何 柳， 曾 琳， 顧雅坤， 符 麗(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， ?？?570311)

全世界龍血樹屬植物約227種[1]，我國(guó)6種，分布于云南、廣西、海南、臺(tái)灣等省份[2]。海南龍血樹(DracaenacambodianaPierre ex Gagnep.)為天門冬科(Asparagaceae)龍血樹屬(Dracaena)喬木狀常綠植物[3]，是我國(guó)中藥資源龍血竭的基原物種之一[4]。野生資源在中國(guó)僅分布于海南島西南山區(qū)和南部沿海地區(qū)，常生長(zhǎng)于石灰?guī)r和花崗巖的石縫中[5]，其分泌的紅色樹脂含豐富的黃酮類、皂苷、茋類、甾醇等化合物[6-9]，常用于止血、鎮(zhèn)痛、消炎、活血、化瘀、生肌、斂瘡等[10-12]。海南龍血樹生長(zhǎng)緩慢，喜陽(yáng)耐旱[13]，且樹形優(yōu)美，具有較高的觀賞價(jià)值，是盆栽以及園林綠化的重要樹種，也是制作盆景的好素材[14-15]。由于具有重要的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[13,16]，而導(dǎo)致海南龍血樹被過(guò)度采挖，其生境遭受嚴(yán)重破壞，野生種群急劇減少[5,17]，種群自然更新能力下降而不能更新復(fù)壯[5]，因此野生海南龍血樹在中國(guó)已瀕臨滅絕[18]，目前被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)野生保護(hù)植物[19]。

超低溫保存一般是指在-196 ℃的超低溫條件下使保存材料的細(xì)胞物質(zhì)代謝及生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎停止，以達(dá)到長(zhǎng)期保存材料的一門生物學(xué)技術(shù)[20]，是離體保存與低溫生物學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物[21]。在超低溫條件下，調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞代謝的各類酶活性受到嚴(yán)重的抑制，生命活動(dòng)接近停止[22]。但其細(xì)胞仍具活性且不會(huì)發(fā)生遺傳物質(zhì)改變，從而達(dá)到長(zhǎng)期穩(wěn)定地保存植物種質(zhì)資源及珍貴實(shí)驗(yàn)材料的目的[23-24]。超低溫保存研究最早可追溯至19世紀(jì)后期[25]。1976年，Bajaj[26]發(fā)現(xiàn)經(jīng)液氮處理的胡蘿卜和煙草細(xì)胞懸浮液可培育出再生植株，此發(fā)現(xiàn)引起人們對(duì)超低溫保存領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，隨后此技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物種子、花粉、離體培養(yǎng)的莖尖、愈傷組織等材料的保存[27-33]，其中以種子形式進(jìn)行超低溫保存操作簡(jiǎn)單[34]。種子材料進(jìn)行超低溫保存的關(guān)鍵在于找出最佳含水量范圍[35]，而最佳含水量范圍因植物種類和種子脂質(zhì)含量不同而往往有所差異[36-37]。如降香黃檀種子超低溫保存最適含水量為12.35%[28]，馬尾松種子為6.10%[38]，白木香種子為7.35%[39]，荊芥種子為3%[40]。

海南龍血樹種子在低溫(4 ℃)貯藏短時(shí)間內(nèi)能有效解除休眠而保持較高的發(fā)芽率，但貯藏110 d后種子的萌發(fā)率開始下降[41]。目前對(duì)海南龍血樹種質(zhì)資源長(zhǎng)期穩(wěn)定保存的方法仍未見報(bào)道。為了能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定保存海南龍血樹種質(zhì)資源，對(duì)其種子超低溫保存的最適含水量和最佳冷凍方式進(jìn)行探索。本試驗(yàn)將不同含水量的海南龍血樹種子進(jìn)行超低溫保存后測(cè)定其發(fā)芽率和生理生化活性，并通過(guò)石蠟切片觀察超低溫保存對(duì)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，探索海南龍血樹種子超低溫保存的最適含水量和最佳保存方法，為海南龍血樹種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

成熟的海南龍血樹種子采自海南省萬(wàn)寧大洲島，由國(guó)家南藥基因資源庫(kù)提供，原始含水量為38.72%，原始發(fā)芽率為52.22%，保存于4 ℃冰箱備用。選取乳白色、沒(méi)有霉點(diǎn)的種子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.1獲取不同含水量的海南龍血樹種子

將海南龍血樹種子放在無(wú)水硅膠中干燥6 h、14 h、36 h、50 h、80 h，獲得含水量分別為31.46%、27.05%、13.05%、6.00%、4.40%的種子，以備后續(xù)試驗(yàn)。含水量的測(cè)定參照《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，選用高恒溫烘干法，130 ℃烘干1 h。

1.2.2測(cè)定海南龍血樹種子超低溫保存發(fā)芽情況

將不同含水量的種子分別用玻璃化冷凍法、分步冷凍法、直接冷凍法進(jìn)行超低溫保存24 h。其中玻璃化法超低溫保存是用裝載液LS溶液(每升MS溶液中含2 mol甘油和0.4 mol蔗糖)于25 ℃浸泡處理種子20 min，再用玻璃化保護(hù)溶液PVS2(每升MS溶液中含30%甘油、0.4 mol蔗糖、15%聚乙二醇和15%二甲亞砜)冰浴處理種子30 min，換上預(yù)冷新鮮的PVS2后迅速投入液氮中進(jìn)行超低溫保存；分步冷凍法超低溫保存是用玻璃化保護(hù)溶液PVS2在4 ℃下處理種子30 min，再轉(zhuǎn)移至-20 ℃冰箱中冷凍處理1 h，取出后迅速投入液氮中進(jìn)行超低溫保存24 h；直接冷凍法超低溫保存是將種子直接投入液氮中進(jìn)行超低溫保存24 h。

將種子從液氮中取出，40 ℃水浴解凍2 min，其中玻璃化冷凍法和分步冷凍法超低溫保存的海南龍血樹種子用US洗滌溶液(每升MS溶液中含1.2 mol蔗糖)洗滌10 min，無(wú)菌水浸泡3次，每次2 min；直接冷凍法超低溫保存的海南龍血樹種子解凍后，用無(wú)菌水清洗3次，每次2 min。擦干種子表面水分，接種在無(wú)菌濾紙上，用無(wú)菌水濕潤(rùn)濾紙，放進(jìn)人工氣候培養(yǎng)箱中23～26 ℃、光照8 h培養(yǎng)，發(fā)芽后開始統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.3測(cè)定海南龍血樹種子生理生化活性

對(duì)未經(jīng)超低溫處理(含水量為38.72%、31.46%、27.05%、13.05%、6.00%)和經(jīng)直接冷凍法超低溫處理(含水量為6.00%)的海南龍血樹種子進(jìn)行生理生化活性測(cè)定，用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量[42]，淀粉酶試劑盒(試劑盒為南京建成生物工程研究所淀粉酶試劑盒C 016，碘-淀粉比色法)測(cè)定α-淀粉酶活性，硫代巴比妥酸測(cè)定MDA含量[43]，氮藍(lán)四唑測(cè)定SOD活性[43]，愈創(chuàng)木酚測(cè)定POD活性[43]，H2O2測(cè)定CAT活性[44]。

1.2.4海南龍血樹種子石蠟切片觀察

將直接冷凍法超低溫保存前后的海南龍血樹種子(含水量為38.72%、16.42%、6.00%)分別制成石蠟切片。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)為單因子試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)用SPPS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行Ducan法分析，用Microsoft Excel制圖。

2 結(jié) 果

2.1 含水量對(duì)海南龍血樹種子超低溫保存的影響

如表1所示，對(duì)不同含水量的種子分別進(jìn)行玻璃化冷凍、分步冷凍、直接冷凍超低溫處理，其發(fā)芽率在一定含水量范圍內(nèi)，隨著含水量的降低而顯著升高。當(dāng)種子含水量較高時(shí)，3種超低溫法處理均不發(fā)芽；種子含水量降至6.00%時(shí)，直接冷凍組發(fā)芽率最高，為73.89%，此時(shí)，3種冷凍法的發(fā)芽率差異不顯著，均高于對(duì)照組；含水量繼續(xù)降至4.40%，所有處理的種子發(fā)芽率顯著下降。本試驗(yàn)中，6.00%含水量下3種超低溫保存方法處理的種子發(fā)芽率差異不顯著，但以直接冷凍法為最佳，能節(jié)約保存成本、縮短入庫(kù)時(shí)間，初步得出，含水量6.00%、直接冷凍法為海南龍血樹種子超低溫保存的最適含水量和最佳冷凍方式。

表1 含水量對(duì)海南龍血樹種子超低溫保存發(fā)芽率的影響Table 1 Effects of seeds moisture content on seed germination rate of Dracaena cambodiana after ultra-cryopreservation

2.2 含水量對(duì)海南龍血樹種子生理生化活性的影響

基于初步結(jié)果海南龍血樹種子超低溫保存的最適含水量為6.00%，對(duì)含水量為38.72%、31.46%、27.05%、13.05%、6.00%的海南龍血樹種子進(jìn)行生理生化活性測(cè)定，探索含水量降至6.00%時(shí)對(duì)種子生理生化活性的影響。結(jié)果如圖1，隨著含水量的降低，種子的CAT活性和POD活性呈“N”型的變化趨勢(shì)；含水量為6.00%時(shí)，表現(xiàn)出較高的CAT活性和POD活性，均差異顯著；含水量為13.05%時(shí)，CAT活性、POD活性最低；SOD活性隨著含水量降低緩慢下降，直至含水量為6.00%時(shí)達(dá)到最低；MDA含量隨含水量的降低先緩慢增加后快速升高，含水量為38.72%時(shí)含量最低，6.00%時(shí)達(dá)到最高；α-淀粉酶活性與MDA類似，隨著含水量的降低呈直線式升高，含水量為38.72%時(shí)α-淀粉酶活性最低，6.00%時(shí)達(dá)到最高。

注：不同小寫字母表示不同含水量下海南龍血樹種子生理生化活性差異顯著(p<0.05)。圖1 含水量對(duì)海南龍血樹種子生理生化活性的影響Fig.1 Effects of seeds moisture content on physiological and biochemical of Dracaena cambodiana seeds

2.3 直接冷凍超低溫對(duì)含水量6.00%的海南龍血樹種子生理生化活性的影響

最適含水量(6.00%)的海南龍血樹種子經(jīng)最佳超低溫保存方法(直接冷凍法)處理后，對(duì)其生理生化活性進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照為未經(jīng)超低溫處理的含水量6.00%的海南龍血樹種子。如表2所示，超低溫保存后的種子POD活性較對(duì)照組顯著下降，CAT活性、SOD活性、MDA含量、α-淀粉酶活性和蛋白質(zhì)含量與對(duì)照相比差異不顯著。

表2 直接冷凍超低溫保存對(duì)海南龍血樹種子生理生化的影響Table 2 Effects of direct freezing method on physiological and biochemical characteristics of Dracaena cambodiana seeds

2.4 海南龍血樹種子石蠟切片觀察

將直接冷凍法超低溫保存前后含水量為38.72%、16.42%、6.00%的海南龍血樹種子，分別制成石蠟切片，觀察超低溫保存前后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。如圖2所示，當(dāng)含水量為38.72%時(shí)，對(duì)照組(未經(jīng)超低溫保存處理)種子細(xì)胞完整，細(xì)胞質(zhì)未收縮，細(xì)胞壁清晰；直接冷凍組細(xì)胞壁破碎，細(xì)胞質(zhì)溶出，細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷。當(dāng)含水量為16.42%時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞壁清晰，細(xì)胞質(zhì)輕微收縮；直接冷凍組大部分細(xì)胞完整，細(xì)胞壁清晰，細(xì)胞質(zhì)輕微收縮，而少部分細(xì)胞損傷，細(xì)胞壁不清晰，未見細(xì)胞質(zhì)溶出。當(dāng)含水量為6.00%時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞壁清晰，細(xì)胞質(zhì)收縮；直接冷凍法組細(xì)胞均完整，細(xì)胞壁清晰，細(xì)胞質(zhì)收縮，少見細(xì)胞損傷，與對(duì)照組形態(tài)相比變化輕微。從石蠟切片結(jié)果中可得出，較低含水量更適合海南龍血樹種子超低溫保存。

注：a、b、c分別為含水量38.72%、16.42%和6.00%對(duì)照組；A、B、C分別為含水量38.72%、16.42%和6.00%直接冷凍法超低溫保存組。圖2 超低溫保存對(duì)海南龍血樹種子細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響(×40)Fig.2 Effects of ultra-cryopreservation on cell structure of seeds of Dracaena cambodiana(×40)

3 結(jié)論與討論

含水量是種子進(jìn)行超低溫長(zhǎng)期穩(wěn)定保存的關(guān)鍵因素，過(guò)高或過(guò)低都會(huì)降低種子超低溫保存成活率[45]。本研究中，含水量6.00%比其他含水量種子超低溫保存后發(fā)芽率顯著高，表明適宜的含水量有利于種子進(jìn)行超低溫保存，這與商麗煌[34]，宋紅等[46]的研究結(jié)果一致。超低溫保存方法對(duì)種子冷凍后的成活率有一定的影響，不同的冷凍方法通過(guò)不同途徑避免細(xì)胞內(nèi)自由水形成冰晶，從而減少細(xì)胞在冷凍過(guò)程中受到傷害[34,47]。張曉寧等[48]，曾琳等[28]，顧雅坤等[47]通過(guò)比較超低溫常用的保存方法，發(fā)現(xiàn)馬尾松種子、降香黃檀種子、九里香種子的最佳冷凍方式分別為直接冷凍法、玻璃化冷凍法、分步冷凍法。本研究中，6.00%含水量的海南龍血樹種子經(jīng)玻璃化冷凍、分步冷凍、直接冷凍3種超低溫保存方法處理的發(fā)芽率差異不顯著，但直接冷凍法超低溫能有效節(jié)約試驗(yàn)成本、試驗(yàn)時(shí)間[27]。

細(xì)胞的存活狀態(tài)可通過(guò)觀察其細(xì)胞結(jié)構(gòu)是否完整來(lái)判斷[34,49]。試驗(yàn)中，從石蠟切片中觀察到，經(jīng)直接冷凍超低溫保存的種子，隨著含水量逐漸降低，種子抗凍能力相應(yīng)提高，細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷情況得到減緩。經(jīng)冷凍處理的高含水量種子，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的破壞，導(dǎo)致喪失萌發(fā)能力；當(dāng)含水量降低至6.00%時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)上只有輕微變形，種子萌發(fā)能力未受到影響，這與發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。表明種子適當(dāng)脫水能在超低溫保存后獲得較高的存活率[34]。

植物受到脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的活性氧[50]。MDA在細(xì)胞內(nèi)積累會(huì)損害細(xì)胞膜，其含量可衡量細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度[51]。CAT、POD、SOD能清除活性氧以保護(hù)細(xì)胞膜不受損傷[50]。α-淀粉酶能為種子萌發(fā)生長(zhǎng)提供能量[52]。試驗(yàn)中，未經(jīng)超低溫保存的種子隨著含水量的降低，α-淀粉酶活性呈上升的變化趨勢(shì)，α-淀粉酶活性升高有助于種子萌發(fā)，與發(fā)芽檢測(cè)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。MDA含量隨含水量的降低呈上升的變化趨勢(shì)，說(shuō)明脫水過(guò)程刺激種子產(chǎn)生了活性氧，導(dǎo)致MDA含量積累；MDA會(huì)抑制細(xì)胞保護(hù)酶的活性，降低抗氧化物的含量，與SOD活性隨含水量的降低呈現(xiàn)下降的變化趨勢(shì)結(jié)果一致。隨著含水量的降低，過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶總體上呈上升的變化趨勢(shì)，13.05%前變化不大，含水量降至6.00%時(shí)，脫水刺激導(dǎo)致活性氧增加，同時(shí)脫水脅迫又促使細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶大量升高來(lái)清除活性氧以減少細(xì)胞膜的受損程度。試驗(yàn)中，經(jīng)直接冷凍超低溫保存后的6.00%含水量的種子POD活性降低了，表明在超低溫冷凍影響下，種子抗氧化能力減弱了，這與對(duì)益智[27]種子、玉蟬花[46]種子的研究結(jié)果一致。而其他生理生化活性測(cè)定指標(biāo)均與未超低溫處理的種子差異不顯著，說(shuō)明直接冷凍法超低溫保存對(duì)種子傷害不大，這與石蠟切片觀察結(jié)果一致。綜合分析發(fā)芽情況、石蠟切片結(jié)果及生理生化指標(biāo)，表明海南龍血樹種子進(jìn)行超低溫保存是可行的。

本試驗(yàn)對(duì)海南龍血樹種子的超低溫保存方法和最適保存含水量進(jìn)行了探索，結(jié)果顯示，6.00%的含水量和直接冷凍法是海南龍血樹種子進(jìn)行長(zhǎng)期超低溫保存的最優(yōu)組合條件，為日后海南龍血樹種質(zhì)資源的保存提供了理論依據(jù)。