王新葉, 王永歡, 陳曉青, 羅貞標(biāo), 李紅霞, 李芳香, 趙 亮

茅臺(tái)學(xué)院 釀酒工程系，貴州 仁懷 564500

酒醅是白酒發(fā)酵的主要載體基質(zhì)，其微環(huán)境具有高濃度乙醇、高濃度有機(jī)酸、低pH等特點(diǎn)[1]。霉菌是白酒釀造過(guò)程中主要的真菌，包括曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、紅曲霉(Monascus)等，這些優(yōu)勢(shì)真菌產(chǎn)生的糖化酶、液化酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶、果膠酶、單寧酶等對(duì)分解釀酒原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)具有積極的推動(dòng)作用，使得整個(gè)反應(yīng)體系中糖類及氨基酸含量升高，可為其他微生物的代謝提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也為后續(xù)的酒體風(fēng)味形成奠定基礎(chǔ)[2,3]。同時(shí)，霉菌還可以在一定程度上利用釀酒原料中不易被分解的纖維素，在提高原料使用率上起到一定作用[4]。

曲霉是絲狀真菌的一個(gè)屬，包含350多個(gè)種[5]。曲霉屬微生物的繁殖主要通過(guò)形成無(wú)性孢子(分生孢子)而產(chǎn)生稱為分生孢子頭的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而分生孢子頭的形態(tài)(無(wú)性孢子的大小、顏色和排列)是曲霉屬內(nèi)鑒定和分類的關(guān)鍵參數(shù)[6,7]。曲霉屬的微生物能夠產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物以及大量的酶，例如米曲霉可以用來(lái)生產(chǎn)天門(mén)冬氨酸蛋白酶[8]，曲霉屬的菌種已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域[9-11]。工業(yè)上重要的曲霉菌主要屬于兩大類曲霉菌——黑曲霉類和黃曲霉類。黑曲霉類包括26個(gè)種，例如魯氏曲霉(A.luchuensis)、黑曲霉(A.niger)和管曲霉菌(A.tubingensis)[12-14]。黃曲霉菌(A.flavus)和寄生曲霉菌(A.parasiticus)能夠產(chǎn)生黃曲霉毒素，引起侵襲性曲霉菌病或過(guò)敏性支氣管肺曲霉菌病，嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生[15]。非黃曲霉毒素產(chǎn)生菌——米曲霉(A.oryzae)、大豆曲霉(A.sojae)及玉米曲霉(A.tamarii)主要用于食品發(fā)酵和酶的生產(chǎn)[16,17]。

在本研究中，從醬香型酒醅中分離篩選得到了一株霉菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)菌株進(jìn)行了鑒定，對(duì)菌株的纖維素酶等七種胞外酶產(chǎn)生能力及環(huán)境耐受性進(jìn)行了測(cè)定，并用GC-MS測(cè)定了菌株的代謝產(chǎn)物，為菌種的潛在應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

醬香型酒醅(貴州省仁懷市紅土地釀酒作坊)。

1.2 培養(yǎng)基

(1) 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5～6.0。

(2) 糊精培養(yǎng)基：糊精20 g，硝酸鈉3 g，氯化鉀0.5 g，磷酸氫二鉀1 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，七水合硫酸鎂5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5。

(3) 改良葡萄糖酵母浸粉蛋白胨(Glucose Yeast Extract Peptone，GYP)培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 g，葡萄糖1 g，酵母膏0.1 g，蛋白胨0.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5～6.0。

(4) 改良酵母提取物和胰蛋白胨(Yeast Extract and Tryptone，YP)培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5 g，酵母膏0.1 g，蛋白胨0.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 5.5～6.0。

(5) 改良酪素培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀0.003 6 g，硫酸亞鐵0.000 02 g，磷酸氫二鈉0.010 7 g，胰蛋白胨0.000 05 g，硫酸鎂0.005 g，干酪素0.04 g，CaCl20.000 2 g，氯化鈉0.001 6 g，氯化鋅0.001 4 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5。

(6) 改良PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，三丁酸甘油酯4 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5。

(7) 果膠酶產(chǎn)生培養(yǎng)基：酵母膏1 g，果膠5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5～6.0。

(8) 改良馬丁氏培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5。

(9) 環(huán)境耐受性檢測(cè)培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基，根據(jù)需要加入乙醇或乳酸。

(10) 鎮(zhèn)達(dá)等培養(yǎng)基[18]：乳酸5 g，酵母膏2 g，硫酸銨2 g，磷酸氫二鈉14.3 g，磷酸二氫鉀3 g，水合硫酸錳0.28 mg，七水合硫酸亞鐵0.3 mg，七水合硫酸鎂0.06 mg，氯化鈣1 mg，硫酸銅0.05 mg，硫酸鋅0.05 mg，硼酸0.05 mg，1 000 mL蒸餾水。

1.3 菌株的分離純化

稱取10 g醬香型酒醅加入到90 mL無(wú)菌水中，震蕩30 min。靜置5 min，吸取上清液1 mL加入到9 mL無(wú)菌水中，作為10-1。將菌懸液進(jìn)行逐級(jí)稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5，選取10-3、10-4、10-5三個(gè)濃度的稀釋液，分別吸取100 μL涂布在PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度做三個(gè)重復(fù)。將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d～5 d。挑取霉菌的單個(gè)菌絲接種于新的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行純化2～3次。

1.4 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

挑取霉菌的單個(gè)菌絲點(diǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d后，觀察菌落形態(tài)。在載玻片上加一滴無(wú)菌水，挑取霉菌的菌絲在無(wú)菌水中涂布均勻，滴加一滴亞甲基藍(lán)染色液，蓋上蓋玻片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.5 菌株的分子生物學(xué)鑒定

用真菌基因組DNA提取試劑盒(索萊寶，貨號(hào)：D2300)提取霉菌的基因組DNA，以引物NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)和NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)擴(kuò)增霉菌的18S rDNA，PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)。下載同源性較高的已知菌株的18S rDNA序列，利用MEGA 7.0.26軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 霉菌的酶活特性分析

(1) 糖化酶：將霉菌點(diǎn)接于糊精培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d～5 d后，在培養(yǎng)基上加入0.02 mol/L碘液，若菌落周圍能夠形成無(wú)色透明圈，則菌株具有糖化酶產(chǎn)生能力。

(2) 液化酶(α-淀粉酶)：將霉菌點(diǎn)接于改良GYP培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d～5 d后，在菌落周圍滴加盧戈氏碘液，若菌落邊緣出現(xiàn)黃色透明圈，則菌株具有液化酶產(chǎn)生能力。

(3) 纖維素酶：將霉菌點(diǎn)接于改良YP培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d～5 d后，在菌落周圍滴加0.2%剛果紅溶液，放置10 min后，用1 mol/L氯化鈉溶液沖洗，若菌落邊緣出現(xiàn)黃色透明圈，則菌株具有纖維素酶產(chǎn)生能力。

(4) 蛋白酶：將霉菌點(diǎn)接于改良酪素培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d～5 d后，若菌落周圍出現(xiàn)透明圈，則菌株具有蛋白酶產(chǎn)生能力。

(5) 酯化酶：將霉菌點(diǎn)接于改良PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d～5 d后，若菌落周圍出現(xiàn)透明圈，則菌株具有酯化酶產(chǎn)生能力。

(6) 果膠酶：將霉菌點(diǎn)接于果膠酶產(chǎn)生培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d～5 d后，在平板上滴加1%十六烷基三甲基溴化銨水溶液，若菌落周圍出現(xiàn)透明圈，則菌株具有果膠酶產(chǎn)生能力。

(7) 單寧酶：吸取0.1 g/mL的單寧酸溶液1 mL，添加到改良馬丁氏培養(yǎng)基上，涂布均勻，形成白色不透明的單寧薄層，接種霉菌，培養(yǎng)3 d～5 d后，若菌落周圍出現(xiàn)透明圈，則菌株具有單寧酶產(chǎn)生能力。

1.7 霉菌的環(huán)境耐受性分析

(1) 溫度耐受性：挑取霉菌的菌絲，用劃線法接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上，將平板置于4 ℃、28 ℃、37 ℃、45 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d后，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

(2) 乙醇耐受性：配制YPD固體培養(yǎng)基，添加無(wú)水乙醇至體積濃度為2%、4%、6%。挑取霉菌的菌絲用劃線法接種到乙醇梯度培養(yǎng)基上，將平板置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3 d后，觀察菌株的生長(zhǎng)情況。

(3) 乳酸耐受性：配制YPD固體培養(yǎng)基，添加乳酸至質(zhì)量濃度為10 g/L、30 g/L和50 g/L。挑取霉菌的菌絲用劃線法接種到乳酸梯度培養(yǎng)基上，將平板置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d后，觀察菌株的生長(zhǎng)情況。

1.8 霉菌代謝產(chǎn)物解析

以乳酸為唯一碳源的Lu-Ye培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，150 r/min，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，8 000 r/min離心10 min，收集上清液。將上清液用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾后，用氣-質(zhì)聯(lián)用色譜檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物。色譜質(zhì)譜檢測(cè)條件為色譜柱：安捷倫DB-5，30 m×0.32 mm，0.25 μm；載氣：氦氣；流速：1.8 mL/min，分流比=5∶1；升溫程序：40 ℃，保持4 min；10 ℃/min升至100 ℃，保持0 min；25 ℃/min升至200 ℃，保持0 min；前進(jìn)樣口溫度：150 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；Mass Range：20m/z～150m/z；離子源：EI；掃描方式：SIM/SCA。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程獲得的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 霉菌的篩選和鑒定

(1) 形態(tài)學(xué)鑒定

以PDA為篩選培養(yǎng)基，從醬香型酒醅中篩選得到1株霉菌JP7。該菌株在PDA平板上生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)3 d后，能夠形成較大的菌落，菌落表面微皺、干燥，不透明，邊緣不整齊，菌落內(nèi)部為黃綠色，邊緣為灰白色，菌落于培養(yǎng)基連接緊密，不易挑起。

在顯微鏡下觀察到霉菌JP7的菌絲分支較少，分生孢子頭呈菊花狀，分生孢子頭上著生球形或近球形的孢子，如圖1所示。

圖1 霉菌JP7的顯微形態(tài)觀察

(2) 霉菌的分子生物學(xué)鑒定

如圖2所示，基于18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，JP7與AspergillusversicolorNRRL 238聚稱1簇，兩株菌的同源性最高，且兩株菌的18S rDNA序列相似性為99.69%，因此將JP7歸屬于Aspergillusversicolor，將JP7命名為AspergillusversicolorJP7。

2.2 霉菌的酶活特性分析

如表1所示，A.versicolorJP7在糊精培養(yǎng)基(糖化酶產(chǎn)生)、改良GYP(液化酶產(chǎn)生)、改良酪素(蛋白酶)、改良PDA培養(yǎng)基(酯化酶產(chǎn)生)、果膠酶產(chǎn)生培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基等6種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但是不能形成特征透明圈。結(jié)果表明A.versicolorJP7不具備糖化酶、液化酶、蛋白酶、酯化酶、果膠酶和單寧酶產(chǎn)生能力。A.versicolorJP7能夠在改良YP培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并形成透明圈，表明A.versicolorJP7具有纖維素酶產(chǎn)生能力。如圖3所示，A.versicolorJP7在改良YP培養(yǎng)基上形成的菌落直徑為0.5 cm，黃色透明圈直徑為2.5 cm，透明圈與菌落直徑比為5。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表1 A. versicolor JP7的產(chǎn)酶能力檢測(cè)

圖3 A. versicolor JP7在改良YP培養(yǎng)基上形成的透明圈

2.3 霉菌的環(huán)境耐受性分析

(1) 溫度耐受性

如表2所示，在設(shè)置的4個(gè)溫度梯度中，A.versicolorJP7只能在28 ℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，高溫和低溫都不能生長(zhǎng)。

表2 A. Versicolor JP7溫度耐受性測(cè)定

(2) 乙醇耐受性

如表3和圖4所示，隨著乙醇體積濃度的升高，A.versicolorJP7的生長(zhǎng)逐漸減弱，酒精濃度達(dá)到6%時(shí)，A.versicolorJP7的生長(zhǎng)受到明顯抑制。

表3 A. Versicolor JP7酒精耐受性測(cè)定

(3) 乳酸耐受性

如表4和圖5所示，乳酸對(duì)A.versicolorJP7的生長(zhǎng)有明顯的影響，隨乳酸濃度升高，菌體生長(zhǎng)逐漸減弱。當(dāng)乳酸濃度達(dá)到50 g/L時(shí)，A.versicolorJP7的生長(zhǎng)受到明顯抑制。

從左到右，分別代表不同的乙醇濃度梯度：0%、2%、4%、6%圖4 菌株JP7在乙醇梯度培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

表4 A. Versicolor JP7乳酸耐受性測(cè)定

2.4 霉菌的代謝產(chǎn)物解析

如表5所示，以乳酸為唯一碳源進(jìn)行液體發(fā)酵，用乙酸乙酯萃取后，A.versicolorJP7主要產(chǎn)生7種代謝產(chǎn)物，其中1,2-丙二醇和己烷的產(chǎn)量最高。

表5 A. versicolor JP7發(fā)酵產(chǎn)物解析

3 結(jié)論

本研究以乳酸為唯一碳源從醬香型酒醅中篩選得到一株霉菌JP7，該霉菌菌落上呈現(xiàn)1種以上顏色，中部為黃色，邊緣為灰白色，在顯微鏡下能觀察到曲霉特征的菊花狀分生孢子頭?；诰?8S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析，該菌屬于雜色曲霉A.versicolor，因此，將JP7命名為A.versicolorJP7。A.versicolorJP7具有較強(qiáng)的纖維素酶產(chǎn)生能力，在改良YP培養(yǎng)基上形成的透明圈與菌落直徑比為5。從溫度、乳酸和酒精三個(gè)方面考察菌株對(duì)環(huán)境的耐受性，菌株的最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，低溫和高溫均不能生長(zhǎng)；菌株對(duì)酒精的最高耐受濃度為6%；菌株對(duì)乳酸的耐受能力較強(qiáng)，可達(dá)到50 g/L。通過(guò)GC-MS檢測(cè)，在以乳酸為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，A.versicolorJP7利用乳酸主要產(chǎn)生了7種代謝產(chǎn)物，其中1,2-丙二醇和己烷的產(chǎn)量較高。

已見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的乳酸利用菌主要是細(xì)菌，包括丙酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬、泥桿菌屬、葡萄球菌屬、土孢桿菌屬等[19-21]，其中，芽孢桿菌屬的菌株最多[22]。乳酸是酒醅中含量最高的有機(jī)酸，在瀘型酒中，發(fā)酵結(jié)束時(shí)其質(zhì)量濃度范圍在15 g/L ～20 g/L酒醅左右，而在醬香型酒中，中后期輪次酒醅中乳酸含量可達(dá)到20 g/kg～40 g/kg酒醅[18-19]，據(jù)此可以推測(cè)醬香型酒醅可能含有更豐富的乳酸利用菌種質(zhì)資源，有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。高濃度的乙醇耐受能力是乳酸降解菌應(yīng)用于白酒生產(chǎn)的前提，乙醇濃度超過(guò)6%，乳酸利用菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制，而菌株對(duì)乳酸的降解率也大幅度下降[1]。在本研究中，乙醇濃度達(dá)到6%，A.versicolorJP7的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，因此，A.versicolorJP7能否作為乳酸降解菌應(yīng)用到白酒生產(chǎn)中，需在高濃度乙醇環(huán)境中對(duì)菌株的乳酸降解能力進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)定。

雜色曲霉(A.versicolor)是曲霉屬的一種常見(jiàn)種，屬于雜色曲霉群。雜色曲霉產(chǎn)生的雜色曲霉素(Sterigmatocystin，STG)是黃曲霉毒素B1、G1等的前體物質(zhì)，結(jié)構(gòu)與黃曲霉毒素極為相似，都含有雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)[23]。毒理學(xué)試驗(yàn)表明：雜色曲霉素具有肝毒性和免疫抑制效應(yīng)，可誘發(fā)肝癌等癌癥疾病[24-25]。近年來(lái)，雜色曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物越來(lái)越受到關(guān)注。A.versicolorZZ761能夠產(chǎn)生1種新的吲哚二萜和15種已知化合物，這種新的吲哚二萜針對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度是20.6 μmol/L，對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度為22.8 μmol/L[26]。而 LI TX等人[27]從A.versicolorZZ761中分離得到兩種新的化合物——曲酮A和曲酮B，這兩種物質(zhì)是曲酸的衍生物，在體內(nèi)外均具有消炎作用。A.versicolorJP7利用乳酸主要產(chǎn)生1,2-丙二醇和己烷。1,2-丙二醇和己烷是重要的工業(yè)原料，丙二醇本身可以作為溶劑、抗凍劑和保護(hù)劑，還可以參與多種化學(xué)合成反應(yīng)，能夠作為單體參與聚酯、聚醚和聚氨酯和合成，是具有廣闊應(yīng)用前景的化工原料之一[28]。己烷在有機(jī)合成中有重要的應(yīng)用，主要用作溶劑、化學(xué)試劑、涂料稀釋劑及聚合反應(yīng)的介質(zhì)等[29]。丙二醇和己烷主要通過(guò)化學(xué)法進(jìn)行合成，化學(xué)合成法存在一些問(wèn)題：對(duì)設(shè)備有高壓和高溫的要求、反應(yīng)過(guò)程中需使用昂貴的催化劑、釋放有毒的中間體、依賴不可再生材料、低產(chǎn)量和復(fù)雜性等[30]。本研究為進(jìn)一步探究微生物法生產(chǎn)丙二醇和己烷提供理論依據(jù)。