李盛安何國成陳楠?jiǎng)⒄A黎小鵬
(1.中山市食品藥品檢驗(yàn)所,廣東 中山 528437;2.中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)所,廣東 中山 528437;3.中山市三鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站,廣東 中山 528463;4.中山市小欖鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,廣東 中山 528415)
大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(macrolide antibiotics,MALs)是一類重要的中譜抗菌化合物,養(yǎng)殖戶將其作為治療藥物使用,廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域。MALs抗生素對(duì)于革蘭氏陽性菌、支原體以及部分革蘭氏陰性菌有良好的抑制和殺滅作用[1];由于缺少科學(xué)用藥知識(shí),抗生素及其代謝物將殘留蓄積在動(dòng)物組織和器官內(nèi),如果人們長期食用殘留有MALs抗生素的畜禽或水產(chǎn)等,可造成前庭和耳蝸神經(jīng)的損害,導(dǎo)致眩暈和聽力減退,嚴(yán)重的會(huì)造成肝、腎損害[2]。水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中殘留的MALs抗生素不僅影響水生動(dòng)物生長,還會(huì)隨養(yǎng)殖尾水排放進(jìn)入下游流域繼續(xù)對(duì)下游水生動(dòng)物及水環(huán)境產(chǎn)生影響。
目前,國內(nèi)已有科研人員對(duì)動(dòng)物源性食品開展MALs抗生素的殘留檢測研究工作,大量文獻(xiàn)對(duì)畜禽中MALs抗生素探討與研究,而對(duì)水產(chǎn)領(lǐng)域的研究相對(duì)較少。常見的水產(chǎn)中MALs抗生素檢測方法有高效液相色譜法[3]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。魚肉含有蛋白質(zhì)、脂肪等各種大分子營養(yǎng)成分,樣品基質(zhì)較為復(fù)雜。由于檢測器的局限性可能會(huì)影響色譜峰的保留時(shí)間及峰型,MALs抗生素殘留采用色譜法配合紫外檢測器檢測無法準(zhǔn)確的定性定量。
早在20世紀(jì)80年代初,廣東省中山市水產(chǎn)養(yǎng)殖戶就成功培育出了脆肉鯇,經(jīng)過40a有余的技術(shù)摸索及經(jīng)驗(yàn)積累,已掌握一套成熟的養(yǎng)殖推廣技術(shù)。目前,脆肉鯇在中山市養(yǎng)殖規(guī)模近2000hm2,產(chǎn)品銷往國內(nèi)近30個(gè)城市及港澳地區(qū),脆肉鯇加工做成的美食深受人們喜愛。中山脆肉鯇現(xiàn)成為我國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品,每年為養(yǎng)殖戶增收超過2億元,脆肉鯇已成為中山市發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)主要支柱產(chǎn)業(yè)之一。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量規(guī)定》(GB 31650-2019)規(guī)定魚(皮加肉)中紅霉素(erythyomycin)殘留限量為200μg·kg-1,而其它MALs抗生素林可霉素(lincomycin)、竹桃霉素(oleadomycin)、替米考星(tilmicosin)、泰樂菌素(tylosin)、克拉霉素(clindamycin)、螺旋霉素(spiramycin)、吉他霉素(kitasamysin)、交沙霉素(josamycin)并未作出明確規(guī)定。由于各種MALs抗生素的分子結(jié)構(gòu)特征及藥物性質(zhì)相似,在預(yù)防治療水產(chǎn)疾病有異曲同工的作用??赡艽嬖诓环B(yǎng)殖戶使用大劑量的其它MALs抗生素而逃避監(jiān)管。因此,在中山市開展脆肉鯇中多種MALs抗生素殘留檢測具有重要的意義。
乙腈、甲醇(色譜純,色譜科公司);甲酸(色譜純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);PRIME HLB固相萃取柱(3mL,60mg,沃特世公司)、0.2μm尼龍針式過濾器(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。
電子天平(Precisa公司);搖床,IKA KS 501(德國IKA集團(tuán)公司);離心機(jī)Sigma 3-18KS(德國Sigma離心機(jī)有限公司);A10超純水純化系統(tǒng)(Millipore公司);超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀UHPLC-MS/MS(1290-6495)(安捷倫科技有限公司)。
林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克拉霉素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素混合標(biāo)準(zhǔn)品為天津阿爾塔科技有限公司。
色譜柱:Poroshell 120 EC-C18(2.1mm×100mm,2.7μm);進(jìn)樣量:5μL;柱溫:40℃;流動(dòng)相:A為0.1%的甲酸水溶液,B為甲醇溶液,流速為0.4mL·min-1;分離9種MALs抗生素的流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。
表1 9種MALs抗生素的流動(dòng)相洗脫梯度
電離方式:噴射流電噴霧電離AJSESI+;干燥氣溫度:200℃;干燥氣流速:17L·min-1;霧化器壓力:40psi;毛細(xì)管出口電壓:380V;鞘氣溫度:350℃;鞘氣流量:11L·min-1。監(jiān)測模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)采集方式;各抗生素組分離子對(duì)及碎裂電壓、碰撞能量及保留時(shí)間見表2,9種MALs抗生素多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖1。
定性,檢測時(shí)在同樣的條件下,樣品溶液中色譜峰的保留時(shí)間應(yīng)與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間一致,容許偏差在±5%以內(nèi),樣品溶液中的離子豐度比應(yīng)與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液的一致,容許偏差符合GB 31660.1-2019要求。定量方法采用內(nèi)標(biāo)法定量。
表2 9種MALs抗生素測定的色譜質(zhì)譜測定條件參數(shù)
脆肉鯇魚肉攪碎后稱取魚肉樣品10g于50mL具塞離心管中,加入適量替米考星D3內(nèi)標(biāo)工作液。加10mL乙腈水(v∶v/8∶2),擰好蓋子后放置搖床以300r·min-1震蕩混勻20min,以4500r·min-1離心5min。將上清液轉(zhuǎn)移直接過PRIME HLB 固相萃取柱(3cc,60mg),無需潤洗,以約1滴·s-1速度收集,棄去最開始的3~5滴濾液然后收集。準(zhǔn)確吸取5.0mL濾液,在40℃水浴氮吹至近干,加入1mL甲醇加水(v∶v/1∶1)溶液溶解,過0.2μm濾膜,供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析測定。同時(shí),做樣品空白試驗(yàn)。
考慮到魚肉中含有大量的蛋白質(zhì)及脂肪等大分子,在提取MALs抗生素時(shí)干擾物質(zhì)較多。實(shí)驗(yàn)對(duì)比乙腈、乙酸乙酯、1.0%甲酸甲醇、乙腈水(v∶v/8∶2)溶液4種提取液,分析上述4種提取液的加標(biāo)回收率,乙腈水(v∶v/8∶2)溶液提取效果相對(duì)優(yōu)于其他提取液。最終本文采用了乙腈水(v∶v/8∶2)溶液為提取液。
使用基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行外標(biāo)法定量,可以有效消除樣品基質(zhì)對(duì)抗生素組分的干擾。用不含MALs抗生素的魚肉空白基質(zhì)溶液稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)品,配制濃度分別為1.0μg·L-1、5.0μg·L-1、10.0μg·L-1、20.0μg·L-1、50.0μg·L-1、100.0μg·L-1的系列MALs基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入適量內(nèi)標(biāo)工作液,上機(jī)待測。以各抗生素組分與替米考星D3內(nèi)標(biāo)定量離子色譜峰面積比為縱坐標(biāo),相應(yīng)混標(biāo)溶液與內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)計(jì)算編制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以各抗生素組分的特征離子色譜峰10倍信噪比(S/N>10)為方法定量限,線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)r2及各組分定量限見表3。9種MALs抗生素在1~100μg·L-1范圍內(nèi)線性回歸方程呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999,9種MALs抗生素的定量限為1.0μg·kg-1,能滿足日常脆肉鯇水產(chǎn)品中9種MALs抗生素殘留監(jiān)測的需要。
圖1 9種MALs抗生素特征離子質(zhì)量色譜圖
表3 9種MALs抗生素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限
稱取不含MALs抗生素的魚肉于50mL具塞離心管中,添加1ng·mg-1、2ng·mg-1、10ng·mg-1的9種MALs抗生素進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),添加MALs抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后擰緊蓋子4℃放置過夜,每個(gè)濃度同時(shí)進(jìn)行6個(gè)樣品的平行實(shí)驗(yàn)。按照前處理方法分析測試。結(jié)果表明,9種MALs抗生素的加標(biāo)回收率在79.8%~110%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.53%~17.9%,方法具有較好的精密度和回收率。
采用本文建立的檢測方法對(duì)中山市脆肉鯇養(yǎng)殖魚塘中36個(gè)魚肉樣品(其中小欖鎮(zhèn)26個(gè)、西區(qū)5個(gè)、港口鎮(zhèn)5個(gè))進(jìn)行測定,9種MALs抗生素均未檢出。
表4 魚肉中9種MALs抗生素的平均加標(biāo)回收率與精密度
本文建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中多種MALs抗生素殘留的監(jiān)測方法。該方法具有分析時(shí)間短、操作簡單、定性準(zhǔn)確高及檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB 31660.1-2019)包括9種大環(huán)內(nèi)酯類藥物檢測方法,但標(biāo)準(zhǔn)的分析時(shí)間較長。本文對(duì)前處理提取液進(jìn)行優(yōu)化,選擇合適的色譜柱將9種MALs抗生素各組分分離,并優(yōu)化了質(zhì)譜測定條件,能在7min的檢測時(shí)間內(nèi)有效分離9種MALs抗生素,大大縮短了分析時(shí)間,提高了檢測效率,能滿足日常大批量監(jiān)測的需要。