李盛安何國成陳楠劉正華黎小鵬

(1.中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437；2.中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗所，廣東 中山 528437；3.中山市三鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站，廣東 中山 528463；4.中山市小欖鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，廣東 中山 528415)

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(macrolide antibiotics，MALs)是一類重要的中譜抗菌化合物，養(yǎng)殖戶將其作為治療藥物使用，廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域。MALs抗生素對于革蘭氏陽性菌、支原體以及部分革蘭氏陰性菌有良好的抑制和殺滅作用[1]；由于缺少科學(xué)用藥知識，抗生素及其代謝物將殘留蓄積在動物組織和器官內(nèi)，如果人們長期食用殘留有MALs抗生素的畜禽或水產(chǎn)等，可造成前庭和耳蝸神經(jīng)的損害，導(dǎo)致眩暈和聽力減退，嚴重的會造成肝、腎損害[2]。水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中殘留的MALs抗生素不僅影響水生動物生長，還會隨養(yǎng)殖尾水排放進入下游流域繼續(xù)對下游水生動物及水環(huán)境產(chǎn)生影響。

目前，國內(nèi)已有科研人員對動物源性食品開展MALs抗生素的殘留檢測研究工作，大量文獻對畜禽中MALs抗生素探討與研究，而對水產(chǎn)領(lǐng)域的研究相對較少。常見的水產(chǎn)中MALs抗生素檢測方法有高效液相色譜法[3]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。魚肉含有蛋白質(zhì)、脂肪等各種大分子營養(yǎng)成分，樣品基質(zhì)較為復(fù)雜。由于檢測器的局限性可能會影響色譜峰的保留時間及峰型，MALs抗生素殘留采用色譜法配合紫外檢測器檢測無法準確的定性定量。

早在20世紀80年代初，廣東省中山市水產(chǎn)養(yǎng)殖戶就成功培育出了脆肉鯇，經(jīng)過40a有余的技術(shù)摸索及經(jīng)驗積累，已掌握一套成熟的養(yǎng)殖推廣技術(shù)。目前，脆肉鯇在中山市養(yǎng)殖規(guī)模近2000hm2，產(chǎn)品銷往國內(nèi)近30個城市及港澳地區(qū)，脆肉鯇加工做成的美食深受人們喜愛。中山脆肉鯇現(xiàn)成為我國國家地理標志產(chǎn)品，每年為養(yǎng)殖戶增收超過2億元，脆肉鯇已成為中山市發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)主要支柱產(chǎn)業(yè)之一。我國《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量規(guī)定》(GB 31650-2019)規(guī)定魚(皮加肉)中紅霉素(erythyomycin)殘留限量為200μg·kg-1，而其它MALs抗生素林可霉素(lincomycin)、竹桃霉素(oleadomycin)、替米考星(tilmicosin)、泰樂菌素(tylosin)、克拉霉素(clindamycin)、螺旋霉素(spiramycin)、吉他霉素(kitasamysin)、交沙霉素(josamycin)并未作出明確規(guī)定。由于各種MALs抗生素的分子結(jié)構(gòu)特征及藥物性質(zhì)相似，在預(yù)防治療水產(chǎn)疾病有異曲同工的作用?？赡艽嬖诓环B(yǎng)殖戶使用大劑量的其它MALs抗生素而逃避監(jiān)管。因此，在中山市開展脆肉鯇中多種MALs抗生素殘留檢測具有重要的意義。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

乙腈、甲醇(色譜純，色譜科公司)；甲酸(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)；PRIME HLB固相萃取柱(3mL，60mg，沃特世公司)、0.2μm尼龍針式過濾器(天津市津騰實驗設(shè)備有限公司)。

電子天平(Precisa公司)；搖床，IKA KS 501(德國IKA集團公司)；離心機Sigma 3-18KS(德國Sigma離心機有限公司)；A10超純水純化系統(tǒng)(Millipore公司)；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀UHPLC-MS/MS(1290-6495)(安捷倫科技有限公司)。

林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克拉霉素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素混合標準品為天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18(2.1mm×100mm,2.7μm)；進樣量：5μL；柱溫：40℃；流動相：A為0.1%的甲酸水溶液，B為甲醇溶液，流速為0.4mL·min-1；分離9種MALs抗生素的流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 9種MALs抗生素的流動相洗脫梯度

電離方式：噴射流電噴霧電離AJSESI+；干燥氣溫度：200℃；干燥氣流速：17L·min-1；霧化器壓力：40psi；毛細管出口電壓：380V；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：11L·min-1。監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)采集方式；各抗生素組分離子對及碎裂電壓、碰撞能量及保留時間見表2，9種MALs抗生素多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖見圖1。

1.3 定性與定量

定性，檢測時在同樣的條件下，樣品溶液中色譜峰的保留時間應(yīng)與混合標準溶液的保留時間一致，容許偏差在±5%以內(nèi)，樣品溶液中的離子豐度比應(yīng)與濃度接近的標準溶液的一致，容許偏差符合GB 31660.1-2019要求。定量方法采用內(nèi)標法定量。

表2 9種MALs抗生素測定的色譜質(zhì)譜測定條件參數(shù)

1.4 樣品提取和凈化

脆肉鯇魚肉攪碎后稱取魚肉樣品10g于50mL具塞離心管中，加入適量替米考星D3內(nèi)標工作液。加10mL乙腈水(v∶v/8∶2)，擰好蓋子后放置搖床以300r·min-1震蕩混勻20min，以4500r·min-1離心5min。將上清液轉(zhuǎn)移直接過PRIME HLB 固相萃取柱(3cc，60mg)，無需潤洗，以約1滴·s-1速度收集，棄去最開始的3～5滴濾液然后收集。準確吸取5.0mL濾液，在40℃水浴氮吹至近干，加入1mL甲醇加水(v∶v/1∶1)溶液溶解，過0.2μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀分析測定。同時，做樣品空白試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 魚肉前處理提取方法的選擇

考慮到魚肉中含有大量的蛋白質(zhì)及脂肪等大分子，在提取MALs抗生素時干擾物質(zhì)較多。實驗對比乙腈、乙酸乙酯、1.0%甲酸甲醇、乙腈水(v∶v/8∶2)溶液4種提取液，分析上述4種提取液的加標回收率，乙腈水(v∶v/8∶2)溶液提取效果相對優(yōu)于其他提取液。最終本文采用了乙腈水(v∶v/8∶2)溶液為提取液。

2.2 線性回歸方程及檢出限

使用基質(zhì)配制標準溶液建立標準曲線對樣品進行外標法定量，可以有效消除樣品基質(zhì)對抗生素組分的干擾。用不含MALs抗生素的魚肉空白基質(zhì)溶液稀釋配制標準品，配制濃度分別為1.0μg·L-1、5.0μg·L-1、10.0μg·L-1、20.0μg·L-1、50.0μg·L-1、100.0μg·L-1的系列MALs基質(zhì)混合標準溶液，加入適量內(nèi)標工作液，上機待測。以各抗生素組分與替米考星D3內(nèi)標定量離子色譜峰面積比為縱坐標，相應(yīng)混標溶液與內(nèi)標的濃度比為橫坐標計算編制標準曲線，以各抗生素組分的特征離子色譜峰10倍信噪比(S/N>10)為方法定量限，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)r2及各組分定量限見表3。9種MALs抗生素在1～100μg·L-1范圍內(nèi)線性回歸方程呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999，9種MALs抗生素的定量限為1.0μg·kg-1，能滿足日常脆肉鯇水產(chǎn)品中9種MALs抗生素殘留監(jiān)測的需要。

圖1 9種MALs抗生素特征離子質(zhì)量色譜圖

表3 9種MALs抗生素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.3 方法回收率和精密度

稱取不含MALs抗生素的魚肉于50mL具塞離心管中，添加1ng·mg-1、2ng·mg-1、10ng·mg-1的9種MALs抗生素進行回收率實驗，添加MALs抗生素混合標準溶液后擰緊蓋子4℃放置過夜，每個濃度同時進行6個樣品的平行實驗。按照前處理方法分析測試。結(jié)果表明，9種MALs抗生素的加標回收率在79.8%～110%，相對標準偏差在4.53%～17.9%，方法具有較好的精密度和回收率。

2.4 實際樣品的測定

采用本文建立的檢測方法對中山市脆肉鯇養(yǎng)殖魚塘中36個魚肉樣品(其中小欖鎮(zhèn)26個、西區(qū)5個、港口鎮(zhèn)5個)進行測定，9種MALs抗生素均未檢出。

表4 魚肉中9種MALs抗生素的平均加標回收率與精密度

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中多種MALs抗生素殘留的監(jiān)測方法。該方法具有分析時間短、操作簡單、定性準確高及檢出限低等優(yōu)點。標準《食品安全國家標準 水產(chǎn)品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB 31660.1-2019)包括9種大環(huán)內(nèi)酯類藥物檢測方法，但標準的分析時間較長。本文對前處理提取液進行優(yōu)化，選擇合適的色譜柱將9種MALs抗生素各組分分離，并優(yōu)化了質(zhì)譜測定條件，能在7min的檢測時間內(nèi)有效分離9種MALs抗生素，大大縮短了分析時間，提高了檢測效率，能滿足日常大批量監(jiān)測的需要。