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        基于近紅外光譜法的綠豆淀粉和蛋白質(zhì)無損快速檢測

        2022-10-28 06:09:18王富豪郭魯平張曉燕袁星星薛晨晨
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年19期
        關(guān)鍵詞:決定系數(shù)綠豆預(yù)處理

        黃 璐, 王富豪, 郭魯平, 張曉燕, 袁星星, 薛晨晨, 陳 新

        (1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,江蘇南京 210014; 2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇南京 210095;3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

        綠豆(L.)又稱青小豆、植豆,起源于亞洲東南部。綠豆是我國主要的雜糧作物,其營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。在我國栽培歷史長達(dá)2 000多年,主產(chǎn)區(qū)在東北、長江下游及黃淮河流域,其適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn),成為產(chǎn)區(qū)農(nóng)民致富的主要經(jīng)濟(jì)作物。綠豆具有清熱、解毒等功效,經(jīng)加工可制成具有藥食同源功效的食材,如綠豆湯、綠豆糕、綠豆餅等,其味道香甜、口感松軟,老少皆宜,同時(shí)還具有解毒、降低膽固醇、抗腫瘤和抗炎等生物學(xué)功能。綠豆?fàn)I養(yǎng)豐富,最主要的成分是淀粉,籽粒中淀粉含量約為50%,主要分為抗性淀粉和非抗性淀粉。其中,抗性淀粉可為人類帶來理想的生理健康益處,如降血糖、降低膽固醇和甘油三酯等作用。綠豆淀粉具有熱黏度高、易回生等特性,常被用來制做粉絲、粉皮等。綠豆中蛋白質(zhì)含量(25%~28%)僅次于淀粉,高于其他常見谷物,是小麥面粉的2.3倍、玉米面的3.0倍、大米的3.2倍、小米的2.7倍,且綠豆蛋白富含賴氨酸、亮氨酸和蘇氨酸3種必需氨基酸,尤其是賴氨酸水平接近雞蛋,是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源。

        綠豆中淀粉含量的測定通常采用酶水解法和酸水解法,蛋白質(zhì)可通過凱氏定氮法、分光光度法或燃燒法進(jìn)行檢測。常規(guī)化學(xué)分析方法用于農(nóng)產(chǎn)品和食品品質(zhì)檢測通常費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且成本高。近紅外光(NIR)是一種電磁波,其波長介于可見光(VIS)與中紅外光(IR)之間,近紅外譜區(qū)為780~2 500 nm,對C—H、N—H、O—H等基團(tuán)的振動有強(qiáng)烈的感應(yīng)。近紅外光譜技術(shù)是基于譜區(qū)內(nèi)所包含的物質(zhì)信息,快速對有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的物理檢測技術(shù)。因其操作簡便、快捷、成本低、無試劑污染等特點(diǎn)而被廣泛研究和應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、石油化工等各個(gè)領(lǐng)域。Plans等采用近紅外光譜技術(shù)對菜豆皮營養(yǎng)品質(zhì)性狀進(jìn)行模型建立,通過模型準(zhǔn)確預(yù)測豆皮中的膳食纖維、糖醛酸、灰分、鈣和鎂的含量,大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間,為育種和品質(zhì)質(zhì)量提供了重要的檢測工具。Wang等采用近紅外光譜建立了可快速而準(zhǔn)確地預(yù)測蠶豆淀粉、蛋白質(zhì)、油分和多酚含量的模型。此外,近紅外技術(shù)已廣泛應(yīng)用于大豆、油菜、大麥等作物的品質(zhì)育種中。在美國,近紅外被官方認(rèn)可用于商業(yè)貿(mào)易中分析大豆中主要成分,但對綠豆主要化學(xué)成分的預(yù)測缺少商業(yè)化模型。

        本研究基于筆者所在課題組保存的大量綠豆資源,參考多年種植的數(shù)據(jù)報(bào)告(在省內(nèi)多點(diǎn)開展種植和農(nóng)藝性狀調(diào)查),篩選出100份綠豆核心資源作為試驗(yàn)材料,利用化學(xué)方法測定綠豆淀粉(酸水解法)和蛋白質(zhì)(凱氏定氮法)含量,基于近紅外技術(shù)建立快速檢測模型,用于綠豆育種中蛋白質(zhì)和淀粉含量的無損檢測,以期為綠豆資源的進(jìn)一步快速測定和利用提供技術(shù)支撐,實(shí)現(xiàn)綠豆資源的快速評價(jià),提高育種效率。

        1 材料與方法

        1.1 材料和儀器設(shè)備

        試驗(yàn)材料:供試的綠豆品種(系)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室收集并保存,挑選了品質(zhì)、產(chǎn)地、色澤存在較大差異的100份資源于2020年6月種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合實(shí)驗(yàn)基地,2020年9月收獲。2020年10月至2021年5月期間進(jìn)行綠豆淀粉和蛋白質(zhì)無損快速檢測研究,試驗(yàn)地點(diǎn)為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所。本試驗(yàn)所需試劑均為分析純,購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        儀器設(shè)備:Matrix-I傅立葉紅外變換光譜儀,購自德國BRUKER公司;K-370全自動凱氏定氮儀,購自瑞士BUCHI公司;Grinder-96高通量組織研磨儀,購自騁克儀器(上海)有限公司;Spark 10M純水儀,購自四川優(yōu)普超純有限公司;AR223CN電子天平,購自奧豪斯儀器有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 綠豆淀粉及蛋白含量測定 淀粉含量根據(jù)GB 5009.9—2016中酸水解方法進(jìn)行測定,蛋白含量根據(jù)凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)測定。

        1.2.2 樣品近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集 對100份綠豆樣品在波長800~2 500 nm(4 000~12 000 cm)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜采集,掃描樣品前,將近紅外光譜儀預(yù)熱2 h,以儀器內(nèi)置參比作為背景校正。開啟旋轉(zhuǎn)樣品臺,將綠豆樣品放入旋轉(zhuǎn)樣品池,進(jìn)行綠豆光譜掃描。為降低由取樣所造成的光譜漂移,減小誤差,每份材料重復(fù)裝樣3次進(jìn)行掃描,裝樣時(shí)保持樣品的裝載量、表面平整和實(shí)密程度一致。樣品掃描溫度為25 ℃,每個(gè)樣品掃描64次,分辨率為8 cm。

        1.2.3 近紅外光譜分析模型的建立 根據(jù)3 ∶1的比例,將100份資源分為校正集和驗(yàn)證集,75份樣用于模型建立,25份樣用于模型精度檢驗(yàn)。采用偏最小二乘法(PLS)將化學(xué)方法所得的化學(xué)值與光譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián),建立綠豆淀粉和蛋白檢測模型。利用不同的預(yù)處理方法對數(shù)據(jù)優(yōu)化,模型的預(yù)測效果根據(jù)交叉驗(yàn)證決定系數(shù)、交叉驗(yàn)證均方根誤差RMSECV、校正決定系數(shù)、校正均方根誤差RMSEE、外部驗(yàn)證決定系數(shù)和預(yù)測均方根誤差RMSEP等指標(biāo)確定最優(yōu)模型。

        1.3 數(shù)據(jù)分析

        綠豆淀粉和蛋白含量測定單項(xiàng)試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用OPUS 6.5軟件建立近紅外光譜與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)值之間的數(shù)學(xué)模型,并通過預(yù)測集對近紅外模型的準(zhǔn)確度進(jìn)行評價(jià),同時(shí)采用OriginPro 8軟件進(jìn)行繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 綠豆近紅外光譜圖

        100份整粒綠豆樣品的近紅外原始光譜圖,見圖1。由圖1可知,綠豆在波段12 000~4 000 cm范圍內(nèi)存在多個(gè)吸收峰,不同樣品近紅外光譜圖變化趨勢總體一致,但在近紅外的吸光度有較大差異,有利于建模。近紅外譜區(qū)主要包含2 000 cm以上的基團(tuán)信息,可檢測樣品中的C—H、N—H、O—H、S—H等基團(tuán)振動及光譜疊加吸收,這些基團(tuán)是有機(jī)物的重要組成元素,如淀粉和蛋白質(zhì)。

        2.2 綠豆淀粉和蛋白質(zhì)化學(xué)分析結(jié)果

        采用傳統(tǒng)化學(xué)分析方法對100份綠豆中淀粉(酸水解法)和蛋白質(zhì)(凱氏定氮法)含量進(jìn)行分析測定,由表1、表2可知,樣品中淀粉含量范圍為40.88%~53.62%,蛋白質(zhì)含量范圍為20.17%~27.38%,淀粉和蛋白質(zhì)含量的平均值分別為47.36%和23.36%。本研究所用的綠豆資源,是通過比較品質(zhì)、產(chǎn)地、色澤等相關(guān)性狀,挑選了存在較大差異的100份資源。淀粉和蛋白的化學(xué)測定結(jié)果與前人相關(guān)報(bào)道相比,有更廣泛的區(qū)間,涵蓋了綠豆種質(zhì)淀粉和蛋白質(zhì)含量廣泛的分布范圍。品種的多樣性導(dǎo)致蛋白質(zhì)和淀粉含量的差異性,數(shù)據(jù)具有較寬的變幅,適合用于近紅外分析模型的建立,有較好的適用性。

        表1 綠豆淀粉和蛋白質(zhì)含量

        表2 綠豆淀粉和蛋白質(zhì)化學(xué)含量分布

        2.3 模型的建立與優(yōu)化

        使用OPUS軟件,通過偏最小二乘法(PLS)統(tǒng)計(jì)方法,考察了不同光譜預(yù)處理和譜區(qū)范圍對近紅外模型的影響。通過選擇信息相關(guān)性最大的譜區(qū),選擇減少光譜基線偏移、漂移、增加信息量、穩(wěn)定可靠的光譜預(yù)處理方法,對于綠豆樣品近紅外數(shù)學(xué)模型的精確度是非常重要的。利用軟件的功能和大量的譜區(qū)組合選擇,優(yōu)化出所需的最佳光譜預(yù)處理方法和譜區(qū)范圍,從對比驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中選擇最優(yōu)的光譜預(yù)處理方法和譜區(qū)范圍用于建立模型(表3)。對于綠豆淀粉,采用無光譜預(yù)處理,譜區(qū)范圍11 772.2~7 498.4、6 102.1~4 597.8 cm效果最佳。對于綠豆蛋白,采用一階導(dǎo)數(shù)+MSC,譜區(qū)范圍 9 403.9~6 094.4、4 605.5~4 242.9 cm光譜預(yù)處理效果最好。由圖2可知,為通過一階導(dǎo)數(shù)+MSC方式處理后的近紅外光譜,與蛋白質(zhì)相關(guān)信息集中在9 403.9~6 094.4和4 605.5~ 4 242.9 cm波數(shù),表明綠豆樣品間的差異主要來源于此范圍內(nèi)。

        通過交叉驗(yàn)證,比較不同光譜預(yù)處理和譜區(qū)范圍組合的交叉驗(yàn)證決定系數(shù)、交叉驗(yàn)證均方根誤差RMSECV等參數(shù),確定綠豆淀粉和蛋白最優(yōu)模型。由圖3和表3可知,對于綠豆淀粉來說,在無光譜預(yù)處理?xiàng)l件下,交叉驗(yàn)證決定系數(shù)為0.926 9,交叉驗(yàn)證均方根誤差RMSECV為0.658,模型效果最佳。對于綠豆蛋白質(zhì)來說,采用一階導(dǎo)數(shù)+MSC建立的模型效果最佳,交叉驗(yàn)證決定系數(shù)為 0.934 1,交叉驗(yàn)證均方根誤差RMSECV為0.384。不同光譜預(yù)處理和譜區(qū)范圍對不同營養(yǎng)成分的信息貢獻(xiàn)不同, 不同成分近紅外模型的最佳光譜預(yù)處理方法和譜區(qū)范圍也不同,每一種營養(yǎng)成分近紅外模型的建立都需要單獨(dú)分析和單獨(dú)優(yōu)化,才能建立合適的近紅外模型。

        表3 綠豆淀粉和蛋白質(zhì)模型優(yōu)化

        2.4 綠豆淀粉和蛋白質(zhì)模型外部驗(yàn)證與評價(jià)

        本研究選用的100份綠豆資源中75份樣品為校正集,25份為驗(yàn)證集。為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性,采用未用于建模的、完全獨(dú)立的且化學(xué)值已知的驗(yàn)證集中的25份資源對所建模型的精確度進(jìn)行評價(jià)。由圖4可知,剩余25份綠豆種質(zhì)資源對預(yù)測模型進(jìn)行外部驗(yàn)證的散點(diǎn)圖,發(fā)現(xiàn)淀粉外部驗(yàn)證決定系數(shù)為0.935 1(圖4-a),預(yù)測均方根誤差RMSEP為0.743,蛋白外部驗(yàn)證決定系數(shù)為0.921 2(圖4-b),預(yù)測均方根誤差RMSEP為0.31,模型預(yù)測效果較好,近紅外光譜預(yù)測值與真實(shí)數(shù)值基本一致,滿足檢測結(jié)果,能滿足近紅外用于綠豆淀粉和蛋白質(zhì)的無損快速檢測。

        3 討論與結(jié)論

        淀粉和蛋白質(zhì)是綠豆中主要的營養(yǎng)物質(zhì),分別占40.88%~53.62%和20.17%~27.38%,傳統(tǒng)化學(xué)分析方法是用來測定綠豆淀粉和蛋白的常用方法,但化學(xué)分析方法通常較為耗時(shí),需要昂貴的化學(xué)試劑、專門的檢測設(shè)備和熟練的分析人員。本研究選用100份綠豆資源用于近紅外數(shù)學(xué)模型的建立,按3 ∶1比例劃分為校正集(75份樣品)和驗(yàn)證集(25份樣品),通過不同的光譜預(yù)處理方法對淀粉和蛋白質(zhì)的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化。采用無光譜預(yù)處理和譜區(qū)范圍11 772.2~7 498.4、6 102.1~4 597.8 cm得到最優(yōu)的淀粉數(shù)學(xué)模型,交叉驗(yàn)證均方根誤差為0.658,交叉驗(yàn)證決定系數(shù)為0.926 9。采用一階導(dǎo)數(shù)+MSC預(yù)處理和譜區(qū)范圍9 403.9~6 094.4、4 605.5~4 242.9 cm得到最優(yōu)的蛋白質(zhì)數(shù)學(xué)模型,交叉驗(yàn)證均方根誤差為0.384,交叉驗(yàn)證決定系數(shù)為0.934 1。通過外部檢驗(yàn)方法對綠豆淀粉和蛋白質(zhì)的光譜模型進(jìn)行檢驗(yàn),淀粉和蛋白外部驗(yàn)證決定系數(shù)分別為0.935 1和0.921 2,模型預(yù)測效果較好。模型涵蓋了綠豆種質(zhì)淀粉和蛋白質(zhì)含量的廣泛檢測分布范圍,有較好的適用性。綠豆淀粉和蛋白質(zhì)近紅外模型的建立可快速完成對育種材料的品質(zhì)測定與分析,極大地縮短檢測時(shí)間,減小了工作量,且結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,可實(shí)現(xiàn)對綠豆資源的快速鑒定與評價(jià),對提高育種效率具有一定意義。

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