陳 妍， 裴碧紅， 王健澤， 丁同仁， 王 佳， 鄭詩琪，夏永軍， 艾連中， 王光強(qiáng)

上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院， 上海食品微生物工程技術(shù)研究中心， 上海 200093

益生菌是活的微生物，以適量的劑量給予宿主會(huì)對(duì)宿主健康產(chǎn)生有益影響[1]。目前人們通常會(huì)選擇含有益生菌的發(fā)酵食品和補(bǔ)充劑來預(yù)防一些生理疾病，這些益生菌可以定殖于腸道宿主黏膜或上皮[2,3]、免疫系統(tǒng)[4]并與本身微生物[5]密切相互作用，從而對(duì)宿主產(chǎn)生重要的影響。主要存在于奶類，肉類以及蔬菜發(fā)酵制品中的植物乳桿菌與人類的生活密切相關(guān)，可以寄居在人和動(dòng)物的口腔以及腸道中并發(fā)揮有益作用[6]。它們對(duì)宿主具有許多重要的功能，但是菌株發(fā)揮作用的先決條件就是首先能在胃腸道中存在并定殖。ZMORA N[7]等人分析了益生菌在小鼠以及人體腸道黏膜的定殖情況和規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的益生菌對(duì)腸道黏膜的定殖情況存在個(gè)體差異，對(duì)不同的宿主以及定殖位點(diǎn)都具有很大的差異。但目前關(guān)于益生菌在體內(nèi)的定殖機(jī)制尚不完全清楚，影響定殖的因素也未得到全面的闡述，因此揭示益生菌的定殖機(jī)制，已成為益生菌行業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題。

1 植物乳桿菌的生理功能

1.1 免疫調(diào)節(jié)作用

根據(jù)研究表明，植物乳桿菌表面的許多活性因子，如菌體表面的糖類和蛋白等都具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，定殖到腸道的上皮細(xì)胞后會(huì)刺激機(jī)體的免疫細(xì)胞進(jìn)而影響整個(gè)黏膜免疫系統(tǒng)的功能。PERDIGN等[8]研究飼喂L.plantarumCRL936后對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)這種植物乳桿菌可以誘導(dǎo)派爾集合淋巴結(jié) (Peyer’s patches)以及腸上皮中的免疫細(xì)胞，從而增強(qiáng)了宿主的免疫功能。蒙月月等[9]探討植物乳桿菌KLDS 1.0318對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)功能的影響，研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌KLDS 1.0318主要是通過促進(jìn)機(jī)體的特異性以及非特異性免疫功能來增強(qiáng)對(duì)宿主的免疫作用。這些研究都表明植物乳桿菌對(duì)免疫調(diào)節(jié)會(huì)起到一定的作用。

1.2 對(duì)致病菌有拮抗作用

最近的研究表明，植物乳桿菌可以產(chǎn)生不同的抗菌物質(zhì)，如有機(jī)酸、過氧化氫、雙乙酰、抗菌肽、細(xì)菌素等。其產(chǎn)生的有機(jī)酸包括乳酸和苯基乳酸，這些酸對(duì)致病性和腐敗微生物均具有很好的抗菌作用。ANUKAM等[10]從尼日利亞健康女性陰道中分離得到了具有對(duì)致病菌產(chǎn)生作用的植物乳桿菌，其主要產(chǎn)生作用的是菌體產(chǎn)生的表面活性劑如H2O2，這種物質(zhì)會(huì)抑制腸道和陰道致病菌的產(chǎn)生。LASH等[11]發(fā)現(xiàn)L.plantarumATCC 801的菌體表面會(huì)分泌一種細(xì)菌素，這種物質(zhì)可以有效的抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌的生長，產(chǎn)生一定的抑菌作用。因此合理的使用植物乳桿菌可以調(diào)整腸道內(nèi)菌群的關(guān)系，有效的抑制病原菌的生長，對(duì)人體健康產(chǎn)生有益作用。

1.3 降低血清膽固醇含量和預(yù)防心血管疾病

近年來許多研究都表明植物乳桿菌的使用可以有效的降低血清中膽固醇的含量，所以這類研究也受到了廣泛的關(guān)注。NGUYEN等[12]用L.plantarumPH04飼喂具有高脂血癥的小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)14 d后血清膽固醇和甘油三酯顯著降低，但是其食物攝入量、不同小鼠體重以及內(nèi)臟重量指數(shù)差異不顯著。KLAVER等[13]研究認(rèn)為，乳酸菌對(duì)膽固醇的降低作用主要是由于膽固醇在酸性條件下(pH < 6.0)會(huì)與膽鹽形成了沉淀，從而降低了培養(yǎng)基中膽固醇的含量。裘迪紅等[14]人從泡菜中分離獲得一株植物乳桿菌，并利用此菌發(fā)酵乳制品，研究發(fā)現(xiàn)其制備的發(fā)酵乳能有效的降低高脂小鼠肝臟和血清中的總膽固醇(TC)以及甘油三酯(TG)水平，調(diào)節(jié)促進(jìn)宿主健康。

1.4 其他生理功能

大量的研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌還具有很多其他的生理功能，如維持腸道內(nèi)菌群生態(tài)平衡、加快營養(yǎng)物質(zhì)吸收以及抑制腫瘤細(xì)胞的形成等。多種益生菌及其制劑已被用于研究誘導(dǎo)和維持潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的緩解，大腸桿菌Nissle1917和VSL#3已被證明對(duì)預(yù)防和治療輕中度潰瘍性結(jié)腸炎有顯著益處。伍靜等[15]在大麥發(fā)酵中添加乳酸菌進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵提取物(LFBE)可以誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的凋亡和裂解從而抑制人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖。因此研究植物乳桿菌具有重要的應(yīng)用價(jià)值以及廣闊的前景。

如今，消費(fèi)者對(duì)天然健康食品的需求日益增加，生物保護(hù)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。植物乳桿菌具有多種功能，能有效滿足消費(fèi)者的需要，也是研究的熱點(diǎn)。而黏附并定殖到腸黏膜被認(rèn)為是植物乳桿菌發(fā)揮作用的前提條件，因?yàn)槎ㄖ硶?huì)增加它們?cè)谀c道中的持久性，從而使益生菌發(fā)揮作用。

2 影響菌株在腸道定殖的主要因素

2.1 對(duì)碳源的利用能力

人類腸道中含有豐富的碳水化合物，這些碳源為不同的腸道菌群提供了多樣的營養(yǎng)位點(diǎn)，這些腸道菌群之間通過對(duì)有限碳源的競爭從而促進(jìn)其生長并形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的腸道微生態(tài)系統(tǒng)，并且碳源對(duì)腸道菌群也具有一定的調(diào)節(jié)作用。人類腸道菌群所編碼的關(guān)于多糖代謝相關(guān)的酶類遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人類自身基因組，從而證實(shí)了腸道菌具有強(qiáng)大的碳源利用能力，所以菌株可以利用腸道中有限的碳源也成為菌株存活并定殖的主要因素之一。

ZHANG等[16]發(fā)現(xiàn)LactobacillusfermentumYLF016對(duì)腸道細(xì)胞具有較強(qiáng)的黏附能力并可在腸道中長時(shí)間定殖，所以分析了菌株的全基因組并研究其益生菌特性，發(fā)現(xiàn)其編碼了較多的碳代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及適應(yīng)多樣性相關(guān)基因從而促使其具有良好的益生菌潛力。CHEN等[17]研究了LactobacillusreuteriWHH1689并揭示其益生菌功能相關(guān)基因，研究表明其富含編碼碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和酶、碳代謝途徑以及黏附能力的相關(guān)基因，從而促使其在人體腸道中定殖并在乳制品中廣泛應(yīng)用。目前為止，雖然沒有直接證據(jù)證明菌株對(duì)碳源的利用情況是否會(huì)影響其在腸道環(huán)境的定殖，但是有關(guān)研究結(jié)果表明能在腸道中定殖并發(fā)揮有益作用的菌株都具有相當(dāng)大的與碳代謝編碼的基因，為此提供了有力的間接證據(jù)，并且額外提供膳食多糖會(huì)對(duì)目標(biāo)菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用。

2.2 對(duì)胃腸道環(huán)境的抵抗力

大多數(shù)益生菌能夠黏附在腸道細(xì)胞上并在腸道環(huán)境中發(fā)揮不同的有益作用，其中發(fā)揮作用的有效程度取決于進(jìn)入腸道的活細(xì)胞數(shù)量，并且能夠在人類腸道中持續(xù)存在并存活。益生菌一般具有一定的抵抗胃液和腸液、膽汁和胰腺分泌物的能力，這有助于其在胃腸道中定殖。ZHAN等[18]研究了16個(gè)乳酸桿菌對(duì)模擬胃腸液的耐受能力發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌菌株 CCFM 737、CCFM 10、CCFM 634表現(xiàn)出對(duì)模擬胃腸汁的高耐受性，而且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的糞便樣品中這些菌株也顯示出它們具有相當(dāng)高的定殖水平，至少可以在體內(nèi)定殖兩周。JACOBSEN等[19]對(duì)47株乳酸菌的益生菌潛力進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)菌株在體內(nèi)的存活情況與pH的耐受性、黏附性以及體外抗菌特性有關(guān)，從而影響菌株定殖的持久性。

2.3 與其他菌群的競爭性

攝入人體的菌株可以通過產(chǎn)生代謝產(chǎn)物從而獲得定殖優(yōu)勢(shì)，并與其他病原菌進(jìn)行競爭，促使其定殖。有研究表明B.longum可以通過產(chǎn)生醋酸鹽來保護(hù)感染了大腸桿菌O157的腸道上皮細(xì)胞，而擬桿菌菌株能通過產(chǎn)生丙酸鹽而不改變宿主免疫途徑直接促使其能在沙門氏菌感染的腸道中獲得定殖能力[20]。MAO等[21]人通過研究乳酸菌小鼠腸道的定殖中發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的乳酸會(huì)明顯的改變小鼠腸道的pH，并對(duì)霍亂弧菌在腸道的定殖有顯著的抑制效果從而促使乳酸菌的定殖。TOSCANO M等人[22]研究了LactobacilluskefiriLKF01在不同人體腸道中的定殖情況并對(duì)本土菌群的影響，結(jié)果表明口服益生菌一個(gè)月后觀察到的乳桿菌數(shù)量增加而沙門氏菌、梭狀芽孢桿菌、鏈球菌等細(xì)菌屬顯著減少，從而間接反映了益生菌在腸道中的競爭性定殖。菌株產(chǎn)生的其他代謝物可能與宿主免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，如Reuri能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分化為免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并誘導(dǎo)IL-12[23]，這些均有可能影響細(xì)菌的定殖。

2.4 菌株黏附能力

植物乳桿菌在腸道中發(fā)揮生理功能的前提和基礎(chǔ)是其能在腸道中可以穩(wěn)定的黏附定殖。菌株可以定殖的前提條件是其在人體腸道中黏附并獲得相應(yīng)的生態(tài)位。菌株從體外黏附親和到體內(nèi)分子的相互作用的證據(jù)表明，菌株主要通過外層分子結(jié)構(gòu)，如外膜蛋白、菌毛、微毛和鞭毛等黏附在宿主細(xì)胞上，從而促進(jìn)細(xì)菌的定殖[24]。菌毛基因SpaC對(duì)鼠李糖乳桿菌在人體腸道黏液的結(jié)合至關(guān)重要[25]。而嗜酸乳桿菌NCFM 中編碼s層蛋白的SlpA基因失活會(huì)導(dǎo)致其對(duì)Caco-2細(xì)胞黏附減少，并改變其細(xì)胞形態(tài)[26]。KOS等[27]對(duì)嗜酸乳桿菌M92進(jìn)行研究，結(jié)果表明嗜酸乳桿菌M92的黏附能力與其自動(dòng)聚合能力之間存在相關(guān)關(guān)系，這也可能與細(xì)菌表面的蛋白有關(guān)。MACAS-RODRGUEZ等[28]人在乳酸菌BCS87中檢測(cè)到表面有兩種黏附蛋白，研究發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白對(duì)宿主-菌株相互作用至關(guān)重要，促進(jìn)了在豬腸道中的定殖。

益生菌在腸道中發(fā)揮生理功能的前提是其能定殖于腸道中。而我們綜述發(fā)現(xiàn)影響菌株定殖的因素很多，比如菌株的碳源利用能力、菌株抵抗胃腸道環(huán)境的能力以及黏附能力，這為益生菌株的體外篩選提供了理論依據(jù)。

3 植物乳桿菌在腸道中適應(yīng)性研究

益生菌經(jīng)常作為治療和改善胃腸道疾病的藥物，與其他藥劑不同的是它是活的微生物，可以在腸道中適應(yīng)并定殖從而長期對(duì)宿主發(fā)揮長久效應(yīng)[29]。益生菌在腸道定殖期間往往會(huì)發(fā)生自發(fā)的適應(yīng)性突變從而得到更好的定殖效果[30]。例如對(duì)碳源利用能力，酸性條件適應(yīng)以及對(duì)腸道免疫環(huán)境和離子環(huán)境的適應(yīng)能力等[31]，這為篩選定殖能力強(qiáng)的菌株提供了有效菌庫和有效方法。

3.1 對(duì)腸道中有限碳源的適應(yīng)性

在腸道中利用碳水化合物的能力是腸道微生物生長所必須的生理代謝過程。碳水化合物代謝為腸道共生體提供碳源和能量，促進(jìn)細(xì)菌在腸道內(nèi)的建立和存活。在雙歧桿菌中近14%的注釋基因編碼與碳水化合物代謝有關(guān)的酶[32]，其中兩歧桿菌是最能代謝人類來源多糖(黏蛋白)的菌種[33]，而參與處理黏蛋白來源的碳水化合物基因元件賦予了雙歧桿菌腸道定殖優(yōu)勢(shì)，成為人類早期生命中的先驅(qū)定殖者。其他雙歧桿菌種，包括長雙歧桿菌亞種、嬰兒和短雙歧桿菌也具有這種黏液蛋白降解能力和相關(guān)基因[34]。在乳酸菌中，腸道乳酸桿菌富含黏液結(jié)合蛋白[35]，從而具有更多樣化的碳水化合物代謝能力促進(jìn)其在體內(nèi)的定殖。

CHANG等[36]為了探究大腸桿菌在腸道中所需的營養(yǎng)物質(zhì)，構(gòu)建大腸桿菌突變菌株來來適應(yīng)小鼠腸道，研究表明只有糖代謝的相關(guān)突變會(huì)影響大腸桿菌在腸道中的豐度，而其他代謝途徑的相關(guān)突變沒有影響菌株在腸道中的存活能力，從而推測(cè)有關(guān)碳水化合物的利用能力是影響大腸桿菌在腸道中生存適應(yīng)的主要因素。在人體腸道中具有豐富的碳水化合物，為不同菌群的定殖繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì)，從而形成穩(wěn)定并多樣的腸道微生態(tài)系統(tǒng)。NATHAN[37]在哺乳動(dòng)物腸道中對(duì)益生菌候選菌株E.coliNissle的適應(yīng)性進(jìn)行研究，研究表明在低微生物組多樣性的背景下，對(duì)EcN的最大選擇壓力是碳源限制，腸道中的碳水化合物的可利用性驅(qū)動(dòng)了大腸桿菌Nissle在體內(nèi)的適應(yīng)性定殖，同時(shí)EcN通過代謝競爭其腸道生態(tài)位。目前，碳源對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用也已得到了廣泛的證實(shí)，但其是否起決定作用還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

3.2 對(duì)膽鹽和酸的適應(yīng)性

菌株在人體胃腸道定殖的前提是菌株要能腸道中存活，因此通常會(huì)具有一定膽鹽和酸的抵抗力，從而通過層層阻擾定殖于腸道中。HUANG等[38]研究了候選益生菌Lp082是如何在人和小鼠這兩種哺乳動(dòng)物宿主模型中通過獲得相關(guān)基因組的遺傳變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Lp082積累了調(diào)節(jié)鼠李糖利用和酸耐受性的單核苷酸突變，提高Lp082在宿主腸道中的存活率從而促進(jìn)了在體內(nèi)的定殖。KRUMBECK J A等[39]在L.reuri100-23中研究發(fā)現(xiàn)UREC基因的缺失會(huì)顯著降低了其生態(tài)適宜性，其中UREC基因編碼一種與耐酸有關(guān)的蛋白質(zhì)。SHEEHAN等[40]在B.breveUCC2003中表達(dá)了李斯特甜菜堿攝取系統(tǒng)(Betl)發(fā)現(xiàn)顯著提高了菌株對(duì)胃液的耐受性，并促使其具有更強(qiáng)的定殖能力。同樣，O’FLAHERTY S[41]發(fā)現(xiàn)膽鹽水解酶基因(L.acidophilusNCFM的bshA和L.johnsoniiNCK88的bshB)在大腸桿菌C600中的異源表達(dá)與對(duì)照大腸桿菌C600相比，在無菌小鼠糞便中的定殖量顯著增加。

3.3 對(duì)免疫環(huán)境的適應(yīng)

腸道作為消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵部位，也是宿主與外界環(huán)境相連的主要器官，但是其滲透性表層往往會(huì)使得病原微生物通過腸道并進(jìn)入人體，因此面對(duì)這些病原菌的侵襲腸道會(huì)激發(fā)出免疫反應(yīng)對(duì)這些病原菌進(jìn)行監(jiān)控和清除，來保護(hù)身體不受外界的侵害[42]。腸道免疫系統(tǒng)通過分泌黏液，抗菌物質(zhì)形成表面的物理屏障，同時(shí)腸道表皮下的免疫細(xì)胞通過吞唾、殺傷、抗體反應(yīng)及細(xì)胞因子等清除外來抗原及病原體[43]。腸道免疫系統(tǒng)在有效抵抗外來抗原以及致病菌的同時(shí)對(duì)腸道共生菌群保持免疫沉默。因此腸道菌群對(duì)腸道免疫系統(tǒng)的適應(yīng)能力是菌株在腸道中定殖的重要挑戰(zhàn)。

為了避免被腸道免疫反應(yīng)根除，益生菌菌株通常具有輕微(非促炎)的免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明植物乳桿菌胞外多糖降低菌株的免疫反應(yīng)[44]。LGG胞外多糖的突變株對(duì)多糖的黏附能力增加，但是在腸道中的定殖能力降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，變異株對(duì)腸道初始免疫因子如LL-37抗菌肽及補(bǔ)體的敏感性增加，說明菌體表面多糖可以保護(hù)菌株抵抗腸道免疫反應(yīng)，增加菌株在腸道中的定殖能力[45]。B.breveUCC2003胞外多糖增強(qiáng)了菌株對(duì)環(huán)境中酸和膽鹽的耐受性，對(duì)菌株在腸道中定殖無影響，但是會(huì)影響菌株在腸道中的駐留時(shí)間[40]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，多糖的突變?cè)黾恿司暝谛∈竽c道中的免疫反應(yīng)，這種免疫排斥可能是影響菌株在腸道中長期存在重要的原因[46]。

定殖較強(qiáng)的菌株往往具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力，有研究表明口服植物乳桿菌可以在人體的十二指腸誘導(dǎo)對(duì)免疫反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用的基因，而不會(huì)引起炎癥相關(guān)基因的誘導(dǎo)，也不會(huì)出現(xiàn)明顯的免疫細(xì)胞滲透[47]。因此菌株的適應(yīng)性研究應(yīng)考慮攝入菌株是否會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)以及與對(duì)本土微生物群的相互作用。

3.4 對(duì)腸道離子環(huán)境的適應(yīng)能力

腸道中的離子環(huán)境不同于體外培養(yǎng)的環(huán)境，腸液的緩沖能力、滲透壓、表面張力、pH等均會(huì)影響攝入菌株的定殖能力。而且這些因素對(duì)生物的代謝及活性都有重要的影響，并且某些金屬離子作為微生物酶的輔酶、信號(hào)分子等對(duì)其生存及活性存在至關(guān)重要作用。

有研究表明高滲透壓環(huán)境會(huì)促進(jìn)如Campylobacterjejuni生物膜的形成，促進(jìn)菌株在多種環(huán)境中生存并適應(yīng)[48]。SalmonellaentericaTat的變異菌株對(duì)表面活性劑及離子整合劑的耐受能力降低，從而對(duì)宿主的感染力及定殖能力降低[49]。因此腸道黏膜的離子環(huán)境的改變對(duì)菌株的存活以及定殖也具有重要的影響。

如何篩選獲得一株定殖能力強(qiáng)的菌株是一項(xiàng)繁瑣的工作，但是通過體內(nèi)的適應(yīng)性進(jìn)化，尤其的對(duì)于已經(jīng)具有益生功能的菌株，想提高其定殖能力，通過適應(yīng)性進(jìn)化，可獲得大量的突變菌株，進(jìn)而從此庫中定向篩選出定殖能力強(qiáng)的菌株，從而大大提高篩選效率。

4 展望

近些年來，人們?cè)絹碓疥P(guān)注到自身的身體健康。人體腸道菌群的研究成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，然而乳桿菌對(duì)人體發(fā)揮作用的第一步就是其能在腸道內(nèi)黏附并長時(shí)間定殖，研究了解菌株與機(jī)體之間的相互作用，可以預(yù)防致病菌的感染，評(píng)價(jià)和促進(jìn)菌株在腸道內(nèi)發(fā)揮益生效果等。因此，了解菌株在腸道中的定殖機(jī)制以及菌株的適應(yīng)性進(jìn)化方向?qū)σ嫔睦硇院Y選具有重要的指導(dǎo)意義。