謝安心，王思源，張 潔，張惠娟，唐海歐，譚敦勇

乳腺癌是全球女性中最常見(jiàn)的惡性癌癥之一，也是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。盡管開(kāi)發(fā)了早期診斷，根治性手術(shù)和輔助治療等治療方法，但乳腺癌病人的預(yù)后仍然較差[2]。了解乳腺癌的分子機(jī)制有助于尋找乳腺癌治療的新靶點(diǎn)，因此，迫切需要了解乳腺癌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)新的分子靶點(diǎn)以改善乳腺癌病人的不良預(yù)后。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性、非蛋白質(zhì)編碼的小RNA分子，可通過(guò)直接切割靶信使核糖核酸(messenger RNA ，mRNA)或通過(guò)抑制其翻譯來(lái)負(fù)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)。研究[3-4]表明，異常表達(dá)的miRNA參與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展，包括癌癥。有研究[5-6]顯示，miR-99b-5p在各種癌癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。近期一項(xiàng)基于miRNA和組織特異性預(yù)測(cè)乳腺癌的潛在藥物的研究[7]指出，miR-99b-5p在乳腺癌中呈低表達(dá)，提示miR-99b-5p可能與乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。但miR-99b-5p對(duì)下游靶基因的調(diào)控作用及機(jī)制尚不清楚。Tribbles同源蛋白1(Tribbles pseudokinase 1，TRIB1)屬于Tribbles家族成員，參與多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[8]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TRIB1可能是miR-99b-5p的直接靶基因。miR-99b-5p是否通過(guò)靶向TRIB1調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡仍不明確。本研究探討miR-99b-5p靶向TRIB1對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為乳腺癌的靶向治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 人乳腺上皮細(xì)胞株HBL-100和乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供；PRMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清由美國(guó)Hyclone公司提供；miR-99b-5p模擬物(mimics)及對(duì)照(mimics control)由南京易普金生物科技有限公司提供；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑由美國(guó)Invitrogen公司提供；RNA提取試劑盒由北京康為試劑生物科技有限公司提供；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq檢測(cè)試劑盒由武漢科昊佳生物科技有限公司提供；Western blotting檢測(cè)所需相關(guān)試劑由碧云天生物技術(shù)研究所提供；TRIB1抗體及二抗由美國(guó)CST公司提供；MTT試劑由美國(guó)Sigma公司提供；AnnexinV-FITC/PI雙染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由美國(guó)BD公司提供；野生型TRIB1 3′UTR熒光素酶重組載體質(zhì)粒(TRIB1-Wt)和突變型TRIB1 3′UTR熒光素酶重組載體質(zhì)粒(TRIB1-Mut)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將乳腺上皮細(xì)胞HBL-100和乳腺癌細(xì)胞MCF-7從液氮罐中取出，37 ℃恒溫水浴鍋中快速凍融，1 000 r/min離心3 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)復(fù)蘇、培養(yǎng)，放置在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度達(dá)90%以上時(shí)，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 對(duì)數(shù)增殖期的MCF-7細(xì)胞以胰酶消化，接種到6孔板中，每孔接種105個(gè)細(xì)胞，于37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度約為50%時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑使用說(shuō)明書(shū)上的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，MCF-7細(xì)胞分為空白對(duì)照(Control)組：僅轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體；陰性對(duì)照(miR-NC)組：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列；實(shí)驗(yàn)(miR-99b-5p)組：轉(zhuǎn)染miR-99b-5p mimics。各組MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染5 h后進(jìn)行換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.4 RT-PCR 收集對(duì)數(shù)增殖期的HBL-100細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染48 h各組MCF-7細(xì)胞，分別采用RNA提取試劑盒抽提細(xì)胞中總RNA。采用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的純度和濃度，取2 μg合格的RNA以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，以U6為內(nèi)參，按照SYBR Premix Ex Taq檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)程序設(shè)為：94 ℃預(yù)熱5 min；隨后94 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。所用引物如下：U6，F(xiàn)-5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，R-5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′；miR-99b-5p，F(xiàn)-5′-CAC CCG TAG AAC CGA CCT T-3′，R-5′-GTC GTA TCC AGT GCG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TGC ACT GGA TAC GAC CGC AAG G-3′。采用相對(duì)定量2-△△Ct法計(jì)算細(xì)胞中miR-99b-5p相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blotting 對(duì)數(shù)增殖期的HBL-100細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和轉(zhuǎn)染48 h各組MCF-7細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS清洗2次后，利用細(xì)胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)于冰上分別提取總蛋白，4 ℃、14 000 r/min高速離心15 min后收集上清液至新的EP管中，采用BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，以最低濃度為標(biāo)準(zhǔn)將各組蛋白濃度調(diào)為一致，在蛋白中加入適量上樣緩沖液后沸水加熱10 min變性。配制SDS-PAGE凝膠，取40 μg蛋白樣品，電泳分離蛋白，隨后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶室溫封阻2 h，加入1∶800稀釋的TRIB1一抗，冰上孵育過(guò)夜。次日用TBST漂洗3次后，加入1∶3 000稀釋的二抗中室溫孵育2 h，棄去二抗，TBST漂洗3次后，加入電化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH進(jìn)行標(biāo)定，分析各細(xì)胞中TRIB1蛋白相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 MTT試驗(yàn) 對(duì)數(shù)期的MCF-7細(xì)胞以2×103個(gè)/孔種植于96孔板，按照1.3方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染和分組處理，分別在轉(zhuǎn)染24、48、72 h向每孔細(xì)胞中加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，除去細(xì)胞上清液，向每孔細(xì)胞中加入150 μL二甲基亞砜，放置在低速搖床上反應(yīng)10 min，直至沉淀全部溶解，使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處光密度(OD)值，每組細(xì)胞每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，其中用加了相應(yīng)量的細(xì)胞培養(yǎng)液、 MTT溶液和二甲基亞砜，未加細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 AnnexinV-FITC/PI雙染色法 Control組、miR-NC組和miR-99b-5p組MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集1×105個(gè)細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2遍，離心棄上清，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液以300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾到流式管中，分別向管中加入AnnexinV-FITC和PI染液各5 μL，充分混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞以胰酶消化，并以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/毫升，將TRIB1-Wt重組載體質(zhì)粒、TRIB1-Mut重組載體質(zhì)粒分別與miR-99b-5p mimics或mimics control共轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，于37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 miR-99b-5p和TRIB1在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的表達(dá) 與人乳腺上皮細(xì)胞HBL-100比較，乳腺癌MCF-7細(xì)胞中miR-99b-5p的表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，而TRIB1蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.01)(見(jiàn)圖1、表1)。

表1 HBL-100細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中miR-99b-5p表達(dá)量及TRIB1蛋白表達(dá)水平比較

2.2 轉(zhuǎn)染miR-99b-5p mimics對(duì)MCF-7細(xì)胞中miR-99b-5p和TRIB1表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染48 h后，miR-99b-5p組MCF-7細(xì)胞中miR-99b-5p的表達(dá)量高于Control組和miR-NC組(P<0.05)，TRIB1蛋白表達(dá)水平低于Control組和miR-NC組(P<0.05)；miR-NC組與和Control組中miR-99b-5p和TRIB1蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2、表2)。

表2 各組MCF-7細(xì)胞中miR-99b-5p表達(dá)量及TRIB1蛋白表達(dá)水平比較

2.3 過(guò)表達(dá)miR-99b-5p對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-99b-5p組MCF-7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h和72 h時(shí)OD值均低于miR-NC組和Control組(P<0.05)； Control組和miR-NC組MCF-7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)OD值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 各組MCF-7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)OD值比較

2.4 過(guò)表達(dá)miR-99b-5p對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 AnnexinV-FITC/PI雙染色法結(jié)果顯示，miR-99b-5p組MCF-7細(xì)胞凋亡率高于miR-NC組和Control組(P<0.05)；Control組和miR-NC組MCF-7細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3、表4)。

表4 各組MCF-7細(xì)胞凋亡率比較

2.5 miR-99b-5p靶向TRIB1關(guān)系驗(yàn)證 TargetScan等生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-99b-5p與TRIB1 3′UTR存在互補(bǔ)配對(duì)堿基(見(jiàn)圖4)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-99b-5p mimics和TRIB1-Wt后，與miR-NC組比，miR-99b-5p組MCF-7細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性明顯降低(P<0.01)；共轉(zhuǎn)染miR-99b-5p mimics和TRIB1-Mut后，miR-NC組和miR-99b-5p組MCF-7細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表5)。

表5 各組MCF-7細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性比較

3 討論

乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，即使組織形態(tài)學(xué)相同的腫瘤，對(duì)治療的反應(yīng)及預(yù)后可能不同[9]。目前用于治療乳腺癌的主要策略仍主要依賴(lài)于放療和化療，這些治療方式通常會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，并且在許多情況下治療效果有限[10]。因此，探究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)乳腺癌的靶向治療顯得尤為重要。自從20世紀(jì)90年代初首次發(fā)現(xiàn)miRNA以來(lái)，它們已經(jīng)被確定在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[11-12]。在乳腺癌的生理病理進(jìn)展中，有許多分子涉及各種生物學(xué)進(jìn)展，如蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、非編碼RNA等[13-14]。一些miRNA充當(dāng)腫瘤抑制因子或抑癌基因，在乳腺癌致癌的許多方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和血管生成[15-16]。miR-99b-5p的作用已在人類(lèi)多種實(shí)體瘤中得到廣泛研究，許多研究[17-18]表明miR-99b-5p在多種腫瘤中呈低表達(dá)，包括結(jié)腸癌、膀胱癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤和結(jié)直腸癌，發(fā)揮抑癌基因的作用。有研究[19]顯示，miR-99b-5p在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均下調(diào)，恢復(fù)其表達(dá)能夠通過(guò)靶向調(diào)控IGF-1R抑制胃癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。ZHANG等[20]研究顯示，與非腫瘤性腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織中miR-99a、miR-99b和miR-100表達(dá)水平均顯著降低，miR-99a、miR-99b和miR-100的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的抑制。本研究結(jié)果顯示，miR-99b-5p在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于人乳腺上皮HBL-100細(xì)胞；同時(shí)，過(guò)表達(dá)miR-99b-5p能夠明顯抑制MCF-7細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)miR-99b-5p發(fā)揮腫瘤抑制功能，與以往研究一致，因此推測(cè)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，miR-99b-5p充當(dāng)腫瘤抑制因子。

TRIB1是位于8q24區(qū)域的基因，目前被鑒定為胃癌、前列腺癌、食管癌和卵巢癌的致癌基因[21]。GENDELMAN等[7]通過(guò)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)推理建模將TRIB1識(shí)別為癌細(xì)胞中細(xì)胞周期進(jìn)程和存活的新型調(diào)節(jié)因子，進(jìn)一步乳腺癌臨床標(biāo)本驗(yàn)證了TRIB1的高表達(dá)水平。WANG等[22]對(duì)三陰性乳腺癌基因組譜的綜合探索確定潛在的藥物靶點(diǎn)的研究中發(fā)現(xiàn)，TRIB1可能是三陰性乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于乳腺上皮HBL-100細(xì)胞，TRIB1在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高，該結(jié)果提示TRIB1可能是乳腺癌的致癌基因；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-99b-5p和TRIB1的靶向關(guān)系，與前期生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致，且過(guò)表達(dá)miR-99b-5p明顯抑制了TRIB1蛋白的表達(dá)。因此，miR-99b-5p可靶向負(fù)調(diào)控TRIB1蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。

綜上，在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，miR-99b-5p呈低表達(dá)，而TRIB1呈高表達(dá)；過(guò)表達(dá)miR-99b-5p可降低MCF-7細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)靶向抑制TRIB1蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用。