馬驥，李芳，林俊泓，刁洋娟，易華山,，胡庭俊*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2.重慶市大足區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 大足 402360；3.重慶納比微特檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，重慶 榮昌 402460；4.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460)

藍(lán)舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的蟲媒病毒，由庫(kù)蠓(Culicoides)等節(jié)肢動(dòng)物傳播，主要感染反芻動(dòng)物(牛、羊、鹿等)，導(dǎo)致藍(lán)舌病(Bluetongue，BT)，多表現(xiàn)為亞臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)引起口唇發(fā)紺、出血、潰瘍、面部水腫等，以綿羊病癥重且死亡率較高[1, 2]。BTV的成熟病毒粒子為二十面體對(duì)稱的圓形無(wú)囊膜(Non-enveloped)顆粒，基因組由雙鏈RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)組成，共10條分節(jié)段的dsRNA編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-NS4、NS3a、NS5)[3-5]。NS4由編碼VP6的Segment-9中的重疊ORF編碼，長(zhǎng)度為77～79個(gè)氨基酸且基本不隨血清型的變化而變化，存在亮氨酸拉鏈(Leucine zipper)與驅(qū)動(dòng)核定位的氨基酸殘基[3]。NS4在BTV感染細(xì)胞的胞漿與胞核中均表達(dá)，并與細(xì)胞質(zhì)中的脂滴和核仁存在共定位，還能與dsRNA結(jié)合使其不被脫氧核糖核酸酶降解[4]。NS4并不是BTV復(fù)制所必需的，但缺失NS4的BTV-8在綿羊體內(nèi)的毒力減弱[6]。針對(duì)感染BTV NS4缺失突變株的轉(zhuǎn)錄組分析表明，與野生型相比，BTV NS4缺失突變株中與IFN通路相關(guān)的102個(gè)基因上調(diào)，是一種干擾素通路的拮抗劑[6]。目前，針對(duì)BTV NS4拮抗IFN機(jī)制的研究主要包括構(gòu)建BTV NS4缺失株的轉(zhuǎn)錄組分析或拮抗IFN信號(hào)通路蛋白與BTV NS4的作用靶點(diǎn)等[6,7]。研究表明，NS4以劑量依賴的方式損害IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，雖然其單獨(dú)表達(dá)不影響IFN激活的STAT1的磷酸化，但NS4與NS3的共表達(dá)可能發(fā)揮協(xié)同作用而調(diào)控STAT1磷酸化、二聚化等[7,8]。

多克隆抗體(polyclonal antibody, pAb)是針對(duì)多種抗原決定簇的多種抗體的混合物，相比單克隆抗體而言，pAb也具有制備周期短、成本及技術(shù)技能低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，并且pAb能識(shí)別多個(gè)抗原表位而具有良好的特異性[9]。本課題組在前期對(duì)BTV NS4真核表達(dá)拮抗宿主天然免疫的機(jī)制進(jìn)行了研究[10]，在此基礎(chǔ)上，為深入研究BTV NS4重組蛋白免疫原性，本研究進(jìn)一步對(duì)融合蛋白pET-32a-NS4純化后，免疫新西蘭大白兔制備多克隆融合抗體，為研究BTV NS4蛋白的功能及基于BTV NS4檢測(cè)方法研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

免疫用新西蘭大白兔由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，NS4蛋白由筆者純化保存?zhèn)溆茫?6孔板(9017，美國(guó)Costar)。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購(gòu)于Sigma公司；Blue Plus?Protein Marker(14-160 kD)購(gòu)自全式金生物公司；氯化鈉(NaCl)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H20)等常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。低溫高速離心機(jī)(Allegra X-30R，美國(guó)BECKMAN)、多功能酶標(biāo)儀(TECAN Infinite 200 PRO，瑞士/TECAN)，其他儀器設(shè)備由重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程中心提供。

1.2 重組蛋白的純化及鑒定

取在最佳誘導(dǎo)條件下(37 ℃，0.8 mmol/L IPTG，6h)誘導(dǎo)的菌液各20 mL，3 000 r/min離心5 min后，保留沉淀；1×PBS重懸后，超聲裂解0.5 h；4 000 r/min離心10 min(4 ℃)以分離上清液及沉淀；上清液在0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后，作為對(duì)照備用。利用低壓層析系統(tǒng)，將破碎后的上清溶液加入(流速為0.5 mL/min)Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA Sepharose Cl-6B親和層析柱，直至流出液的OD280值到達(dá)基線。用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH 8.0)以1 mL/min流速?zèng)_洗，直至流出液OD280值到達(dá)基線。使用Ni-IDA Elution-Buffer(250 mM咪唑，其余與Washing-Buffer相同)以1 mL/min的流速洗脫目標(biāo)蛋白，并收集流出物，透析過(guò)夜，收集透析液進(jìn)行SDS-PAGE(12%)分析。孵育一抗THETM His Tag鼠源單克隆抗體孵育2 h；二抗HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶3 000)孵育1 h；PBST洗滌后觀察結(jié)果。

1.3 包涵體蛋白pET-32a-NS4的復(fù)性與濃度測(cè)定

在最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)表達(dá)的pET-32a-NS4，通過(guò)離心之后加入15 mL的裂解液，并將其置于冰水混合物中進(jìn)行超聲破碎。破碎后，在4 ℃ 14 000 r/min離心20 min后取沉淀。使用包涵體洗滌液(20 mM Tris，1 mM EDTA，2 M尿素，1 M NaCl，1% Triton X-100，pH 8.0)清洗包涵體3次；溶解緩沖液(20 mM Tris，5 mM DTT，8 M尿素，pH 8.0)溶解包涵體，4 ℃過(guò)夜；4 ℃，14 000 r/min離心15 min；將上述溶液滴加到20 mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、pH 8.0緩沖液中，逐漸倍數(shù)稀釋并慢慢拌混，將蛋白溶液置入透析袋于20 mM Tris-HCl、0.15 M NaCl、pH 8.0溶液中透析過(guò)夜。重組蛋白pET-32a-NS4濃度按照BCA方法測(cè)定試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度。

1.4 NS4多克隆抗體的制備

將純化的BTV NS4蛋白與完全弗氏佐劑等體積混合充分乳化，于新西蘭兔背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫，每只 200 μg。首免后第15、30 天用相同劑量與等量弗氏不完全佐劑乳化后加強(qiáng)免疫 2 次。三免后第 14天從心臟采血，血液在 37 ℃靜置 3 h 后，置于4 ℃析出血清，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〔糠质褂肊LISA方法檢測(cè)NS4蛋白的效價(jià)，如果效價(jià)大于預(yù)期(1∶50 000)，則可進(jìn)行血清收集。

1.5 抗體純化與鑒定

將NS4蛋白和瓊脂糖凝膠偶聯(lián)制作為抗原親和提純層析純化，用PBS(pH=7.4)稀釋NS4蛋白抗原，混勻后在96孔板中每一個(gè)孔內(nèi)依次加入100 μL，包被過(guò)夜；棄去包被液，PBST 洗3次，200 μL/孔。在濾紙上輕輕拍干后，每孔加入200 μL封閉液，37 ℃封閉1 h；棄去內(nèi)液，PBST 洗1次，200 μL/孔;將待測(cè)血清稀釋后加入板中，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，PBST 洗3次，200 μL/孔。山羊抗兔-HRP(1∶50 000)稀釋后，在黑暗環(huán)境下每孔中加入100 μL，37 ℃避光孵育1 h。取出酶標(biāo)板，棄去內(nèi)液，PBST 洗3次，200 μL/孔。每孔先加入100 μL TMB顯色液，37 ℃避光顯色15 min。每孔加入100 μL HCl(1 M)溶液，終止反應(yīng)，波長(zhǎng)為450 nm測(cè)定OD值。以O(shè)D450值>0.3且P/N>1.2判斷兔血清產(chǎn)生效價(jià)的判定條件，利用BCA濃度測(cè)定試劑盒對(duì)純化的抗體進(jìn)行濃度測(cè)定及SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)純化的抗體。

1.6 重組蛋白與多克隆抗體Western blot鑒定

將pET-32a-NS4表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，碎冰中200 mA恒流轉(zhuǎn)膜40 min，加入封閉液4 ℃封閉過(guò)夜。先用His單克隆抗體(1∶2 000)稀釋或用本課題組制備的NS4多克隆抗體(1∶1 000)與純化的重組蛋白，4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗6次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(二抗)以1∶3 000比例稀釋，室溫孵育1 h，PBST洗6次，顯影，使用超高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀FUSION FX-XT分析重組蛋白。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白pET-32a-NS4的純化鑒定

為獲得純度較高的重組蛋白，將pET-32a-NS4破碎后分離上清和沉淀，沉淀經(jīng)Ni柱親和純化后SDS-PAGE電泳顯示目的條帶大小約27 kD(圖1)。

A，M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET-32a空載體未誘導(dǎo)；2：pET-32a-NS4誘導(dǎo)后；3：pET-32a-NS4誘導(dǎo)破碎后上清；4：pET-32a-NS4誘導(dǎo)破碎后沉淀；B，1-8：純化洗脫樣品。

2.2 純化后的重組蛋白鑒定

重組蛋白pET-32a-NS4經(jīng)Ni柱親和純化后，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在27 kD間有蛋白條帶(圖2A)。經(jīng)Western blot鑒定有相同大小蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2B)。

A，M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：0.5 mg/mL BSA；2：純化后樣品；B，M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：純化后樣品。

2.3 抗體鑒定

設(shè)定的P/N判定值>1.2，通過(guò)ELISA檢測(cè)NS4抗體效價(jià)在1∶512 000以上(圖3)。按照BCA濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定純化后的抗體濃度為1.0 mg/mL，體積為12 mL。

圖3 pET-32a-NS4重組蛋白免疫后抗體效價(jià)

對(duì)純化的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色后，僅見(jiàn)到單條的55 kD抗體重鏈，表明所得抗體的純度較高，并且通過(guò)灰度分析純化后的抗體純度大于85%(圖4)。以最終獲得的12 mL純化抗體，除去損耗，乘以相應(yīng)的純度，純化抗體得率達(dá)到8.0 mg以上。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：抗體純化分析。

2.4 重組蛋白的Western blot分析

結(jié)果如圖5所示，在27 kD處可見(jiàn)目的條帶，與預(yù)期大小一致，表明純化NS4蛋白多克隆抗體與pET-32a-NS4重組蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)。

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：空白對(duì)照；2：0.8 mmol/L誘導(dǎo)6 h產(chǎn)物；3：上清蛋白；4：沉淀蛋白。

3 討論

BTV NS4作為藍(lán)舌病病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，在拮抗宿主細(xì)胞IFN反應(yīng)與BTV的免疫逃避中發(fā)揮重要的功能[6]。本課題組在前期研究中對(duì)BTV NS4進(jìn)行了序列分析，并發(fā)現(xiàn)BTV NS4在HEK-293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)顯著下調(diào)仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β基因mRNA表達(dá)[10, 11]。目前，李一經(jīng)等[12，13]對(duì)25型BTV VP2和VP7蛋白進(jìn)行單克隆抗體的制備研究。張國(guó)芮等[14，15]對(duì)BTV VP6和VP7蛋白進(jìn)行多克隆抗體的制備。張璐及張國(guó)芮等[16，17]利用pET-30a表達(dá)BTV NS1截短蛋白及 NS2蛋白進(jìn)行了多克隆抗體的制備研究；車永軍等[18]對(duì)BTV NS3進(jìn)行截短表達(dá)與多克隆抗體的制備研究，為建立基于結(jié)構(gòu)蛋白的ELISA檢測(cè)方法及其基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。而B(niǎo)TV NS4基因在不同血清型BTV氨基酸序列高度保守，是病毒早期感染的診斷靶標(biāo)[3, 6]。

目前，在動(dòng)物病毒性疾病監(jiān)測(cè)、凈化中，急需基于病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的ELISA檢測(cè)方法，以鑒別野毒感染和疫苗免疫抗體。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)構(gòu)建的BTV NS4原核表達(dá)載體pET-32a-NS4在37 ℃，0.8 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)6h，超聲破碎裂解菌體后，純化的融合蛋白pET-32a-NS4，免疫新西蘭大白兔，成功獲得BTV NS4多克隆抗體，效價(jià)在1∶512 000以上，具有較好的特異性反應(yīng)，對(duì)進(jìn)一步研究BTV NS4基因功能及建立基于非結(jié)構(gòu)蛋白的ELISA檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。