蔡毅博，陳海琴，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

產(chǎn)油絲狀真菌高山被孢霉(Mortierellaalpina)在合適的生長條件下能累積總脂達(dá)細(xì)胞干重的50%以上，且具備工業(yè)化生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的能力。過去幾年，為實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)產(chǎn)量的提升，圍繞高山被孢霉代謝機(jī)制解析、工程菌株構(gòu)建和發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究層出不窮[1]。2011年至今，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)陸續(xù)完成了高山被孢霉的全基因組測(cè)序，構(gòu)建了高山被孢霉脂質(zhì)合成的全局代謝網(wǎng)絡(luò)[2]。包括轉(zhuǎn)錄組、代謝組和蛋白組學(xué)在內(nèi)的組學(xué)技術(shù)已經(jīng)被成功應(yīng)用于解析老化和氮脅迫調(diào)控高山被孢霉脂質(zhì)累積機(jī)制[3-4]。此外，高山被孢霉基因工程改造也被應(yīng)用于前體化合物供給途徑，通過擴(kuò)充脂肪酸合成所需前體池(如酰基輔酶A、還原力和能量等)提升總脂產(chǎn)量[5-7]。目前高山被孢霉發(fā)酵工藝的研究主要集中在菌體生長條件的優(yōu)化，如發(fā)酵液碳氮源的種類、濃度比例、發(fā)酵液pH和溶氧條件等多種因素[8]，其中圍繞氮限制和有機(jī)氮源替換無機(jī)氮源進(jìn)行的發(fā)酵條件優(yōu)化對(duì)高山被孢霉產(chǎn)脂有重要意義。

生物體內(nèi)氨基酸不同的存在形式?jīng)Q定了其功能的多樣性。一方面，氨基酸作為結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白的基本組成單位，在維持細(xì)胞基本架構(gòu)的同時(shí)也是胞內(nèi)不可缺少的生化反應(yīng)催化劑和信號(hào)分子[9-10]。另一方面游離氨基酸可以作為氮源被微生物分解代謝，維持胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)的同時(shí)合成次生代謝物[11-12]。谷氨酸是生物體內(nèi)重要的α-氨基酸，除了合成蛋白外，它還能通過參與脫氨基作用、脫羧基作用和氨轉(zhuǎn)運(yùn)過程在胞內(nèi)發(fā)揮作用[13]。線粒體中谷氨酸脫氫酶催化的氧化脫氨基作用在真核產(chǎn)油微生物中被大量報(bào)道，該過程中谷氨酸作為底物在單步酶促反應(yīng)下生成α-酮戊二酸和游離態(tài)氨并伴隨還原力(NADPH)的生成[14]。谷氨酸脫氨基作用產(chǎn)生游離態(tài)的氨并不會(huì)在胞內(nèi)長時(shí)間保存，例如大多數(shù)微生物可以通過谷氨酸-谷氨酰胺路徑將游離氨快速轉(zhuǎn)運(yùn)到尿素循環(huán)用于胞內(nèi)含氮化合物合成。除此之外，谷氨酸脫羧作用產(chǎn)生的4-氨基丁酸也是生物體內(nèi)重要的生命活性物質(zhì)[15]。

隨著氮限制誘導(dǎo)產(chǎn)油真菌脂質(zhì)累積的發(fā)酵策略被深度解析，谷氨酸介導(dǎo)的產(chǎn)油微生物代謝策略轉(zhuǎn)移成為調(diào)控微生物脂質(zhì)合成的重要途徑[16]。依托基因-代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)建立的產(chǎn)脂導(dǎo)向代謝模型識(shí)別出解脂耶氏酵母、高山被孢霉等菌株胞內(nèi)谷氨酸代謝通路，其中包括谷氨酸-4-氨基丁酸支流路徑和谷氨酸脫氨基途徑中多個(gè)基因可能是調(diào)控產(chǎn)脂的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[17]。一方面，琥珀酸半醛脫氫酶的功能突變或缺失顯著調(diào)節(jié)了解脂耶氏酵母產(chǎn)脂能力，這凸顯出谷氨酸次生代謝物4-氨基丁酸的同化對(duì)產(chǎn)脂的重要意義[18]。另一方面，琥珀酸半醛脫氫酶基因的過表達(dá)顯著增加了高山被孢霉胞內(nèi)還原力水平，這被用于促進(jìn)脂肪酸的從頭合成[19]。本課題組先后報(bào)道了縱向時(shí)間序列多組學(xué)分析解析高山被孢霉脂質(zhì)合成的機(jī)制，并介紹了高山被孢霉谷氨酸代謝在高山被孢霉生長和產(chǎn)脂中發(fā)揮的作用[4, 20]。

基于氮限制條件高山被孢霉脂質(zhì)累積的組學(xué)分析結(jié)果，本研究探究了谷氨酸代謝在高山被孢霉脂質(zhì)合成過程中可能發(fā)揮的作用。首先，以谷氨酸為補(bǔ)加氮源進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證實(shí)了谷氨酸代謝對(duì)高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的影響。在此基礎(chǔ)上，我們分析了谷氨酸代謝可能引發(fā)的次生代謝物豐度變化、基因轉(zhuǎn)錄水平和關(guān)鍵酶活性變化，以確定其對(duì)高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株與發(fā)酵

高山被孢霉(MortierellaalpinaATCC32222)，美國模式培養(yǎng)物集存庫。

GY固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30.0，酵母提取物5.0，KNO32.0，MgSO4·7H2O 1.5，NaH2PO41.0，瓊脂粉20.0。Broth液體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，酵母提取物5.0，KNO310.0，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO41.0。Kendrick發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30.0，酒石酸銨2.0，KH2PO47.0，Na2HPO42.0，MgSO4·7H2O 1.5，酵母提取物1.5，CaCl20.1，100 μL 10 000×金屬離子溶液(8.0 g FeCl3·6H2O，1.0 g ZnSO4·7H2O，0.1 g CuSO4，0.1 g CoH12N2O12，0.1 g MnO4S，溶于100 mL超純水)。GY固體培養(yǎng)基、Broth液體培養(yǎng)基和Kendrick發(fā)酵培養(yǎng)基分別用于菌體保藏、活化和發(fā)酵[4]，具體操作方法為：從4 ℃冷庫取出保藏于GY固體斜面培養(yǎng)基的高山被孢霉菌株，于Broth液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)2代后獲得種子發(fā)酵液。以1%的接種量將種子液接種于裝有100 mL Kendrick限氮培養(yǎng)基的250 mL三角瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條件為：溫度28 ℃、pH 6.0、通氣量0.5 m3/(m3·min)、轉(zhuǎn)數(shù)200 r/min。

1.2 主要試劑

酒石酸銨、一水合-L-谷氨酸鈉、L-谷氨酸、4-氨基丁酸、乙酸鈉(色譜級(jí))、芴甲氧羰酰氯、L-烯丙基甘氨酸、D-葡萄糖-6-磷酸鈉鹽，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒，南京建成科技有限公司；色譜級(jí)甲醇、乙腈、Tris-HCl、DL-二硫蘇糖醇，德國默克股份兩合公司；苯甲脒鹽酸、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，生工生物工程(上海)股份有限公司；5-磷酸吡哆醛單水合物，北京沃凱生物科技有限公司；四氫呋喃、硼酸、十二水合四硼酸鈉、考馬斯亮藍(lán)R-250等其他試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，北京六合華大基因科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

ZQXY-HC振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器公司；Trace 1310氣相色譜儀，美國賽默飛公司；Bio-Rad?CFX384實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國伯樂公司；Waters e2695高效液相色譜分離模塊、Waters 2489紫外/可見光檢測(cè)器，美國沃特世公司；Fortis-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，3 μm)，英國Fortis公司。

1.4 分析方法

1.4.1 谷氨酸及其代謝物定量分析

發(fā)酵液前處理：使用200目分樣篩將菌體與發(fā)酵液分離并收集發(fā)酵液，12 000×g離心10 min，取上清液過0.22 μm水系濾膜，用于液相色譜分析。

液相色譜分析[21]：向1.5 mL離心管中加入500 μL待測(cè)液和10%三氯乙酸溶液，振蕩均質(zhì)后置于40 ℃水浴鍋中反應(yīng)一段時(shí)間，10 000×g離心10 min，收集上清液，代謝物經(jīng)衍生化后采用液相色譜進(jìn)行分析。液相檢測(cè)條件為：A：V(乙酸鈉)∶V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(四氫呋喃)=82∶8.5∶8.5∶1；B：V(乙酸鈉)∶V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(四氫呋喃)=22∶38.5∶38.5∶1。洗脫模式為等度洗脫(A∶B=30∶70)，流速為1 mL/min，柱溫箱溫度40 ℃，在265 nm下檢測(cè)。

1.4.2 菌體生物量、脂肪酸和發(fā)酵液殘?zhí)?、殘氮分?/p>

參考實(shí)驗(yàn)室已有方法[4-5]進(jìn)行菌體干重、脂肪酸測(cè)定，發(fā)酵液葡萄糖和銨態(tài)氮的定量分析。菌體經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行生物量測(cè)定和脂肪酸提取與分析。適當(dāng)稀釋發(fā)酵上清液，采用葡萄糖測(cè)定試劑盒測(cè)定發(fā)酵液中殘余葡萄糖含量；采用溴酚藍(lán)比色法測(cè)定發(fā)酵液的銨態(tài)氮含量。

1.4.3 谷氨酸代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析

菌體經(jīng)液氮研磨采用Triol-氯仿提取法[5]提取全細(xì)胞RNA，采用Thermos反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，并進(jìn)行相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分析。

以酒石酸銨發(fā)酵高山被孢霉作為對(duì)照組，內(nèi)參基因?yàn)楦呱奖绘呙沟?8S rDNA。參用2-ΔΔCt法對(duì)目的基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。每株菌培養(yǎng)時(shí)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)平行，測(cè)定轉(zhuǎn)錄水平時(shí)每個(gè)樣品做3個(gè)技術(shù)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物具體如表1所示。

1.4.4 粗酶液的制備與關(guān)鍵酶活性分析

取適量新鮮的菌體經(jīng)液氮研磨和粗酶提取液處理后收集粗酶液用于酶活性分析[5]。

谷氨酸脫羧酶活性分析：采用底物激活反應(yīng)的方式進(jìn)行酶活水平分析。首先，將反應(yīng)所需底物(L-谷氨酸鈉)和輔因子(磷酸吡哆醛)預(yù)混于濃度為50 mmol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.2)中。放置于水浴鍋中40 ℃預(yù)熱10 min，加入蛋白質(zhì)量濃度為0.1 g/L的粗酶，于37 ℃反應(yīng)4 min。加入適量0.2 mol/L的硼酸緩沖液(pH 9.0)水浴終止反應(yīng)，10 000×g離心10 min，收集上清液，進(jìn)行產(chǎn)物衍生化和液相色譜分析。酶活性由單位時(shí)間內(nèi)單位酶量催化生成產(chǎn)物的增加量來表示。

谷氨酸脫氫酶活性分析：反應(yīng)體系如表2所示，反應(yīng)激活方式同谷氨酸脫羧酶。使用分光光度計(jì)在340 nm 處檢測(cè)產(chǎn)物吸光度值用于酶活性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)與繪圖

采用Graphpad Prism 6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、相關(guān)性分析。圖形繪制采用Graphpad Prism 6，AI。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮限制誘導(dǎo)高山被孢霉谷氨酸代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化

氮限制培養(yǎng)是通過非生物脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)油微生物累積脂質(zhì)的發(fā)酵策略，已經(jīng)被用于促進(jìn)高山被孢霉產(chǎn)脂?；谡n題組前期組學(xué)數(shù)據(jù)，我們分析了氮限制前后高山被孢霉胞內(nèi)編碼谷氨酸代謝相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平[20]，結(jié)果如圖1所示。編碼谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH，EC 1.4.1.2/1.4.1.3)的3種gdh基因轉(zhuǎn)錄水平在氮限制前后的變化趨勢(shì)并不一致。然而，編碼谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15)和4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(4-aminobutyrate aminotransferase，ABAT，EC 2.6.1.19)的gad基因和abat基因轉(zhuǎn)錄水平則分別由氮限制前的不足20 FKPM提升到150 FKPM和60 FKPM。編碼琥珀酸半醛脫氫酶(succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH，EC 1.2.1.16)的ssadh基因轉(zhuǎn)錄水平則在氮限制后升高至50 FKPM。這些結(jié)果表明氮限制可能通過調(diào)控谷氨酸代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平改變高山被孢霉生長代謝。

在基因轉(zhuǎn)錄水平基礎(chǔ)上我們分析了上述酶的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示。與轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢(shì)類似，氮限制條件下3種谷氨酸脫氫酶同工酶的蛋白表達(dá)水平升降幅度均在1倍左右，這表明谷氨酸脫氫反應(yīng)參與調(diào)控了高山被孢霉胞內(nèi)氮代謝與NADPH合成等反應(yīng)的熵平衡。此外，谷氨酸-4-氨基丁酸路徑中關(guān)鍵酶谷氨酸脫羧酶和琥珀酸半醛脫氫酶的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)相同的上升趨勢(shì)，谷氨酸脫羧酶催化產(chǎn)物4-氨基丁酸被證明與細(xì)胞能量代謝相關(guān)，并作為大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)物質(zhì)參與氮脅迫應(yīng)激響應(yīng)等生理過程[22]。因此，谷氨酸代謝可能是平衡細(xì)胞生長和產(chǎn)脂的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

a-谷氨酸脫氫酶1；b-NAD(P)+谷氨酸脫氫酶2；c-NAD(P)+谷氨酸脫氫酶3；d-谷氨酸脫羧酶；e-4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶；f-琥珀酸半醛脫氫酶圖2 高山被孢霉發(fā)酵過程中谷氨酸代謝關(guān)鍵酶表達(dá)水平變化Fig.2 Changes in the expression levels of key enzymes in the glutamate metabolic pathway of M.alpina during fermentation注：圖中縱坐標(biāo)表示不同時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)水平的相對(duì)變化(取log2倍數(shù)變化)

2.2 谷氨酸代謝對(duì)高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的影響

為確定谷氨酸代謝對(duì)高山被孢霉生長和產(chǎn)脂的調(diào)控作用，實(shí)驗(yàn)分別在0(發(fā)酵初期)和72 h(培養(yǎng)基氮源耗盡后24 h內(nèi))2個(gè)時(shí)間點(diǎn)向培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為0.8 g/L的谷氨酸，結(jié)果如圖3所示。相較于0 h，72 h補(bǔ)加含氮量相同的酒石酸銨和谷氨酸使得高山被孢霉發(fā)酵耗糖量提升了約3 g/L(圖3-a)?；诘孜锏母咝Ю?，實(shí)驗(yàn)選取72 h作為谷氨酸補(bǔ)加時(shí)間點(diǎn)探究谷氨酸代謝調(diào)節(jié)高山被孢霉產(chǎn)脂的機(jī)制。相較于原始氮源酒石酸銨，在72 h補(bǔ)加谷氨酸能夠?qū)⒏呱奖绘呙箍傊a(chǎn)量提升近1 g/L(約為脂肪酸含量的10%)，且在發(fā)酵終止時(shí)補(bǔ)加谷氨酸使得高山被孢霉的耗糖量提升了約3 g/L(圖3-b、圖3-c)。這些結(jié)果表明，補(bǔ)加谷氨酸提升了高山被孢霉發(fā)酵過程中葡萄糖的利用率，有利于細(xì)胞產(chǎn)脂。

a-高山被孢霉耗糖量；b-高山被孢霉生物量；c-高山被孢霉脂肪酸含量圖3 氮源補(bǔ)加對(duì)高山被孢霉消耗葡萄糖、累積生物量和合成脂質(zhì)的影響Fig.3 Effects of nitrogen supplementation on glucose consumption, biomass accumulation and lipid synthesis of M.alpina注：AT表示酒石酸銨；Glu表示谷氨酸；0、72 h均為發(fā)酵期間補(bǔ)加谷氨酸的時(shí)間點(diǎn); *代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001;****代表P<0.000 1(下同)

為解析谷氨酸代謝調(diào)節(jié)高山被孢霉脂質(zhì)累積的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過補(bǔ)加谷氨酸考察高山被孢霉在不同時(shí)間點(diǎn)生長和產(chǎn)脂特征，結(jié)果如圖4所示。72～96 h期間，發(fā)酵液中谷氨酸被高山被孢霉完全吸收，在此期間補(bǔ)加谷氨酸代謝加快了細(xì)胞消耗底物葡萄糖用于生物量的累積。96～144 h期間，高山被孢霉同化的谷氨酸進(jìn)入胞內(nèi)有機(jī)氮循環(huán)。此時(shí)谷氨酸代謝顯著增加高山被孢霉的耗糖速率的同時(shí)總脂產(chǎn)量也提升了約1.3 g/L(約占脂肪酸含量的5%)。120～196 h期間底物碳源逐漸被耗盡，高山被孢霉累積總脂達(dá)到最高，補(bǔ)加谷氨酸使得細(xì)胞總脂較酒石酸銨提升了近3 g/L(約占脂肪酸含量10%)。上述結(jié)果表明，不同時(shí)間階段的高山被孢霉胞內(nèi)谷氨酸代謝可能參與調(diào)節(jié)了產(chǎn)脂相關(guān)基因表達(dá)水平和蛋白翻譯水平，進(jìn)而引發(fā)了脂肪酸產(chǎn)量的顯著提升。此外，谷氨酸自身分解代謝產(chǎn)生的碳骨架和還原力也可能流入脂肪酸從頭合成路徑。

a-高山被孢霉底物消耗水平變化情況；b-高山被孢霉生物量變化情況；c-高山被孢霉脂肪酸產(chǎn)量變化情況圖4 高山被孢霉發(fā)酵過程中的底物消耗、生長與脂質(zhì)積累變化Fig.4 Substrate consumption, growth and lipid accumulation of M.alpina during the fermentation process

2.3 補(bǔ)加谷氨酸調(diào)控谷氨酸代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

為驗(yàn)證高山被孢霉谷氨酸代謝可能對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生的調(diào)控作用及其與產(chǎn)脂間關(guān)系，實(shí)驗(yàn)分析了谷氨酸代謝相關(guān)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平[基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平(倍)=補(bǔ)加谷氨酸發(fā)酵條件下該基因的轉(zhuǎn)錄水平/補(bǔ)加酒石酸銨發(fā)酵條件下該基因轉(zhuǎn)錄水平]。根據(jù)高山被孢霉氮回補(bǔ)發(fā)酵期間的底物消耗和產(chǎn)脂特點(diǎn)(圖4)，實(shí)驗(yàn)選取了96、120 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分析，結(jié)果如圖5所示。在96～120 h期間，NAD(P)+gdh基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平先上升1倍左右再下降，而gdh和asl基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平則一直降至0.5倍以下。相反，gad、abat、ssadh和p5cdh基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均達(dá)到了2倍以上，這與氮限制引發(fā)脂質(zhì)累積期間的情況相似。

高山被孢霉胞內(nèi)谷氨酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄水平與谷氨酸脫氫反應(yīng)熵平衡相關(guān)，NAD(P)+gdh2/3基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)推動(dòng)谷氨酸流向三羧酸循環(huán)，該過程產(chǎn)生還原力參與合成脂肪酸。asl基因編碼的精氨酸琥珀酸裂解酶是尿素循環(huán)中關(guān)鍵限速酶，asl基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)抑制了高山被孢霉胞內(nèi)游離氨通過尿素循環(huán)代謝。與產(chǎn)油酵母類似，asl與gdh1基因轉(zhuǎn)錄水平的同時(shí)降低對(duì)谷氨酸脫氫產(chǎn)氨反應(yīng)形成負(fù)反饋效應(yīng)，避免了胞內(nèi)氨累積引發(fā)的細(xì)胞毒性。谷氨酸脫羧酶是谷氨酸-4-氨基丁酸路徑的首個(gè)酶，催化產(chǎn)生的次生代謝物包括4-氨基丁酸、琥珀酸等。谷氨酸代謝上調(diào)gad、abat、ssadh基因轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)了4-氨基丁酸的同化及NADPH的合成，這是谷氨酸代謝調(diào)節(jié)高山被孢霉信號(hào)傳遞和產(chǎn)脂的重要依據(jù)。吡咯啉5-磷酸脫氫酶是谷氨酸-脯氨酸途徑中的關(guān)鍵酶，谷氨酸代謝促使p5cdh基因轉(zhuǎn)錄水平上升，在促進(jìn)脯氨酸的合成的同時(shí)生成了NADPH，脯氨酸作為必需氨基酸參與產(chǎn)油微生物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受行為。綜上，相較于酒石酸銨，谷氨酸在高山被孢霉胞內(nèi)的快速代謝對(duì)氮脅迫的緩解較弱，同時(shí)脫氫反應(yīng)產(chǎn)生的NADPH 使得高山被孢霉能夠累積足夠多的脂質(zhì)以抵抗脅迫。

a-谷氨酸代謝通路圖；b-gdh相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平；c-asl相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平；d-gad相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平；e-abat相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平； f-ssadh相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平；g-p5cdh相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平圖5 谷氨酸代謝路徑及關(guān)鍵基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.5 Glutamate metabolic pathway and relative transcript level analysis of key genes注：gdh：谷氨酸脫氫酶基因;asl：精氨酸琥珀酸裂解酶基因；gad：谷氨酸脫羧酶基因；abat：4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶基因；ssadh：琥珀酸半醛脫氫酶基因； p5cdh：吡咯啉5-磷酸脫氫酶基因；基因后序號(hào)表示編碼同工酶基因；相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平：基因的轉(zhuǎn)錄水平 (補(bǔ)加谷氨酸發(fā)酵菌體)/基因轉(zhuǎn)錄水平(補(bǔ)加酒石酸銨發(fā)酵菌體)

2.4 谷氨酸代謝調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶活性

基于高山被孢霉谷氨酸代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化情況，谷氨酸脫氫路徑和谷氨酸-4-氨基丁酸路徑是高山被孢霉同化谷氨酸的關(guān)鍵路徑，這可能與細(xì)胞產(chǎn)脂相關(guān)。實(shí)驗(yàn)考察了96～196 h期間高山被孢霉谷氨酸脫氫酶和谷氨酸脫羧酶的粗酶活性隨時(shí)間序列的變化趨勢(shì)，結(jié)果如圖6所示。高山被孢霉胞內(nèi)NAD+型谷氨酸脫氫酶活性在補(bǔ)加兩種氮源后持續(xù)降低，避免谷氨酸作為碳源大量流入三羧酸循環(huán)的同時(shí)削弱胞內(nèi)氨累積。而補(bǔ)加谷氨酸使得NADP+型谷氨酸脫氫酶活性在96～144 h時(shí)增加至約250 U/mg，并在144～196 h期間下降至45 U/mg左右，該酶催化產(chǎn)物NADPH是從頭合成脂肪酸的重要前體。如圖6-b所示，在96～120 h期間，補(bǔ)加谷氨酸并未顯著改變高山被孢霉胞內(nèi)谷氨酸脫羧酶活性，且未造成脂肪酸產(chǎn)量的差異(圖4-c)。在120～44 h谷氨酸脫羧酶活性呈迅速上升趨勢(shì)，并于144 h達(dá)到最高。值得注意的是，120 h時(shí)谷氨酸組高山被孢霉的總脂肪酸占干重比例均顯著高于酒石酸銨組。因此谷氨酸代謝引發(fā)了谷氨酸脫羧酶活性顯著增加，促進(jìn)了4-氨基丁酸的同化與還原力合成。這些結(jié)果表明，相較于酒石酸銨，谷氨酸代謝會(huì)通過上調(diào)高山被孢霉胞內(nèi)NADP+型谷氨酸脫氫酶和谷氨酸脫羧酶活性實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)谷氨酸的快速消耗和脂肪酸合成前體池的高效擴(kuò)充，這促進(jìn)了脂肪酸的從頭合成。

在144～196 h期間細(xì)胞進(jìn)入發(fā)酵末期，谷氨酸脫氫酶和谷氨酸脫羧酶活性呈顯著下降趨勢(shì)。這表明谷氨酸耗盡后，高山被孢霉可能啟動(dòng)了蛋白酶精簡(jiǎn)策略，通過將酶蛋白分解從新納入有機(jī)氮循環(huán)來維持胞內(nèi)氮平衡。

a-NAD+谷氨酸脫氫酶活性變化；b-NADP+谷氨酸脫氫酶活性變化；c-谷氨酸脫羧酶活性變化圖6 谷氨酸脫氫酶與谷氨酸脫羧酶的活性分析Fig.6 Activity analysis of glutamate dehydrogenase and glutamate decarboxylase注：96、120、144、168、196 h分別為酶活性測(cè)定樣品采樣點(diǎn)

3 結(jié)論

本研究考察了谷氨酸代謝對(duì)高山被孢霉產(chǎn)脂的影響。補(bǔ)加谷氨酸增加了高山被孢霉對(duì)葡萄糖的消耗量，使得高山被孢霉總脂產(chǎn)量提升約3 g/L。高山被孢霉胞內(nèi)谷氨酸代謝顯著增加了NADP+型谷氨酸脫氫酶和谷氨酸脫羧酶的活性，促進(jìn)次生代謝物4-氨基丁酸同化的同時(shí)為脂肪酸從頭合成提供了充足的還原力。此外，谷氨酸代謝還參與調(diào)控了ssadh、p5cdh、asl等基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因編碼的酶與高山被孢霉胞內(nèi)氨轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝與脅迫應(yīng)激密切相關(guān)。谷氨酸作為高山被孢霉胞內(nèi)氮代謝的中樞環(huán)節(jié)，對(duì)高山被孢霉合成脂質(zhì)的機(jī)制探究和工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。