李鮮麗，范晶華，晁春梅，遲曉偉，楊春霞，陳昕婷，韋嘉

[1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 感染與肝病科，云南 昆明，650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院（云南省第二人民醫(yī)院）肝臟疾病研究中心，云南 昆明 650021]

肝細(xì)胞癌是全球第6 大最常見的癌癥，具有生存率低、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者生命[1-2]。肝細(xì)胞癌通常是由基礎(chǔ)疾病引起，例如乙型肝炎，丙型肝炎和肝纖維化[3-4]。目前仍然沒有有效的治療方法。自噬是一種常見的細(xì)胞內(nèi)自降解過程，其中細(xì)胞蛋白或細(xì)胞器被雙膜自噬體包裹，并最終與溶酶體融合[5-6]。在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中，自噬具有雙重作用[7-8]：早期可抑制腫瘤的形成，在腫瘤的發(fā)展階段可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ并定位在自噬膜上，這是目前使用最廣泛的自噬標(biāo)志物，因此LC3-Ⅱ的數(shù)量反映了自噬體和自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)的數(shù)量[6-7]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素哺乳動(dòng)物靶蛋白（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/Akt/mTOR）通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、遷移、代謝、增殖和存活的關(guān)鍵信號(hào)通路[9]，對(duì)乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用[10]。因此，筆者推測PI3K/Akt/mTOR 通路和腫瘤細(xì)胞自噬作用在肝癌的發(fā)生中同樣起著至關(guān)重要的作用。

具有序列相似性的家族83 成員B（family with sequence similarity 83 member B,FAM83B）是FAM83蛋白家族的成員，F(xiàn)AM83B 被證實(shí)通過EGFR/RAS/MAPK 通路參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[11]。此外，F(xiàn)AM83B 可以激活腫瘤細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR 通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、非貼壁生長，提高致瘤性[11]。越來越多的證據(jù)表明，F(xiàn)AM83B 在多種腫瘤中高表達(dá)，包括肺鱗狀細(xì)胞癌和胰腺癌[12-13]。然而，F(xiàn)AM83B 在肝癌中的作用仍然未知。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本與細(xì)胞

組織標(biāo)本源于2017年3月—2019年3月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行肝癌切除的62 例患者的肝癌組織和癌旁正常組織，所有組織標(biāo)本經(jīng)病理檢查和免疫組織化學(xué)法確診。所有新鮮標(biāo)本通過液氮和甲醛分別保存，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。人類肝癌細(xì)胞系（HepG2、Hep3B）和正常人類肝細(xì)胞系（LO2）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM）、10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（美國Hyclone 公司），Lipofectamine 2000 Reagent 試劑盒、TRIzol 試劑盒（美國Invitrogen Life Technologies 公司），F(xiàn)AM83B的siRNA（si-FAM83B）和無序siRNA（si-NC）慢病毒載體（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），PrimeScript RT試劑盒、SYBR Premix ExTaq Ⅱ試劑盒（日本TaKaRa公司），CCK-8 試劑盒（日本Dojindo Laboratories 公司），免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2.2 主要儀器7500 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀（美國Applied Biosystems 公司），酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek 公司），流式細(xì)胞儀、Transwell 室（美國BD Biosciences 公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus株式會(huì)社）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)將HepG2、Hep3B、LO2 細(xì)胞置于DMEM 中，補(bǔ)充10%FBS、100 μg/mL 鏈霉素、100 u/mL青霉素，然后于37℃和5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 慢病毒的包裝和轉(zhuǎn)染采用靶向siRNA 敲低HepG2 細(xì)胞系中FAM83B 作為si-FAM83B 組，HepG2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC 慢病毒載體作為si-NC 組。分別用PBS、40 ng/mL 胰島素樣生長因子1（insulinlike growthfactor-1,IGF-1）處理si-FAM83B 組細(xì)胞48 h，并將細(xì)胞分為si-FAM83B+PBS 組和si-FAM83B+IGF-1 組。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測FAM38B mRNA 的表達(dá)用TRIzol 試劑提取總RNA，用Prime Script RT 試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix ExTaq Ⅱ試劑盒在7500 型qRTPCR 儀上進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)。qRT-PCR 引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算FAM38B mRNA 相對(duì)表達(dá)量，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 Western blotting 檢測FAM38B 蛋白的表達(dá)用RIPA 裂解液裂解組織和細(xì)胞，提取總蛋白，BCA測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液100℃水浴煮沸5 min。SDS-PAGE 電泳分離后，用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)PVDF 膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜后加入二抗孵育1 h，TBST 洗滌后，加入發(fā)光液，采用凝膠電泳成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。GAPDH 作為內(nèi)參蛋白，將目的蛋白灰度值與GAPDH 蛋白灰度值的比值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測FAM83B 蛋白的表達(dá)肝癌組織及癌旁正常組織經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，切4 μm 厚的切片。脫蠟、水化、3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸抗原修復(fù)，封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，一抗FAM83B 4℃封閉孵育過夜，加入二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB 染色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹脂封片。

1.3.6 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖用含10% FBS 的培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞按5×103個(gè)/孔的密度接種在96 孔板中。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處檢測每個(gè)孔的光密度（optical density,OD）值。

1.3.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期采用細(xì)胞周期檢測試劑盒分析細(xì)胞周期。按1×106個(gè)/mL 的密度收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）洗滌2 次，在500 μL 70%乙醇、25℃條件下固定2 h。細(xì)胞PBS 洗滌2 次，在400 μL 碘化丙啶（propidium iodide,PI）、100 μL RNase、37℃黑暗條件下孵育30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測PI 信號(hào)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 遍。

1.3.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡采用Annexin VFITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。按1×106個(gè)/mL 的密度收集細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，重懸于500 μL 結(jié)合緩沖液中，5 μL 膜聯(lián)蛋白V-FITC、5 μL PI 在37℃黑暗條件下孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 遍。

1.3.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲采用BD 24 孔Transwell 室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。按1×105個(gè)/mL的密度收集細(xì)胞，置于基底膠包被的Transwell上室中，并添加無血清培養(yǎng)基。下室添加含10%FBS 的完全培養(yǎng)基。37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱孵育48 h 后，將侵襲到下室的細(xì)胞用甲醇固定30 min，然后結(jié)晶紫染色15 min。在光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選擇3 個(gè)高倍視野測量細(xì)胞數(shù)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graphpad 5.0 和SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAM83B在肝癌組織中高表達(dá)

肝癌組織與癌旁正常組織FAM83B mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肝癌組織高于癌旁正常組織。見表2和圖1。

表2 癌旁正常組織與肝癌組織FAM38B mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表2 癌旁正常組織與肝癌組織FAM38B mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組織癌旁正常組織肝癌組織t 值P 值FAM38B mRNA 1.000±0.530 2.254±1.195 7.553 0.000 FAM38B蛋白1.000±0.230 2.675±0.562 21.719 0.000

圖1 FAM83B蛋白在肝癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，F(xiàn)AM38B 主要表達(dá)于細(xì)胞核，少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。陽性染色細(xì)胞為褐色或黑色。見圖2。

圖2 肝癌組織和癌旁癌旁正常組織FAM83B的表達(dá)（免疫組織化學(xué)法×400）

2.2 FAM83B在肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)

LO2、HepG2、Hep3B 細(xì)胞FAM83B mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與LO2 細(xì)胞比較，HepG2、Hep3B 細(xì)胞FAM83B mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。見表3和圖3。

圖3 FAM83B蛋白在LO2、HepG2、Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)

表3 3種細(xì)胞FAM38B mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 3種細(xì)胞FAM38B mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

細(xì)胞LO2 Hep3B HepG2 F 值P 值FAM38B mRNA 1.000±0.130 1.933±0.251 2.352±0.306 24.842 0.000 FAM38B蛋白1.000±0.130 2.081±0.271 2.763±0.359 32.446 0.000

2.3 敲低FAM83B 可抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲并促進(jìn)凋亡

si-NC 組與si-FAM83B 組FAM83B mRNA 和 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），si-FAM83B 組低于si-NC 組。見表4和圖4。

表4 si-NC組與si-FAM83B組FAM38B mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表4 si-NC組與si-FAM83B組FAM38B mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別si-NC組si-FAM83B組t 值P 值FAM38B mRNA 1.000±0.110 0.237±0.019 11.839 0.000 FAM38B蛋白1.000±0.080 0.273±0.022 15.177 0.000

圖4 FAM83B蛋白在si-FAM83B組和si-NC組HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

si-NC 組與si-FAM83B 組24 h、48 h、72 h、96 h的OD 值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)OD 值有差異（F=773.510，P=0.001）。②si-NC 組與si-FAM83B 組的OD 值有差異（F=516.980，P=0.000），si-FAM83B 組OD 值較低，細(xì)胞活力降低。③兩組OD 值變化趨勢(shì)有差異（F=820.782，P=0.000）。見表5。

表5 si-NC組與si-FAM83B組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較 （±s）

表5 si-NC組與si-FAM83B組不同時(shí)間點(diǎn)OD值比較 （±s）

組別si-NC組si-FAM83B組24 h 0.231±0.014 0.201±0.001 48 h 0.378±0.010 0.243±0.010 72 h 0.790±0.069 0.559±0.009 96 h 1.219±0.057 0.727±0.028

si-NC 組與si-FAM83B 組細(xì)胞凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），si-FAM83B 組細(xì)胞凋亡率高于si-NC 組，侵襲細(xì)胞數(shù)少于si-NC 組。見表6和圖5、6。

圖5 si-NC組與si-FAM83B組HepG2細(xì)胞的流式細(xì)胞圖

表6 si-NC組與si-FAM83B組的細(xì)胞凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

表6 si-NC組與si-FAM83B組的細(xì)胞凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

組別si-NC組si-FAM83B組t 值P 值細(xì)胞凋亡率/%11.010±0.661 29.306±3.517 8.855 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)/（個(gè)/HP）80.436±4.826 41.443±4.973 9.746 0.000

2.4 敲低FAM83B可沉默PI3K/Akt/mTOR通路并促進(jìn)細(xì)胞自噬

si-NC 組與 si-FAM83B 組 PI3K、p-Akt、pmTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），si-FAM83B 組PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于si-NC 組，LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量高于si-NC 組。si-NC 組與si-FAM83B 組Akt、mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表7和圖7。

表7 si-NC組與si-FAM83B組PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表7 si-NC組與si-FAM83B組PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別si-NC組si-FAM83B組t 值P 值PI3K蛋白1.00±0.05 0.42±0.02 19.855 0.000 p-Akt蛋白1.00±0.05 0.33±0.02 20.509 0.000 Akt蛋白1.00±0.07 0.97±0.07 0.475 0.659 p-mTOR蛋白1.00±0.07 0.15±0.01 20.419 0.000 mTOR蛋白1.00±0.05 0.94±0.05 1.329 0.255 LC3-Ⅱ蛋白1.00±0.05 8.65±0.41 32.402 0.000

si-FAM83B+PBS 組與 si-FAM83B+IGF-1 組PI3K、p-Akt、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），si-FAM83B+IGF-1 組PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于si-FAM83B+PBS 組，LC3-Ⅱ低于si-FAM83B+PBS 組。si-FAM83B+PBS 組與si-FAM83B+IGF-1組Akt、mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表8和圖7。

表8 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表8 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別si-FAM83B+PBS組si-FAM83B+IGF-1組t 值P 值PI3K蛋白1.00±0.06 4.77±0.22 28.856 0.000 p-Akt蛋白1.00±0.05 5.37±0.29 25.682 0.000 Akt蛋白1.00±0.06 1.07±0.07 1.221 0.289 p-mTOR蛋白1.00±0.08 3.07±0.22 15.538 0.000 mTOR蛋白1.00±0.06 1.06±0.06 1.203 0.295 LC3-Ⅱ蛋白1.00±0.05 0.29±0.01 24.834 0.000

圖6 si-NC組與si-FAM83B組HepG2細(xì)胞侵襲能力（×400）

圖7 各組細(xì)胞PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)

2.5 激活PI3K/Akt/mTOR通路可逆轉(zhuǎn)FAM83B敲低誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬

si-FAM83B+PBS 組與si-FAM83B+IGF-1 組24 h、48 h、72 h、96 h 的OD 值比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)OD 值有差異（F=5211.626，P=0.000）。②si-FAM83B+PBS 組與si-FAM83B+IGF-1 組OD 值有差異（F=453.499，P=0.000），si-FAM83B+IGF-1 組OD 值較高，細(xì)胞活力升高。③兩組OD 值變化趨勢(shì)有差異（F=384.347，P=0.000）。見表9。

表9 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組不同時(shí)間點(diǎn)的OD值比較 （±s）

表9 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組不同時(shí)間點(diǎn)的OD值比較 （±s）

組別si-FAM83B+PBS組si-FAM83B+IGF-1組24 h 0.227±0.020 0.243±0.006 48 h 0.241±0.007 0.396±0.007 72 h 0.552±0.049 0.810±0.031 96 h 0.688±0.049 1.254±0.071

si-FAM83B+PBS 組與si-FAM83B+IGF-1 組細(xì)胞凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），si-FAM83B+ IGF-1 組細(xì)胞凋亡率低于si-FAM83B+ PBS 組，侵襲細(xì)胞數(shù)高于si-FAM83B+PBS 組（P＜0.05）。見表10 和圖8、9。

表10 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組的細(xì)胞凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

表10 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組的細(xì)胞凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)比較 （±s）

組別si-FAM83B+PBS組si-FAM83B+IGF-1組t 值P 值細(xì)胞凋亡率/%30.005±1.800 10.906±1.309 14.863 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)/（個(gè)/HP）38.570±2.314 76.459±9.175 6.936 0.002

圖8 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組HepG2細(xì)胞的流式細(xì)胞圖

圖9 si-FAM83B+PBS組與si-FAM83B+IGF-1組HepG2細(xì)胞侵襲能力（×400）

3 討論

目前關(guān)于FAM83B 參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的機(jī)制依然存在爭議，多項(xiàng)研究證實(shí)FAM83B 在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并且是潛在的癌基因[12-14]。例如，F(xiàn)AM83B 在肺鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，可作為肺鱗狀細(xì)胞癌潛在診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[12]；還有研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中FAM83B 表達(dá)水平高于癌旁正常組織[14]，與本研究結(jié)果一致。FAM83B 的致癌機(jī)制可能與其結(jié)構(gòu)中一個(gè)功能未知的高度保守域DUF1669有關(guān)，這一保守域在FAM83B 蛋白介導(dǎo)的致瘤轉(zhuǎn)化中具有至關(guān)重要的作用，并且該功能域可激活多種信號(hào)通路，參與腫瘤的發(fā)生[15]。

多種腫瘤的發(fā)生與PI3K/Akt/mTOR 通路激活有關(guān)。有研究證實(shí)，F(xiàn)AM83B 蛋白結(jié)合PI3K 蛋白后直接激活PI3K/Akt/mTOR 通路，導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[11]。FAM83B 蛋白可與p85α、p110α、Akt 結(jié)合，其中p85α和p110α 是PI3K 的重要亞單位，從而促進(jìn)p110α 和Akt 的膜定位，由此激活下游的PI3K/Akt 信號(hào)通路[16]。此外，F(xiàn)AM83B 還可與表皮生長因子受體結(jié)合，促進(jìn)表皮生長因子的磷酸化和磷脂酶D 形成[17]，磷脂酶D 可以促進(jìn)卵磷脂水解為磷脂酸，而磷脂酸是mTOR 信號(hào)通路中重要的組成部分。筆者進(jìn)一步研究了FAM83B 介導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲的相關(guān)信號(hào)通路。Western blotting 檢測結(jié)果表明，敲低FAM83B 降低了HepG2 細(xì)胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達(dá)，表明敲低FAM83B 可以沉默肝癌細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR 通路，進(jìn)一步證實(shí)上述研究結(jié)論。自噬是由多個(gè)復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)觸發(fā)的，其中包括PI3K/Akt/mTOR 通路[18]。自噬過程中，LC3-Ⅱ是重要的自噬相關(guān)蛋白，參與自噬體的形成[19]。本研究結(jié)果表明，敲低肝癌細(xì)胞中FAM83B 可以抑制LC3-Ⅱ的表達(dá)，敲低FAM83B 可以抑制PI3K/Akt/mTOR 通路并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的自噬。眾所周知，IGF-1 與IGF-1受體結(jié)合后可激活PI3K/Akt 信號(hào)通路。為進(jìn)一步證實(shí)PI3K/Akt/mTOR 通路在敲低FAM83B 誘導(dǎo)的自噬過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)用IGF-1 處理si-FAM83B 轉(zhuǎn)染的HepG2 細(xì)胞，結(jié)果顯示，經(jīng)IGF-1 處理后，si-FAM83B 轉(zhuǎn)染的HepG2 細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高。此外，與PBS 處理的細(xì)胞比較，用IGF-1 處理后，si-FAM83B 轉(zhuǎn) 染 的HepG2 細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)降低。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，激活PI3K/Akt/mTOR 通路可以逆轉(zhuǎn)敲低FAM83B 介導(dǎo)的自噬作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖和侵襲。

綜上所述，本研究首次證明了FAM83B 在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，而敲低FAM83B 可以通過沉默PI3K/Akt/mTOR 通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的自噬。這些發(fā)現(xiàn)有助于更好地了解FAM83B 在肝癌中的作用，并且FAM83B 也可能成為肝癌治療的潛在靶標(biāo)。