-17A 的過度表達會導致表皮過度增生和強烈的炎癥反應，從而導致銀屑病皮疹和全身炎癥，靶向抗IL-17A療法已證明可有效治療銀屑病[26]。LIU等[21]研究發(fā)現(xiàn)，DHA可以降低銀屑病小鼠皮膚炎癥因子IL-17A、IL-23的表達，也可以降低小鼠脾臟Th17細胞的數(shù)量，認為DHA可以通過調(diào)控IL-23/TH17軸減輕銀屑病小鼠的皮損。本研究在此基礎上，進一步檢測DHA治療后銀屑病小鼠血清IL-17A的表達，發(fā)現(xiàn)血清中的IL-17A也是降低的。TNF-α也是銀屑病發(fā)病機制中重要的炎癥因子，針對TNF-α的生物制劑在銀屑病的治療中取得了非常好的療效[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，DHA也可以通過抑制血清中的TNF-α的水平來發(fā)揮治療銀屑病的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DHA通過改善銀屑病小鼠皮損、抑制表皮增生、抑制促炎細胞因子如IL-17A和TNF-α的表達，對銀屑病發(fā)揮有效的抗炎和治療作用。本研究還發(fā)現(xiàn)DHA可以增加IMQ誘導的銀屑病小鼠脾臟Treg細胞的數(shù)量，同時降低銀屑病小鼠脾臟Th17 細胞的數(shù)量。本研究為DHA治療銀屑病提供了實驗依據(jù)。