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        嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量測定方法的研究

        2022-11-01 08:28:52聶曉臻俞方璐
        工業(yè)微生物 2022年5期

        聶曉臻, 孫 潔, 王 倩, 俞方璐

        中檢科(上海)測試技術(shù)有限公司,上海 201206

        乳鐵蛋白是一種天然的、具有免疫功能的球狀單體糖蛋白,屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一員。乳鐵蛋白具有殺菌和抑菌、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)整腸道菌群、促進(jìn)鐵吸收等功能[1]。嬰幼兒配方食品成分復(fù)雜,其中脂肪、碳水化合物、蛋白質(zhì)含量高,而乳鐵蛋白含量低,常見乳粉添加量在20 mg/100 g~50 mg/100 g左右,在檢測過程中,各種雜蛋白干擾大。目前,國家尚未制定檢測嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。因乳鐵蛋白未進(jìn)入檢測體系,年度食品安全監(jiān)督抽檢并未包含該項檢測,將會影響業(yè)界對嬰幼兒配方食品質(zhì)量的判定,不利于嬰幼兒配方食品中營養(yǎng)強化添加劑的風(fēng)險監(jiān)督監(jiān)測。因此,我國急需對嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的檢測方法進(jìn)行探究,完善我國食品安全管控體系。所以本研究從國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等乳制品檢測方法中選出5種蛋白質(zhì)沉淀前處理過程,比較分離蛋白質(zhì)后,乳鐵蛋白的測定結(jié)果,為日常檢測乳鐵蛋白提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 試劑

        乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,Glycarbo;乙腈(色譜純),上海安譜實驗科技股份有限公司;氯化鈉、磷酸、十二水合磷酸氫二鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸(分析級),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 儀器

        U3000高效液相色譜儀,配備紫外檢測器(VWD)(美國賽默飛世爾科技有限公司);HiTrap Heparin HP(1 mL)肝素親和柱(美國GE Healthcare);電子天平(賽多利斯);超聲清洗儀(昆山舒美);渦旋混合器(大龍);pH計(賽多利斯)。

        1.3 溶液的配制

        磷酸氫二鈉溶液(0.5 mol/L):稱取17.9 g十二水合磷酸氫二鈉,加適量水溶解,用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.00±0.05,加水定容至1 L。

        磷酸氫二鈉(0.5 mol/L)-氯化鈉溶液(1.0 mol/L):稱取17.9 g十二水合磷酸氫二鈉,58.4 g氯化鈉,加適量水溶解,用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.00±0.05,加水定容至1 L。

        亞鐵氰化鉀溶液:稱取15.0 g亞鐵氰化鉀,用水溶解并定容至100 mL。

        乙酸鋅溶液:稱取30.0 g乙酸鋅,用水溶解并定容至100 mL。

        鹽酸溶液(1 mol/L):吸取83 mL鹽酸,于1 L燒杯中,加917 mL水,混勻。

        氫氧化鈉溶液(1 mol/L):稱取40 g氫氧化鈉于1 L燒杯中,加水溶解并稀釋至1 L,混勻。

        三氯乙酸溶液(150 g/L):稱取15.0 g三氯乙酸,加水溶解并稀釋至100 mL,混勻。

        實驗室用水為Milli-Q超純水。

        1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

        乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0 mg/mL): 稱量按證書提供的純度(98%),準(zhǔn)確稱取乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品10.20 mg,用超純水溶解,定容至10 mL,置于4 ℃冰箱中保存。

        乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別準(zhǔn)確吸取乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用磷酸氫二鈉溶液逐級稀釋成濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

        1.5 樣品處理方法

        稱取5 g樣品于50 mL燒杯中,加入20 mL水,渦旋混勻后待處理。含淀粉類樣品(如米粉、面條等),再加入0.5 g淀粉酶,于37 ℃水浴鍋中酶解30 min后取出,冷卻備用。

        1.5.1磷酸沉淀過程[2]

        用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.6±0.1,轉(zhuǎn)移至50 mL容器瓶中,用水定容至刻度,混勻,靜置30 min后濾紙過濾,濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中,上機測定。

        1.5.2三氯乙酸沉淀過程[3]

        將樣品溶液轉(zhuǎn)移至50 mL容器瓶中,用三氯乙酸溶液定容至50 mL,靜置5 min后濾紙過濾,濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中,上機測定。

        1.5.3乙腈沉淀過程[4]

        將樣品溶液轉(zhuǎn)移至50 mL容器瓶中,用乙腈定容至50 mL,混勻后靜置10 min,濾紙過濾,濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中,上機測定。

        1.5.4沉淀劑沉淀過程[5]

        加入1.0 mL亞鐵氰化鉀溶液,渦旋混勻,再加入1.0 mL乙酸鋅溶液,渦旋混勻,轉(zhuǎn)移至50 mL容器瓶中用水定容至刻度,靜置10 min,濾紙過濾,濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中,上機測定。

        1.5.5等電點沉淀過程[6]

        用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至1.7±0.1,靜置2 min后,再用1.0 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)試樣溶液的pH至4.5±0.1,置于水浴超聲15 min,充分提取后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中用水定容至刻度,混勻后濾紙過濾,濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾至液相色譜進(jìn)樣瓶中,上機測定。

        1.6 液相色譜上機條件

        色譜柱:HiTrap Heparin肝素親和柱;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:50 μL;檢測波長:280 nm;流速:1.0 mL/min;流動相A:磷酸氫二鈉溶液;流動相B:磷酸氫二鈉-氯化鈉溶液。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

        乳鐵蛋白的線性變化范圍為:10 μg/mL ~200 μg/mL,線性回歸方程為Y=0.167 9X-1.063 4,相關(guān)系數(shù)0.999 5。見圖1和圖2。

        圖1 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

        圖2 乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.2 不同沉淀方法的加標(biāo)回收率比較

        在廠家提供的空白乳基奶粉中添加3 mg/100 g、20 mg/100 g和50 mg/100 g的乳鐵蛋白,用1.5中提到的5種方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,分別進(jìn)行六平行試樣,表1為不同沉淀方法的乳鐵蛋白加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)比較,色譜圖見圖3~圖7。

        表1 不同沉淀方法的乳鐵蛋白加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)比較

        圖3 磷酸沉淀法加標(biāo)樣品色譜圖

        圖4 三氯乙酸沉淀法加標(biāo)樣品色譜圖

        圖5 乙腈沉淀法加標(biāo)樣品色譜圖

        圖6 沉淀劑沉淀法加標(biāo)樣品色譜圖

        圖7 等電點沉淀法加標(biāo)樣品色譜圖

        磷酸調(diào)節(jié)pH沉淀法的加標(biāo)回收率在95.7%~102%之間,三氯乙酸沉淀法、有機試劑(乙腈)沉淀法、沉淀劑(亞鐵氰化鉀乙酸鋅)沉淀法結(jié)果均未檢出。等電點沉淀法回收率結(jié)果偏低,因此選擇磷酸沉淀法。

        2.3 檢出限與定量限

        在空白樣品中添加低濃度的乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,通過對儀器信噪比進(jìn)行分析,以信噪比約為3和10進(jìn)行評定檢出限和定量限。本方法中乳鐵蛋白的方法檢出限為1 mg/100 g,定量限為3 mg/100 g。

        2.4 不同基質(zhì)對乳鐵蛋白檢測的影響

        在市售產(chǎn)品中挑選了豆基奶粉、部分蛋白水解配方食品和米粉,向其添加1 mg/100 g、20 mg/100 g和50 mg/100 g的乳鐵蛋白,經(jīng)過磷酸沉淀處理上機,做六次平行實驗,表2為不同基質(zhì)下乳鐵蛋白加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)比較。

        從加標(biāo)回收率可以看出,該方法同時適用于豆基奶粉和米粉,但不適用于部分蛋白水解食品。

        2.5 實際樣品檢測

        隨機抽取市面上常見的額外添加乳鐵蛋白的嬰幼兒配方乳粉,經(jīng)過磷酸沉淀處理上機,檢測結(jié)果見表3。

        表2 不同基質(zhì)下乳鐵蛋白加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)比較

        表3 乳鐵蛋白測定結(jié)果表

        檢測結(jié)果表明,以上7種嬰幼兒配方乳粉的乳鐵蛋白標(biāo)簽值與實測值一致。

        3 結(jié)論

        本實驗比較了5種分離蛋白質(zhì)的方法對嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的測定結(jié)果的影響,其中,磷酸調(diào)節(jié)pH沉淀法的加標(biāo)回收率在85%~105%之間,精密度在10%以內(nèi),且準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好,但不適用于特殊醫(yī)學(xué)用途部分蛋白水解食品。三氯乙酸沉淀法、有機試劑(乙腈)沉淀法、沉淀劑(亞鐵氰化鉀乙酸鋅)沉淀法結(jié)果均未檢出。等電點沉淀法結(jié)果偏低,準(zhǔn)確度低,不適用于嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的檢測。

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