張國(guó)華，金振華，張備，王麗坤，薛沾枚，海龍，張艷，劉雪松，南景東，沈思思，呂明哲

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

近年，致病性大腸桿菌引起的羔羊腹瀉給養(yǎng)羊業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，具有致病性的大腸桿菌會(huì)引起畜禽以及人類腹瀉等臨床癥狀，當(dāng)發(fā)病較嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起腦膜炎等疾病，嚴(yán)重地?fù)p害了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)利益[1]。目前，治療該類疾病主要的辦法就是使用抗生素進(jìn)行治療，但由于長(zhǎng)期不科學(xué)用藥，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的問題日益嚴(yán)峻[2]。細(xì)菌耐藥性不僅僅是獸醫(yī)臨床的關(guān)注重點(diǎn)，醫(yī)學(xué)及環(huán)境學(xué)也越來越重視這方面的問題[3]，羊源致病性細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的報(bào)道越來越常見。為了加強(qiáng)齊齊哈爾市羊源耐藥性大腸桿菌的檢測(cè)和分析，保證養(yǎng)殖場(chǎng)以及養(yǎng)殖戶更合理的用藥，本研究對(duì)齊齊哈爾市某羊場(chǎng)發(fā)生的致病性大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，檢測(cè)7種治療羔羊腹瀉常用抗生素的耐藥情況，并對(duì)其耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，為更好地防控致病性大腸桿菌引起羔羊腹瀉提供理論依據(jù)，以減少或避免濫用藥的現(xiàn)象，更好地防控該病。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)菌株

齊齊哈爾市某羊場(chǎng)飼養(yǎng)70只綿羊，其中5只羔羊發(fā)生腹瀉，采集1只腹瀉嚴(yán)重的羔羊糞便進(jìn)行細(xì)菌分離，質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922。

1.1.2試驗(yàn)試劑

MH、麥康凱、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基以及血平板購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。ExTaq、Marker(trans2k)購(gòu)自TaKaRa。細(xì)菌基因組提取試劑盒(50次)購(gòu)自天根生化科技有限公司。藥敏片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。DNA引物由吉林庫美合成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌的分離及鑒定

將腹瀉羔羊的糞便涂抹在血平板、麥康凱、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)約24 h。對(duì)培養(yǎng)出的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，確定細(xì)菌形態(tài)特征。

1.2.2生化試驗(yàn)

完成細(xì)菌分離和鑒定后可根據(jù)細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征初步判定為何種細(xì)菌，然后根據(jù)不同細(xì)菌的特性選擇生化管，在無菌環(huán)境下進(jìn)行相應(yīng)操作。

1.2.316SrDNA鑒定

將細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取1 mL菌液12 000 r/min 離心10 min，保留200 μL液體按照天根細(xì)菌DNA提取說明書進(jìn)行操作，獲得的DNA使用16S rDNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行合成[4]。16S-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S-R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，片段長(zhǎng)度1 465 bp。將陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，得到長(zhǎng)度約1 465 bp的特異性條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物送至吉林庫美測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.4小鼠致病性試驗(yàn)

將分離純化的細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)菌制備為濃度108 CFU/mL的菌液，細(xì)菌注射根據(jù)文獻(xiàn)[5]，取小鼠8只，分為兩組，試驗(yàn)組與對(duì)照組各4只，試驗(yàn)組接種0.5 mL制備好的菌液，對(duì)照組接種等量的液體培養(yǎng)基，觀察兩組小鼠是否發(fā)生異常。

1.2.5藥敏試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)根據(jù)美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)(2017)推薦的K-B紙片法進(jìn)行操作[6]。將培養(yǎng)的菌落于MH肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后，使用比濁儀將菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，將菌液均勻地涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基表面，然后將藥敏片貼至適當(dāng)?shù)奈恢茫?6 h后觀察藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6耐藥基因的檢測(cè)

分離純化得到的大腸桿菌在血液瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行3次傳代后，將純化的菌落使用MH肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后，取1 mL菌液12 000 r/min 離心10 min，保留200 μL液體按照天根細(xì)菌DNA提取說明書進(jìn)行操作，取適量的DNA應(yīng)用于6對(duì)耐藥基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)大腸桿菌主要的6種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，耐藥基因引物序列參照文獻(xiàn)[7-9]，引物如表1所示。

表1 耐藥基因序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離及鑒定

腹瀉羔羊糞便中分離到的細(xì)菌在血平板上進(jìn)行培養(yǎng)有溶血現(xiàn)象發(fā)生，菌落光滑、濕潤(rùn)、微微隆起。在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為粉紅色菌落，伊紅美藍(lán)生長(zhǎng)為黑色具有金屬光澤的菌落。革蘭氏染色的結(jié)果顯示該類細(xì)菌為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢。形態(tài)學(xué)符合大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)大腸桿菌的生化性質(zhì)選定了13種生化試劑進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表2，結(jié)果顯示檢測(cè)的指標(biāo)符合大腸桿菌的生化特性。

表2 大腸桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 16S rDNA鑒定結(jié)果

按照革蘭氏陰性菌的標(biāo)準(zhǔn)提取菌液DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為1 465 bp的特異性條帶，脫氧核糖核苷酸序列結(jié)果在GenBank進(jìn)行對(duì)比顯示與大腸桿菌菌株NC_054923.1同源性高達(dá)99.15%。PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

M：DNA Marker DL2000；陰性對(duì)照；陽性對(duì)照為質(zhì)控?cái)U(kuò)增結(jié)果；1:試驗(yàn)菌株。

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠注射大腸桿菌24 h后全部死亡，對(duì)照組小鼠未見異常。剖檢試驗(yàn)組小鼠，肝臟腫大壞死，進(jìn)行細(xì)菌分離以及16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示，分離到的細(xì)菌與本次分離到的大腸桿菌序列一致。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，可以看出，該株致病性大腸桿菌對(duì)頭孢噻肟、頭孢他定耐藥，對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星中介，對(duì)氨芐西林、慶大霉素、阿米卡星敏感。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

耐藥基因結(jié)果見圖2，對(duì)分離到的致羔羊腹瀉的菌種進(jìn)行6種耐藥基因的檢測(cè)，檢出EBC耐藥基因，未檢出其他耐藥基因。表明本次分離得到的致病性羊源大腸桿菌攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因。

M：DNA Marker DL2000；陰性對(duì)照；1:試驗(yàn)菌株EBC基因擴(kuò)增條帶。

3 結(jié)果與討論

β-內(nèi)酰胺類藥物是抗生素家族中的一大類，常見且比較具有代表性的藥物為青霉素、頭孢類藥物等[10]。這類藥物作用機(jī)制均是抑制細(xì)菌的胞壁粘肽合成酶，即青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)，從而阻礙細(xì)胞壁粘肽合成，使細(xì)菌胞壁缺損，菌體膨脹裂解。人類及動(dòng)物沒有細(xì)胞壁，不受β-內(nèi)酰胺類藥物的影響，因而這類藥物對(duì)細(xì)菌具有選擇性的殺滅作用，對(duì)機(jī)體的毒性較小，副作用比較少，十分適合獸醫(yī)臨床使用[11]。但隨著抗生素的應(yīng)用越來越廣泛，存在著大量的不科學(xué)用藥，濫用藥的現(xiàn)象也越來越多，導(dǎo)致很多細(xì)菌出現(xiàn)了耐藥性，不利于獸醫(yī)臨床疾病的治療[12]。大腸桿菌作為一種常見的致病菌，當(dāng)其產(chǎn)生致病性時(shí)會(huì)引起受到感染的對(duì)象發(fā)生腹瀉、惡心、頭疼等不適癥狀，嚴(yán)重者可能會(huì)危及生命。本研究分離到的致病性大腸桿菌具有一定的致病力，會(huì)使羔羊產(chǎn)生非常嚴(yán)重的腹瀉，如不能得到有效的治療會(huì)出現(xiàn)死亡，經(jīng)過藥敏試驗(yàn)等篩選出敏感性較高的藥物氨芐西林對(duì)患病羔羊進(jìn)行治療，腹瀉狀況得到改善，并在5 d后痊愈?？茖W(xué)用藥不僅可以減少不必要的經(jīng)濟(jì)損失，提高治療效率，還可以盡量避免或減少耐藥性的出現(xiàn)。

本次分離的致病性大腸桿菌攜帶EBC耐藥基因，說明該種大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有一定的耐藥性。細(xì)菌產(chǎn)AmpC酶是近年來繼ESBLs之后出現(xiàn)的一種革蘭氏陰性菌抗β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機(jī)制[13]。EBC型是該酶基因的一種分型，這類酶可以分解頭孢類抗生素和單酰胺類抗生素，并且不會(huì)被目前臨床上的β-內(nèi)酰胺酶類抑制劑所抑制，因此，如在獸醫(yī)臨床上發(fā)現(xiàn)該類耐藥細(xì)菌出現(xiàn)，治療起來十分復(fù)雜[14]。不同地區(qū)、不同物種來源的致病性大腸桿菌攜帶的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢出情況有所差異，但總體來說耐藥情況十分明顯，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害很大[15-19]。

細(xì)菌對(duì)抗生素類藥物的耐藥性問題引起了越來越多的關(guān)注，這個(gè)問題也給抗生素在畜牧業(yè)臨床中的使用帶來了很大的困難。細(xì)菌的耐藥性是由多重因素之間相互作用而引起的，隨著人們研發(fā)越來越多種類的抗生素，耐藥問題可能暫時(shí)緩解，但隨之而來的是由于使用藥物種類的增多，耐藥菌的種類也越來越多，因此，研究細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制至關(guān)重要，是未來解決耐藥問題的一個(gè)重要方向[20]。由于耐藥問題，我們要采用科學(xué)的方法進(jìn)行治療，首先要了解細(xì)菌的耐藥性，精準(zhǔn)科學(xué)用藥；其次對(duì)于耐藥的細(xì)菌以及耐藥基因，要研發(fā)新型藥物以便應(yīng)用于臨床；再次使用藥物的劑量要合適，不可以過度用藥也不能不按照療程進(jìn)行治療；最關(guān)鍵的是用藥的時(shí)候講究用藥方法，避免出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。在日常飼養(yǎng)過程中要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做到以下幾點(diǎn)可更好地降低疾病的發(fā)生，從而避免出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象：第一，關(guān)注畜禽的養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生，注意要定期清理圈舍，定期消毒圈舍環(huán)境以及使用的器具；第二，增加畜禽的營(yíng)養(yǎng)水平，采用全價(jià)飼料，在日糧中添加維生素、益生菌等有益于提高畜禽免疫力的物質(zhì)；第三，對(duì)獸醫(yī)臨床中傳染性疾病做好免疫接種，制訂合理的免疫計(jì)劃；第四，當(dāng)發(fā)生疫病的時(shí)候，要采取科學(xué)的方法進(jìn)行治療，不可濫用藥物。相信通過采取合理的用藥方案以及科學(xué)的飼養(yǎng)管理，可以避免或降低細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)[21]。

本次試驗(yàn)從羔羊腹瀉樣本中分離出一株致病性大腸桿菌，并通過藥敏試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該株大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，攜帶EBC耐藥基因。該細(xì)菌對(duì)頭孢噻肟、頭孢他定耐藥，對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星中介，對(duì)阿米卡星、慶大霉素、氨芐西林敏感。本次試驗(yàn)結(jié)果為該羊場(chǎng)治療羔羊腹瀉提供了科學(xué)的用藥依據(jù)。