聶曉臻， 孫 潔， 王 倩， 俞方璐

中檢科(上海)測試技術(shù)有限公司,上海 201206

乳鐵蛋白是一種天然的、具有免疫功能的球狀單體糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一員。乳鐵蛋白具有殺菌和抑菌、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)整腸道菌群、促進(jìn)鐵吸收等功能[1]。嬰幼兒配方食品成分復(fù)雜，其中脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)含量高，而乳鐵蛋白含量低，常見乳粉添加量在20 mg/100 g～50 mg/100 g左右，在檢測過程中，各種雜蛋白干擾大。目前，國家尚未制定檢測嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。因乳鐵蛋白未進(jìn)入檢測體系，年度食品安全監(jiān)督抽檢并未包含該項檢測，將會影響業(yè)界對嬰幼兒配方食品質(zhì)量的判定，不利于嬰幼兒配方食品中營養(yǎng)強化添加劑的風(fēng)險監(jiān)督監(jiān)測。因此，我國急需對嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的檢測方法進(jìn)行探究，完善我國食品安全管控體系。所以本研究從國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等乳制品檢測方法中選出5種蛋白質(zhì)沉淀前處理過程，比較分離蛋白質(zhì)后，乳鐵蛋白的測定結(jié)果，為日常檢測乳鐵蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，Glycarbo；乙腈(色譜純)，上海安譜實驗科技股份有限公司；氯化鈉、磷酸、十二水合磷酸氫二鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸(分析級)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

U3000高效液相色譜儀，配備紫外檢測器(VWD)(美國賽默飛世爾科技有限公司)；HiTrap Heparin HP(1 mL)肝素親和柱(美國GE Healthcare)；電子天平(賽多利斯)；超聲清洗儀(昆山舒美)；渦旋混合器(大龍)；pH計(賽多利斯)。

1.3 溶液的配制

磷酸氫二鈉溶液(0.5 mol/L)：稱取17.9 g十二水合磷酸氫二鈉，加適量水溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.00±0.05，加水定容至1 L。

磷酸氫二鈉(0.5 mol/L)-氯化鈉溶液(1.0 mol/L)：稱取17.9 g十二水合磷酸氫二鈉，58.4 g氯化鈉，加適量水溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.00±0.05，加水定容至1 L。

亞鐵氰化鉀溶液：稱取15.0 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并定容至100 mL。

乙酸鋅溶液：稱取30.0 g乙酸鋅，用水溶解并定容至100 mL。

鹽酸溶液(1 mol/L)：吸取83 mL鹽酸，于1 L燒杯中，加917 mL水，混勻。

氫氧化鈉溶液(1 mol/L)：稱取40 g氫氧化鈉于1 L燒杯中，加水溶解并稀釋至1 L，混勻。

三氯乙酸溶液(150 g/L)：稱取15.0 g三氯乙酸，加水溶解并稀釋至100 mL，混勻。

實驗室用水為Milli-Q超純水。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0 mg/mL): 稱量按證書提供的純度(98%)，準(zhǔn)確稱取乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10.20 mg，用超純水溶解，定容至10 mL，置于4 ℃冰箱中保存。

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用磷酸氫二鈉溶液逐級稀釋成濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.5 樣品處理方法

稱取5 g樣品于50 mL燒杯中，加入20 mL水，渦旋混勻后待處理。含淀粉類樣品(如米粉、面條等)，再加入0.5 g淀粉酶，于37 ℃水浴鍋中酶解30 min后取出，冷卻備用。

1.5.1磷酸沉淀過程[2]

用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.6±0.1，轉(zhuǎn)移至50 mL容器瓶中，用水定容至刻度，混勻，靜置30 min后濾紙過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中，上機測定。

1.5.2三氯乙酸沉淀過程[3]

將樣品溶液轉(zhuǎn)移至50 mL容器瓶中，用三氯乙酸溶液定容至50 mL，靜置5 min后濾紙過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中，上機測定。

1.5.3乙腈沉淀過程[4]

將樣品溶液轉(zhuǎn)移至50 mL容器瓶中，用乙腈定容至50 mL，混勻后靜置10 min，濾紙過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中，上機測定。

1.5.4沉淀劑沉淀過程[5]

加入1.0 mL亞鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻，再加入1.0 mL乙酸鋅溶液，渦旋混勻，轉(zhuǎn)移至50 mL容器瓶中用水定容至刻度，靜置10 min，濾紙過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中，上機測定。

1.5.5等電點沉淀過程[6]

用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至1.7±0.1，靜置2 min后，再用1.0 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至4.5±0.1，置于水浴超聲15 min，充分提取后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中用水定容至刻度，混勻后濾紙過濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中，上機測定。

1.6 液相色譜上機條件

色譜柱：HiTrap Heparin肝素親和柱；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：50 μL；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；流動相A：磷酸氫二鈉溶液；流動相B：磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

乳鐵蛋白的線性變化范圍為：10 μg/mL ～200 μg/mL，線性回歸方程為Y=0.167 9X-1.063 4，相關(guān)系數(shù)0.999 5。見圖1和圖2。

圖1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同沉淀方法的加標(biāo)回收率比較

在廠家提供的空白乳基奶粉中添加3 mg/100 g、20 mg/100 g和50 mg/100 g的乳鐵蛋白，用1.5中提到的5種方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，分別進(jìn)行六平行試樣，表1為不同沉淀方法的乳鐵蛋白加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)比較，色譜圖見圖3～圖7。

表1 不同沉淀方法的乳鐵蛋白加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)比較

圖3 磷酸沉淀法加標(biāo)樣品色譜圖

圖4 三氯乙酸沉淀法加標(biāo)樣品色譜圖

圖5 乙腈沉淀法加標(biāo)樣品色譜圖

圖6 沉淀劑沉淀法加標(biāo)樣品色譜圖

圖7 等電點沉淀法加標(biāo)樣品色譜圖

磷酸調(diào)節(jié)pH沉淀法的加標(biāo)回收率在95.7%～102%之間，三氯乙酸沉淀法、有機試劑(乙腈)沉淀法、沉淀劑(亞鐵氰化鉀乙酸鋅)沉淀法結(jié)果均未檢出。等電點沉淀法回收率結(jié)果偏低，因此選擇磷酸沉淀法。

2.3 檢出限與定量限

在空白樣品中添加低濃度的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過對儀器信噪比進(jìn)行分析，以信噪比約為3和10進(jìn)行評定檢出限和定量限。本方法中乳鐵蛋白的方法檢出限為1 mg/100 g，定量限為3 mg/100 g。

2.4 不同基質(zhì)對乳鐵蛋白檢測的影響

在市售產(chǎn)品中挑選了豆基奶粉、部分蛋白水解配方食品和米粉，向其添加1 mg/100 g、20 mg/100 g和50 mg/100 g的乳鐵蛋白，經(jīng)過磷酸沉淀處理上機，做六次平行實驗，表2為不同基質(zhì)下乳鐵蛋白加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)比較。

從加標(biāo)回收率可以看出，該方法同時適用于豆基奶粉和米粉，但不適用于部分蛋白水解食品。

2.5 實際樣品檢測

隨機抽取市面上常見的額外添加乳鐵蛋白的嬰幼兒配方乳粉，經(jīng)過磷酸沉淀處理上機，檢測結(jié)果見表3。

表2 不同基質(zhì)下乳鐵蛋白加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)比較

表3 乳鐵蛋白測定結(jié)果表

檢測結(jié)果表明，以上7種嬰幼兒配方乳粉的乳鐵蛋白標(biāo)簽值與實測值一致。

3 結(jié)論

本實驗比較了5種分離蛋白質(zhì)的方法對嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的測定結(jié)果的影響，其中，磷酸調(diào)節(jié)pH沉淀法的加標(biāo)回收率在85%～105%之間，精密度在10%以內(nèi)，且準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，但不適用于特殊醫(yī)學(xué)用途部分蛋白水解食品。三氯乙酸沉淀法、有機試劑(乙腈)沉淀法、沉淀劑(亞鐵氰化鉀乙酸鋅)沉淀法結(jié)果均未檢出。等電點沉淀法結(jié)果偏低，準(zhǔn)確度低，不適用于嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的檢測。