李 娟，徐家新，王 春，邵 晨，周路路

非酒精性脂肪肝(NAFLD)與胰島素抵抗、糖尿病、代謝綜合征和心血管疾病發(fā)病密切有關(guān)[1]，嚴(yán)重時(shí)可能發(fā)展為肝硬化、肝癌。生活方式干預(yù)為治療的首選，目前仍缺乏較為有效的治療藥物。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一種由小腸L細(xì)胞分泌的具有刺激胰島素分泌功能的激素，能調(diào)節(jié)食物攝入、胃腸蠕動(dòng)、體液穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)代謝，刺激細(xì)胞增殖，減少炎癥和細(xì)胞凋亡[2]。利拉魯肽(LG)是GLP-1的類似物，2009年首次獲得許可用于肥胖2型糖尿病(T2DM)病人的血糖控制。LG具有抑制中樞食欲、延遲胃排空時(shí)間和誘導(dǎo)劑量依賴性體質(zhì)量減輕的特性，以往的研究表明LG可以通過(guò)非減肥的方式減輕高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)積聚[3]。LG成為NAFLD病人考慮的一種有希望的治療選擇，然而，LG對(duì)NAFLD影響的機(jī)制尚不清楚。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)節(jié)自噬的主要通路[4]，激活A(yù)MPK / mTOR通路調(diào)控自噬是一種重要的保護(hù)機(jī)制[5]。研究[6]表明，LG可以減輕肝臟脂肪變性，減少氧化應(yīng)激，并激活自噬。LG除了改善T2DM和NAFLD病人的血糖控制外，還能降低體質(zhì)量、肝內(nèi)脂肪和內(nèi)臟脂肪含量[7]。本研究基于AMPK/mTOR通路探討LG在肝細(xì)胞脂肪變性的影響，觀察自噬調(diào)節(jié)蛋白的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 LG為諾和諾德(中國(guó)制藥有限公司生產(chǎn)；AMPK抑制劑(Compound C)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；免疫染色固定液、一抗、二抗、RIPA 裂解液、Western 轉(zhuǎn)膜液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒和SDS-PAGE電泳液均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；PBS緩沖液購(gòu)于以色列BI生物公司；胎牛血清購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)于美國(guó)貝克曼公司；普通顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司；熒光顯微鏡購(gòu)于日本OLYMPUS公司；組織包埋機(jī)(EG11508)、石蠟切片機(jī)(RM2135)購(gòu)于德國(guó)Leica公司；Western blotting用電泳槽(DYCZ-24DN)、轉(zhuǎn)移電泳儀(DYCZ-24DN)及恒溫循環(huán)器(WD-9412A)、制冰機(jī)(SIM-F124)均購(gòu)于北京六一生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

1.2.1 動(dòng)物分組 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠30只，購(gòu)于北京維通利華有限公司，7～8周齡，體質(zhì)量(25.2±3.5)g。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)、模型組(n=10)和LG組(n=10)，后2組應(yīng)用高脂飼料(脂肪56.0%、蛋白質(zhì)7.0%、糖類37.0%)喂養(yǎng)建立肝脂肪變性模型，對(duì)照組應(yīng)用普通飼料(脂肪10.2%、蛋白質(zhì)23.3%、糖類66.5%)喂養(yǎng)。12周后，LG組應(yīng)用LG腹腔注射0.6 mg·kg-1·d-1，其他2組應(yīng)用等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)用藥4周。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 應(yīng)用含0.3 mmol/L棕櫚酸(PA)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h誘導(dǎo)建立HepG2肝細(xì)胞脂肪變性模型后，將細(xì)胞等量分為模型組(PA)、LG組(PA+LG)和AMPK抑制劑組(PA+LG+Compound C)。LG組加入100 nmol/L LG，AMPK抑制劑組加入100 nmol/L LG和Compound C 20 μmol/L。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 血清生化檢測(cè) 小鼠禁食、禁水12 h，10%水合氯酸麻醉后，摘取雙眼球取血，3 000 r/min離心25 min，于-80 ℃保存。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、低密度脂蛋白(LDL)、膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)。

1.3.2 HE染色 石蠟切片，常規(guī)脫蠟。蘇木精染色、浸洗、1%鹽酸與乙醇混合溶液浸泡、流水沖洗返藍(lán)、蒸餾水過(guò)洗、5%伊紅染色，最后脫水、透明、封片。顯微鏡觀察肝細(xì)胞組織形態(tài)和脂肪變性。

1.3.3 油紅O染色 冰凍切片，蒸餾水充分洗滌，油紅O染色10 min。乙醇分化，蒸餾水洗1～2 s，蘇木素復(fù)染核，蒸餾水洗1～2 s，封片。顯微鏡觀察肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的情況。

1.3.4 Western blotting方法檢測(cè)p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Beclin1的蛋白表達(dá) 提取肝臟總蛋白后，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。按照比例加入5×電泳加樣緩沖液并置于沸水浴中10 min。按每孔30 μg蛋白量上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠80 V/40 min，分離膠110 V/60 min)，結(jié)束電泳后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDG膜(300 mA)，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗4 ℃過(guò)夜，洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h洗膜，應(yīng)用ECL試劑盒顯影，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 免疫熒光法檢測(cè)LC3B的表達(dá) 將貼壁的HepG2細(xì)胞胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，將無(wú)菌細(xì)胞爬片放置于六孔板底部后滴加500 μL細(xì)胞懸液，置于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h使HepG2細(xì)胞貼于細(xì)胞爬片上；每孔加1 200 μL 2%FBS培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育8 h。爬片后，雙氧水孵育30 min，含有Tween-20的3%牛血清白蛋白/ PBS 緩沖液封閉2 h，一抗過(guò)夜孵育，再用 PBS 緩沖液清洗2次。二抗孵育 30 min，用PBS 緩沖液清洗2次，再用 1 μg/mL DAPI 復(fù)染。所有的操作步驟都在室溫下進(jìn)行。在100×的油鏡下使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.4.2 Western blotting方法檢測(cè)p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Beclin1蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，按照1.3.4的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)HepG2細(xì)胞p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Beclin1的蛋白表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 血清生化結(jié)果 結(jié)果顯示，3組之間總體均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中模型組與對(duì)照組比較，小鼠血清ALT、AST、LDL、TC、TG升高;LG組與模型組相比，血清ALT、AST、LDL、TC、TG下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)(見(jiàn)表1)。

表1 各組小鼠ALT、AST、LDL、TC、TG比較

2.1.2 HE染色結(jié)果 結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列規(guī)則、細(xì)胞核清晰、細(xì)胞質(zhì)均勻、基本無(wú)脂肪變性，模型組肝細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞膨脹、可見(jiàn)大量脂肪空泡形成，LG組較模型組相比，肝細(xì)胞排列較其整齊，脂肪空泡明顯減少。說(shuō)明LG能改善肝細(xì)胞脂肪變性(見(jiàn)圖1)。

2.1.3 油紅O染色結(jié)果 結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝組織細(xì)胞中偶見(jiàn)橘黃色脂滴，高脂喂養(yǎng)后模型組小鼠肝組織細(xì)胞可見(jiàn)大量橘黃色脂滴，融合成片，而LG干預(yù)后脂滴含量明顯減少(見(jiàn)圖2)。

2.1.4 Western blotting檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組p-AMPK、LC3B、Beclin1的蛋白表達(dá)下降，p-mTOR表達(dá)升高；而LG組與模型組相比，p-AMPK、LC3B、Beclin1的蛋白表達(dá)水平均升高，p-mTOR表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)(見(jiàn)圖3、表2)。

表2 各組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Baclin1蛋白水平的比較

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 免疫熒光檢測(cè)LC3B結(jié)果 結(jié)果顯示，模型組HepG2細(xì)胞可見(jiàn)極少量的LC3B的表達(dá)，LG組細(xì)胞內(nèi)LC3B的表達(dá)較模型組升高，而AMPK抑制劑組LC3B的表達(dá)較LG組減少(見(jiàn)圖4)。

2.2.2 Western blotting法檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，和模型組相比，LG組p-AMPK、LC3B、Beclin1的蛋白表達(dá)升高，而應(yīng)用AMPK抑制劑Compound C后上述指標(biāo)表達(dá)較LG組受抑制下降(P<0.05～P<0.01)；此外，和模型組相比，p-mTOR在LG組表達(dá)降低，應(yīng)用AMPK抑制劑Compound C后表達(dá)較LG組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)(見(jiàn)圖5、表3)。

表3 各組HepG2細(xì)胞p-AMPK、p-mTOR、LC3B、Baclin1蛋白水平的比較

3 討論

一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)人群的分析數(shù)據(jù)顯示[8]，我國(guó)NAFLD的患病率達(dá)29.2%。NAFLD為糖尿病、心血管疾病的高危因素[9-10]，T2DM病人中49%～62%的人群合并有NAFLD，肥胖T2DM病人中NAFLD的患病率高達(dá)70%。NAFLD主要的病理演變過(guò)程為肝臟脂肪變性、肝細(xì)胞炎性改變嚴(yán)重發(fā)生肝細(xì)胞壞死。因此，延緩NAFLD進(jìn)展，改善肝細(xì)胞脂肪變性，受到了人們的廣泛重視。

LG作為長(zhǎng)效GLP-1類似物，不僅具有GLP-1降脂、減重、降壓等作用[11-12]，而且在保留其生物活性的情況下延長(zhǎng)了半衰期[13]，在2型糖尿病和心血管疾病的防治上有明確的優(yōu)勢(shì)。有研究[14]表明GLP-1受體激動(dòng)劑可改善肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，發(fā)揮降脂的作用。HAO等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HFD誘導(dǎo)的脂肪性肝炎(NASH)小鼠體質(zhì)量增加，肝脂肪水平增加。LG治療后可顯著降低HFD喂養(yǎng)小鼠的體質(zhì)量，改善肝臟脂質(zhì)蓄積，抑制血清總膽固醇和LDL水平的升高。我們的研究顯示，應(yīng)用HFD喂養(yǎng)構(gòu)建立肝脂肪變性的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)HFD喂養(yǎng)的小鼠血脂升高、肝功能明顯損壞，而LG能改善這一情況。HE染色和油紅染色進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)肝脂肪變性的小鼠肝細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞膨脹、可見(jiàn)大量脂肪空泡形成和炎性浸潤(rùn)，肝組織內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，而應(yīng)用LG后脂肪空泡、脂滴明顯減少。以上說(shuō)明，LG可以改善高脂誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性，抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積。

自噬是細(xì)胞自我更新的過(guò)程，分為選擇性自噬和非選擇性自噬。選擇性自噬是細(xì)胞特異性的吞噬低能的細(xì)胞器，例如線粒體受損，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)量。LC3B作為自噬小體形成過(guò)程中的招募蛋白存在于自噬小體的膜上，可以追蹤自噬的形成；Beclin1是哺乳動(dòng)物自噬過(guò)程的特異基因，不參與自噬泡形成，是一種自噬相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白。自噬激活后自噬體形成，可與溶酶體融合后釋放的酸性脂肪酶將脂質(zhì)進(jìn)行降解。自噬與脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗的相關(guān)性在很多研究中報(bào)道，自噬可以促進(jìn)肝細(xì)胞中脂類物質(zhì)的降解,減少其在肝臟的集聚，最終改善脂肪變性[16]。ZHANG等[17]通過(guò)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)自噬激活，刺激LC3B與脂滴的結(jié)合，介導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的降解，自噬增強(qiáng)可以保護(hù)肝細(xì)胞。長(zhǎng)期HFD導(dǎo)致體內(nèi)游離脂肪酸(FFA)增加，肝細(xì)胞自噬減弱，脂質(zhì)蓄積最終形成脂肪肝。近期研究顯示，LG可以改善FFA 誘導(dǎo)的脂毒性肝細(xì)胞損傷，并通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬來(lái)改善NAFLD中肝細(xì)胞脂肪變性[18]。 LG可以誘導(dǎo)HFD小鼠自噬，也可以通過(guò)增強(qiáng)自噬通量減輕PA誘導(dǎo)的脂質(zhì)積聚[19]。本研究無(wú)論動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示LG應(yīng)用后與模型組比較，自噬蛋白LC3B、Beclin1表達(dá)均明顯增多，初步探討了自噬在LG改善肝細(xì)胞脂肪變性的作用。

mTOR是自噬主要抑制通路之一，是AMPK下游信號(hào)分子。AMPK的激活會(huì)使Beclin1發(fā)生磷酸化，促進(jìn)自噬的發(fā)生和發(fā)展。AMPK是自噬的經(jīng)典上游調(diào)節(jié)劑，能被GLP-1R激動(dòng)劑激活。有研究[20]顯示AMPK是通過(guò)抑制肝臟細(xì)胞新生脂肪產(chǎn)生、增加肝臟脂肪酸的氧化能力、保護(hù)肝臟脂肪組織中線粒體功能這3種方式改善NAFLD肝臟脂肪變性。AMPK/mTOR介導(dǎo)的自噬水平在高脂喂養(yǎng)的小鼠及游離脂肪酸處理的LO2 細(xì)胞(人正常肝細(xì)胞)中均有明顯抑制作用[21]。小鼠HFD16周后肝臟自噬水平下調(diào)，機(jī)制考慮與p-AMPK/mTOR信號(hào)通路活性抑制相關(guān)[22]。以上動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均提示AMPK/mTOR可以誘導(dǎo)自噬改善肝臟細(xì)胞脂肪變性，我們的實(shí)驗(yàn)Western blotting結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B等蛋白表達(dá)增加，AMPK/mTOR信號(hào)通路活化，兩者之間呈現(xiàn)一致性改變。應(yīng)用免疫熒光染色和Western blotting發(fā)現(xiàn)模型組自噬的表達(dá)很低，LG組明顯增高，而AMPK抑制劑Compound C能拮抗LG對(duì)自噬的增強(qiáng)作用。最終我們得出結(jié)論，肝細(xì)胞變性時(shí)應(yīng)用LG所產(chǎn)生的自噬增加與AMPK/mTOR信號(hào)通路存在相關(guān)性。LG能通過(guò)活化AMPK抑制mTOR促進(jìn)自噬的發(fā)生，改善肝細(xì)胞脂肪變性。AMPK抑制劑能拮抗這一反應(yīng)的作用。我們的研究結(jié)果有助于為臨床應(yīng)用LG治療NAFLD及其相關(guān)代謝綜合征提供證據(jù)。