魯云風(fēng)，張四普，張征田，牛佳佳，楊永鋒

（1.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽 473061；2.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所，河南 鄭州 450002；3.河南伏牛山生物科技股份有限公司，河南 南陽 474350）

獼猴桃含有豐富的氨基酸、VC、鈣等物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)及保健價值[1-2]。獼猴桃果酒以獼猴桃果實(shí)為原料，經(jīng)酵母等微生物發(fā)酵而成，風(fēng)味獨(dú)特，深受人們的喜愛[3-4]。但由于目前使用的酵母基本是針對葡萄酒的生產(chǎn)工藝特點(diǎn)而開發(fā)出來的釀酒活性干酵母或葡萄酒酵母[5]，具有明顯針對性，在其他果酒的生產(chǎn)中效果并不顯著[6]，獼猴桃果酒的特有風(fēng)味不突出，因此亟待選育出適于獼猴桃果酒發(fā)酵的專用酵母。常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變以安全高效、操作簡便，并且正突變率較高、突變株遺傳穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)勢在菌種選育等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[7-9]。

本研究以從多年野生獼猴桃樹下土壤中分離得到了一株生香酵母X-5作為出發(fā)菌株，對其進(jìn)行反復(fù)多次ARTP誘變，篩選發(fā)酵性能優(yōu)良且遺傳穩(wěn)定的酵母菌株，并通過控制酵母接種量、發(fā)酵溫度和初始pH值進(jìn)行獼猴桃果酒的工藝條件優(yōu)化，以期為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)獼猴桃果酒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

徐香獼猴桃選自內(nèi)鄉(xiāng)縣獼猴桃合作社；白砂糖、檸檬酸、酒石酸鉀：市售；偏重亞硫酸鉀、果膠酶：法國萊蒙特集團(tuán)；出發(fā)菌株為實(shí)驗(yàn)室篩選的葡萄園有孢漢遜酵母X-5[10]。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計（TU-1810）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；手持糖度計（PAL-1）：日本ATAGO（愛拓）中國分公司；單人雙面凈化臺（SW-CJ-1F）：江蘇蘇中凈化設(shè)備有限公司；立式實(shí)驗(yàn)室高壓壓力滅菌器（LDZM-40KCS）：上海申安醫(yī)療器械廠；pH計（PHSJ-3F）：上海雷磁儀器有限公司；ARTP-2誘變育種儀：北京艾德豪克國際技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）、獼猴桃果汁培養(yǎng)基、沃勒斯坦實(shí)驗(yàn)室（wallerstein laboratory，WL）瓊脂培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基依據(jù)文獻(xiàn)[11]配制。

1.3.2 ARTP誘變

將菌種接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)13h，菌液用無菌水洗滌2次～3次，稀釋至OD600nm為0.6～0.8，取菌液分別誘變 0、30、60、90、120 s，用無菌水適當(dāng)稀釋后涂布于YPD平板，28℃培養(yǎng)24 h后菌落計數(shù)，參考文獻(xiàn)[12]所述方法，依據(jù)下式計算出每個處理的致死率，繪制致死率曲線。根據(jù)菌種致死率確定最適誘變時間。

根據(jù)致死率曲線，挑取致死率80%以上的誘變時間的單菌落平板劃線培養(yǎng)（28℃）；挑選WL培養(yǎng)基上生長良好的菌株，菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)活化后接入YPD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24h后，將菌液接入裝有獼猴桃汁的三角瓶中，接種量為8%，28℃培養(yǎng)發(fā)酵8d，每天稱重一次，測定菌株發(fā)酵力、酒液的殘?zhí)呛?、VC含量、酒精度和香味等。以野生型酵母（X-5）為對照，綜合評定篩選出發(fā)酵性能、產(chǎn)香能力等較好的獼猴桃釀酒酵母。

1.3.3 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將復(fù)篩得到的突變株Y-5在初篩斜面培養(yǎng)基中28℃連續(xù)傳代8次，液態(tài)發(fā)酵測定傳代后菌株CO2失重量、酒液的殘?zhí)?、VC含量、酒精度和香氣強(qiáng)弱。

1.3.4 獼猴桃果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]，固定初始糖度為240 g/kg，分別考察不同菌株Y-5接種量（6%、8%、10%、12%、14%）、不同初始 pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、不同發(fā)酵溫度（10、20、25、30、35℃）條件下，發(fā)酵時間 7 d后所制備獼猴桃果酒的VC含量和酒精度。

1.3.4.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)因素及水平見表1。發(fā)酵結(jié)束后測定各發(fā)酵瓶中發(fā)酵液酒精度、VC含量作為正交試驗(yàn)指標(biāo)。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 分析檢測方法

以天平稱量CO2失重量來測定菌株發(fā)酵力，通過CO2失重法比較各菌株的發(fā)酵能力[14]。

采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的規(guī)定方法測定糖含量（以還原糖計）、VC含量；采用GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》規(guī)定方法檢測酒精度；采用嗅聞法判斷產(chǎn)香情況[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變

2.1.1 ARTP誘變時間

按1.3.2方法對X-5菌株進(jìn)行ARTP法誘變，結(jié)果見圖1。

圖1 菌株X-5誘變致死曲線Fig.1 Mutagenic lethal curve of strain X-5

由圖1可知，誘變處理60 s時，菌株X-5致死率為86.13%，能產(chǎn)生足夠突變，且有一定數(shù)量的存活菌體，從而實(shí)現(xiàn)ARTP法高效誘變，故確定ARTP誘變時間為60 s。

2.1.2 酵母菌的篩選

選擇6株生長較好的誘變后菌株和野生型酵母X-5做發(fā)酵力測試，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同菌株發(fā)酵時CO2失重變化曲線Fig.2 Variation curve of weight loss of CO2during fermentation by different strains

由圖2可見，6株誘變后菌株均于第2天達(dá)到最高的發(fā)酵速率，第4天后Y-5菌株發(fā)酵速率高于其他菌株水平；野生型菌株X-5發(fā)酵速率明顯低于其他菌株發(fā)酵速率，Y-5菌株在第2天發(fā)酵速率稍低，但在后期的發(fā)酵過程中其發(fā)酵速率較高，優(yōu)于大多數(shù)的菌株。8 d后測定菌種發(fā)酵力（CO2總失重量）、發(fā)酵液殘?zhí)呛?、酒精度、VC含量及香氣強(qiáng)弱，結(jié)果如表2所示。

表2 不同菌株的發(fā)酵指標(biāo)Table 2 Fermentation indexes of different strains

由表2可知，6株突變菌株CO2總失重量、殘?zhí)呛途凭鹊戎笜?biāo)均優(yōu)于野生型菌株X-5，其中突變菌株Y-5綜合評定最佳，產(chǎn)香力強(qiáng)，性能優(yōu)于野生型，發(fā)酵力比野生型X-5高50.98%，可用于后繼試驗(yàn)。

2.1.3 遺傳穩(wěn)定性分析

將復(fù)篩得到的突變株在初篩斜面培養(yǎng)基中于28℃連續(xù)傳代8次，發(fā)酵獼猴桃汁測定傳代后菌株發(fā)酵性能及產(chǎn)香能力如表3所示。

表3 菌株Y-5的發(fā)酵指標(biāo)Table 3 Fermentation indexes of strain Y-5

菌株經(jīng)過8次傳代并進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，其發(fā)酵性能和產(chǎn)香能力差別不大，結(jié)果表明突變株Y-5具有較好的遺傳穩(wěn)定性，發(fā)酵性能好，產(chǎn)香能力強(qiáng)，可以用于獼猴桃果酒發(fā)酵。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

酵母接種量對獼猴桃果酒的VC含量及酒精度的影響如圖3所示。

圖3 酵母接種量對獼猴桃果酒VC含量及酒精度的影響Fig.3 Effect of yeast inoculation amount on VClevel and alcohol content of kiwifruit wine

從圖3可以看出，隨著酵母接種量的增加，獼猴桃果酒VC含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這和周元等[13]研究結(jié)果一致，當(dāng)酵母接種量大于8%時，果酒VC含量和酒精度逐漸下降，原因可能在于隨著酒精度的升高抑制了酵母的繁殖和活性[16]，另外過高的酵母濃度加速了酵母衰老死亡，為此，本研究選定8%為最佳酵母接種量。

發(fā)酵溫度對獼猴桃果酒VC含量及酒精度的影響見圖4所示。

圖4 發(fā)酵溫度對獼猴桃果酒VC含量和酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on VClevel and alcohol content of kiwifruit wine

從圖4可以看出，隨著發(fā)酵溫度的上升，果酒發(fā)酵速度加快，酒精度快速增加，但是較高的溫度會導(dǎo)致VC的損失，酒精度升高也會抑制酵母繁殖[16]，因此，當(dāng)發(fā)酵溫度高于25℃后，VC含量和酒精度逐漸下降。另外，過低、過高的溫度均不利于果酒香氣及口感[17]。為此綜合考慮選定最佳發(fā)酵溫度為25℃。

發(fā)酵初始pH值對獼猴桃果酒VC含量及酒精度的影響如圖5所示。

圖5 發(fā)酵初始pH值對獼猴桃果酒VC含量和酒精度的影響Fig.5 Effect of initial pH on VClevel and alcohol content of kiwifruit wine

從圖5可以看出，VC含量及酒精度隨著pH值變大呈現(xiàn)先緩慢上升后下降的趨勢，當(dāng)pH值為3.5時，VC含量和酒精度最高。宋淑紅[18]研究發(fā)現(xiàn)較低的初調(diào)pH值更有利于蘋果酒到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)，何晨等[19]認(rèn)為過低或過高pH值會影響發(fā)酵速率，劉沁源等[20]研究發(fā)現(xiàn)初始pH值過低或過高均會影響果酒的風(fēng)味與品質(zhì)，為此本研究選定最佳初始pH值為3.5。

2.2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以菌株Y-5接種量、發(fā)酵溫度、初始pH值為影響因素，以酒精度和VC含量為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計對獼猴桃果酒發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)的結(jié)果及分析分別見表4和表5，指標(biāo)為酒精度和VC含量的正交試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果方差分析分別見表6和表7。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計方案Table 4 The design scheme of orthogonal experimental

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果分析Table 5 Analysis of the results of orthogonal experimental design

表6 指標(biāo)為酒精度的正交試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果方差分析Table 6 Analysis of variance of results of orthogonal experimental design with alcohol content as index

表7 指標(biāo)為VC含量的正交試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果方差分析Table 7 Analysis of variance of results of orthogonal experimental design with VCcontent as index

采用綜合平衡法確定獼猴桃果酒工藝條件最優(yōu)方案。從表5極差分析可以看出，空列極差在兩個指標(biāo)分析里均為最小，說明可以不考慮因素間的交互作用；以酒精度為指標(biāo)，因素主次順序?yàn)锳（菌株Y-5接種量）＞B（發(fā)酵溫度）＞C（初始pH值），最優(yōu)方案為A2B2C2；以VC含量為指標(biāo)，因素主次順序?yàn)锽（發(fā)酵溫度）＞C（初始pH值）＞A（酵母接種量），最優(yōu)方案為B1C2A2；從表6和表7方差分析來看，初始pH值對VC含量影響不顯著，從表5可見，以VC含量為指標(biāo)，B因素1水平和2水平差別不大，另外B因素選擇1水平（20℃）更有力于節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本和能源消耗。因此，綜合上述分析，確定正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A2B1C2，即最佳獼猴桃果酒生產(chǎn)工藝條件是菌株Y-5接種量8%，發(fā)酵溫度20℃，初始pH值為3.5。采用該工藝條件發(fā)酵后的獼猴桃果酒呈微黃帶綠色，果香、酒香濃郁優(yōu)雅，酒精度為11.23%vol，VC含量為0.411 g/L，綜合評價優(yōu)于正交試驗(yàn)表中方案，因此確定獼猴桃百香果果酒工藝條件為A2B1C2。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用自然發(fā)酵法，將野生型菌株X-5誘變后，篩選出誘變菌株Y-5，性能優(yōu)于野生型，發(fā)酵力、酒精度和VC含量分別比野生型高50.98%、11.15%和17.68%。以Y-5為發(fā)酵菌株，以VC含量和酒精度為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化其發(fā)酵條件，并經(jīng)過方差分析，得到最佳工藝條件為菌株Y-5接種量8%，發(fā)酵溫度20℃，發(fā)酵初始pH值為3.5。試驗(yàn)誘變后的菌株Y-5發(fā)酵力高于野生型酵母，發(fā)酵后果酒的典型性強(qiáng)，具有一定的經(jīng)濟(jì)前景和推廣價值。