李銀匯，王文駿,2,3，呂瑞玲,2，劉東紅,2,3,*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.浙江大學(xué)寧波研究院，浙江 寧波 315100；3.浙江大學(xué)馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058）

食品安全問(wèn)題關(guān)系人類(lèi)生命健康，對(duì)于如何降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)，不同時(shí)期的研究人員有不同的研究策略。傳統(tǒng)的熱加工容易破壞食品原有風(fēng)味甚至產(chǎn)生苯并芘等致癌物質(zhì)，家禽等在養(yǎng)殖過(guò)程中使用的抗生素若造成殘留則會(huì)促進(jìn)耐藥菌的產(chǎn)生，它們對(duì)傳統(tǒng)熱加工有更高的耐受性?，F(xiàn)階段的食品加工處理傾向于最大限度保留食品的風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)、色澤，并保證食品微生物安全達(dá)標(biāo)，因此非熱加工技術(shù)受到了越來(lái)越多的關(guān)注。

超聲波是一種超出人耳聽(tīng)覺(jué)范圍、頻率高于20 kHz的機(jī)械波。目前研究中常用超聲波可以按頻率高低分為：低頻超聲（也稱(chēng)功率超聲，20～100 kHz）、高頻超聲（100 kHz～10 MHz），其中高頻超聲包含診斷超聲（5～10 MHz）。作為一種新興的非熱加工技術(shù)，超聲波因其無(wú)殘留、可自動(dòng)化、設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、距離測(cè)量、食品加工、材料切割等領(lǐng)域。

研究發(fā)現(xiàn)超聲波具有一定的殺菌效果，但單獨(dú)使用的效果有限。而超聲波與其他殺菌技術(shù)聯(lián)用的柵欄技術(shù)在提高殺菌效果方面有顯著的積極作用。殺菌劑具有殺菌譜廣、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，有最廣泛的工業(yè)應(yīng)用基礎(chǔ)，但殺菌劑也存在易產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物、滲透性差等問(wèn)題。實(shí)際上，超聲波和殺菌劑的聯(lián)用具有良好的協(xié)同殺菌效果，不僅可以減少殺菌劑的用量從而減少化學(xué)殘留和有毒有害物質(zhì)的生成，還可以縮短殺菌處理時(shí)間，在實(shí)際生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用潛力。本文綜述超聲波空化效應(yīng)、超聲波與殺菌劑聯(lián)用的殺菌機(jī)理和影響因素，以及它們?cè)谑称奉I(lǐng)域的應(yīng)用，旨在為進(jìn)一步研究基于超聲波與殺菌劑的聯(lián)用技術(shù)提供參考。

1 超聲波空化效應(yīng)

空化閾值即發(fā)生超聲空化需要的最小聲壓，當(dāng)超聲波在液體介質(zhì)中傳播時(shí)，由于周期性的正負(fù)壓交替，施加的聲壓超過(guò)空化閾值，液體介質(zhì)內(nèi)分子間的吸引力不足以維持分子間距，導(dǎo)致分子之間產(chǎn)生空隙而形成空腔，當(dāng)空腔中氣體足夠多時(shí)便形成了空化泡，空化泡在振蕩過(guò)程中經(jīng)整流擴(kuò)散逐漸長(zhǎng)大，直至臨界尺寸時(shí)迅速崩潰，該過(guò)程即超聲空化?？栈莸谋罎⒂袃煞N類(lèi)型，即穩(wěn)態(tài)空化和瞬時(shí)空化。穩(wěn)態(tài)空化發(fā)生在較小的聲壓條件下，空化泡一般不發(fā)生激烈的崩潰，當(dāng)其非線(xiàn)性振蕩較為強(qiáng)烈時(shí)，穩(wěn)態(tài)空化泡周?chē)囊后w隨之運(yùn)動(dòng)，伴有強(qiáng)剪切力。瞬時(shí)空化一般發(fā)生在聲壓足夠大時(shí)，瞬時(shí)空化泡被壓縮至極致，在反彈的過(guò)程中發(fā)生內(nèi)爆，形成許多小空化泡，伴有剪切力、沖擊波、微射流等物理效應(yīng)，并產(chǎn)生局部高溫（約5 000 K）和高壓，生成自由基等高氧化活性物質(zhì)，引發(fā)隨后的一系列化學(xué)反應(yīng)，這些作用最終導(dǎo)致細(xì)菌失活。

空化效應(yīng)即氣泡成核作用，在聲壓幅值的負(fù)壓相超過(guò)空化閾值時(shí)發(fā)生。由于氣體溶解度與壓力成正比，負(fù)壓下溶解在液體中的氣體達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)，不能再溶解，就會(huì)產(chǎn)生許多氣泡。成核后，空化泡開(kāi)始生長(zhǎng)直至破裂（圖1），頻率在很大程度上決定了該過(guò)程的長(zhǎng)短，研究表明空化泡的壽命會(huì)隨著頻率的增加而降低，由213 kHz時(shí)的0.35 ms降低到1 062 kHz時(shí)的0.10 ms?？栈?yīng)作為超聲的反應(yīng)核心，會(huì)引起一系列物理化學(xué)現(xiàn)象，本文著重介紹超聲穿孔、聲化學(xué)、聲致發(fā)光現(xiàn)象。

圖1 超聲空化泡生長(zhǎng)周期示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the growth cycle of ultrasonic cavitation bubbles

1.1 超聲穿孔

超聲穿孔現(xiàn)象，即超聲波產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力使細(xì)胞膜滲透性瞬時(shí)可逆地增加形成孔穴的現(xiàn)象。超聲穿孔主要與空化泡崩潰前的周期性振蕩、崩潰后產(chǎn)生的剪切應(yīng)力有關(guān)（圖2）。這些孔的直徑從幾十納米到幾百納米不等，小分子可以通過(guò)這些瞬時(shí)孔被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞?？茖W(xué)研究已經(jīng)在形態(tài)學(xué)上觀察到高強(qiáng)度低頻的超聲波處理細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致孔的形成，低強(qiáng)度高頻超聲波則沒(méi)有明顯損傷。聲穿孔現(xiàn)象在藥物遞送、食品微生物殺菌等領(lǐng)域研究較多。例如，陳麗娟等利用超聲（1 MHz）結(jié)合微泡可逆地有限開(kāi)放腦膠質(zhì)瘤血腦屏障，對(duì)腦組織無(wú)明顯損傷。楊梅利用高強(qiáng)度聚焦超聲誘導(dǎo)小鼠皮膚形成微孔，實(shí)現(xiàn)了經(jīng)皮遞送乙肝疫苗。Khadhraoui等研究了超聲波提取迷迭香葉片中迷迭香酸的機(jī)理，結(jié)果表明超聲波可能通過(guò)包括超聲穿孔在內(nèi)的6 個(gè)鏈解構(gòu)機(jī)制中發(fā)揮作用。

圖2 超聲穿孔示意圖Fig. 2 Schematic diagram of sonoporation

1.2 聲化學(xué)

聲化學(xué)即由聲空化產(chǎn)生自由基并引發(fā)一系列次級(jí)化學(xué)反應(yīng)的效應(yīng)。Suslick將聲化學(xué)廣義地分為同質(zhì)、異質(zhì)兩類(lèi)，前者涉及鍵斷裂或自由基形成導(dǎo)致的化學(xué)反應(yīng)，后者代表由增強(qiáng)的傳質(zhì)作用而提高化學(xué)反應(yīng)性的聲化學(xué)效應(yīng)。自由基產(chǎn)率是聲化學(xué)效應(yīng)中的重要部分，盡管單個(gè)空化泡中產(chǎn)生的自由基數(shù)量與頻率呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但在整個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)的自由基產(chǎn)率是先隨頻率升高而后再下降的，因?yàn)樵诜磻?yīng)體系內(nèi)，當(dāng)頻率升高時(shí)，空化泡的壽命變短，其內(nèi)的自由基將遷移至氣泡外從而引發(fā)產(chǎn)生更多的自由基。除自由基的含量外，過(guò)氧化氫、氧氣的含量等都會(huì)影響聲化學(xué)效應(yīng)的強(qiáng)弱，故常用反應(yīng)分子物質(zhì)的量與超聲波能量的比值來(lái)反映聲化學(xué)效應(yīng)的強(qiáng)弱，單位為mol/J。

大量研究表明聲化學(xué)效應(yīng)在200～300 kHz最強(qiáng)。另外，聲化學(xué)效應(yīng)的強(qiáng)弱還取決于空化泡內(nèi)部溫度、空化閾值、空化泡數(shù)量、空化泡壽命等因素。一方面，根據(jù)氣泡動(dòng)力學(xué)，隨著聲波頻率的增加，空化泡崩潰時(shí)達(dá)到的最高溫度下降；空化閾值隨頻率的增大而增大，使得非均勻聲場(chǎng)中產(chǎn)生空化泡的活躍區(qū)域變窄，這兩個(gè)因素導(dǎo)致聲化學(xué)效應(yīng)變?nèi)?；另一方面，隨著超聲波頻率的增加，波長(zhǎng)變短，對(duì)應(yīng)的活躍區(qū)間隔也變短，駐波場(chǎng)中的空化泡密度增加；空化泡的壽命在高頻率聲場(chǎng)中變短，更多自由基可以從空化泡中逸出，與介質(zhì)中的其他物料發(fā)生反應(yīng)，這兩個(gè)因素導(dǎo)致聲化學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)。

1.3 聲致發(fā)光

聲致發(fā)光是指超聲過(guò)程中空化泡破裂瞬間產(chǎn)生高溫高壓導(dǎo)致的閃光現(xiàn)象。聲致發(fā)光可以分為單氣泡聲致發(fā)光和多氣泡聲致發(fā)光。前者是由單個(gè)穩(wěn)定振蕩的氣泡在駐波的波腹處發(fā)生的閃光，它源于空化泡坍塌時(shí)內(nèi)部的發(fā)射的等離子體；后者是是由液體中的許多空化泡共同產(chǎn)生的閃光，它不僅源于內(nèi)部等離子體發(fā)射，還包括空化泡坍塌時(shí)發(fā)生的化學(xué)發(fā)光，但仍存在爭(zhēng)議。

聲致發(fā)光產(chǎn)生的閃光可以催化金屬氧化物等聲敏劑產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）從而發(fā)揮抗菌作用。Zhang Lingling等利用ZnO納米流體與超聲波聯(lián)用處理大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)超聲波的存在誘導(dǎo)了更多ROS的產(chǎn)生，同時(shí)還可以分散聚集的ZnO，促進(jìn)ZnO粒子產(chǎn)生自由基。較低的頻率和較高的功率密度下抑菌效果更好，這可能是由于在這些情況下坍塌的空化泡有更多的勢(shì)能，而這些勢(shì)能將促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行以及轉(zhuǎn)化為熱、光和聲能，進(jìn)一步催化聲敏劑來(lái)起到殺菌效果。但若聲敏劑的吸收光譜范圍與超聲波產(chǎn)生的瞬時(shí)閃光的光譜范圍沒(méi)有較好重疊，則有可能削弱兩者聯(lián)用的效果，這還有待進(jìn)一步的研究證明。

2 殺菌劑及其與超聲波聯(lián)用的殺菌機(jī)理

超聲波與殺菌劑聯(lián)用時(shí)，主要通過(guò)以下途徑起殺菌作用：一是超聲波可以將團(tuán)聚的細(xì)菌細(xì)胞簇打散，有助于殺菌劑接近細(xì)胞表面而提高殺菌效率，同時(shí)，超聲波本身的機(jī)械剪切、熱效應(yīng)和聲化學(xué)效應(yīng)也可以破壞細(xì)菌；二是超聲波可以提高化學(xué)試劑的滲透效率，使化學(xué)試劑更易滲透到細(xì)胞內(nèi)部而提高殺菌效率；三是超聲波可以通過(guò)誘導(dǎo)部分殺菌劑生產(chǎn)更多具有殺菌活性的物質(zhì)來(lái)提升殺菌效率。常見(jiàn)的殺菌劑主要有含氯試劑、過(guò)氧化物、季銨化合物（quaternary ammonium compounds，QACs）等，各項(xiàng)聯(lián)用技術(shù)的殺菌機(jī)理總結(jié)如圖3所示，下面具體分小節(jié)展開(kāi)討論。

圖3 超聲波聯(lián)合殺菌劑的殺菌機(jī)理Fig. 3 Mechanism of microbial killing by combined treatment of ultrasound with bactericides

2.1 含氯試劑

含氯試劑具有殺菌譜廣、生產(chǎn)成本低、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，常見(jiàn)的含氯試劑有氯氣、次氯酸鈉、次氯酸鈣、二氧化氯、次氯酸以及微酸性電解水等含氯混合物。含氯殺菌劑能穿過(guò)細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)釋放ROS，導(dǎo)致蛋白質(zhì)側(cè)鏈氧化和去折疊化，并與核酸發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致氧化損傷。超聲波單獨(dú)使用時(shí)，其振動(dòng)過(guò)程產(chǎn)生的機(jī)械作用可以促進(jìn)細(xì)菌、生物被膜從果蔬等產(chǎn)品表面脫離，減少產(chǎn)品表面的微生物負(fù)載。Tan等使用20 kHz的超聲波處理鼠傷寒沙門(mén)氏菌60 s，發(fā)現(xiàn)在保持細(xì)胞活性的前提下，菌體的鞭毛量顯著下降至55%，該菌的附著量減少了10%～15%，這可能是因?yàn)榧?xì)菌的鞭毛被破壞后，細(xì)菌不足以運(yùn)動(dòng)到與基質(zhì)表面足夠近的距離來(lái)完成附著。這一發(fā)現(xiàn)為超聲波聯(lián)合殺菌劑提升殺菌效果提供了一種潛在可能性，即超聲處理可以通過(guò)將細(xì)菌從待潔凈表面轉(zhuǎn)移至含有殺菌劑的液體環(huán)境中的方式來(lái)提升殺菌效果。

已有研究發(fā)現(xiàn)，超聲波和含氯試劑聯(lián)用時(shí)存在協(xié)同效應(yīng)。一方面，由于超聲波的機(jī)械作用和聲化學(xué)效應(yīng)，細(xì)胞膜的選擇透過(guò)性被破壞，可能會(huì)增強(qiáng)殺菌劑對(duì)細(xì)菌的滲透作用；另一方面，空化效應(yīng)也能促進(jìn)溶液中微生物團(tuán)簇的分解，增加殺菌劑與微生物的接觸。而在這些外界的強(qiáng)刺激下，細(xì)胞也可能為“自?！倍鞒鲆恍┓e極響應(yīng)。Yu Hang等研究發(fā)現(xiàn)，超聲波與二氧化氯聯(lián)合處理金黃葡萄球菌時(shí)，超聲波破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)也激活了細(xì)胞內(nèi)機(jī)械敏感通道（如MscS和MscL），進(jìn)而促進(jìn)了二氧化氯進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，二者共同脅迫引起細(xì)胞的輔助基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)（accessory gene regulator，Agr）上調(diào)基因，這可能導(dǎo)致金黃色葡萄球菌間的黏連性下降，使得生物被膜更松散；另外，和基因的下調(diào)抑制了生物被膜的形成；和基因與細(xì)胞裂解的能力密切相關(guān)，相比于二氧化氯單獨(dú)處理，聯(lián)用處理使基因上調(diào)1.82 倍，基因下調(diào)1.52 倍，使得金黃色葡萄球菌細(xì)胞更容易被裂解。這說(shuō)明聯(lián)合處理對(duì)細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響是多方面的，且對(duì)細(xì)菌有較好的致死作用。

但是，含氯試劑易與水中雜質(zhì)反應(yīng)生成DBPs并危害公共健康，如與水中的含氮化合物（包括氨）反應(yīng)，生成三鹵甲烷等致癌物。另外，超聲波有一定的脫氣和降解作用，這會(huì)導(dǎo)致聯(lián)用時(shí)有效氯含量降低。故現(xiàn)有研究嘗試使用其他更安全的殺菌劑來(lái)替代含氯化合物。

2.2 過(guò)氧化物

過(guò)氧化物是一類(lèi)化學(xué)分子結(jié)構(gòu)中包含有過(guò)氧基（—O—O—）的強(qiáng)氧化劑，因其強(qiáng)氧化性且殺菌范圍廣而廣泛用于醫(yī)療、食品、水處理、水產(chǎn)養(yǎng)殖、家庭防護(hù)等。常見(jiàn)的過(guò)氧化物殺菌劑有過(guò)氧化氫、過(guò)氧乙酸、無(wú)機(jī)過(guò)氧酸鹽、過(guò)碳酰胺、單過(guò)氧鄰苯二甲酸鎂等。過(guò)氧化物的氧化作用可以造成細(xì)菌膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等的氧化損傷。另外，其強(qiáng)氧化性的另一部分還可能來(lái)自于分解過(guò)程中產(chǎn)生的活性衍生物，如自由基。以過(guò)氧乙酸為例，其可通過(guò)3 種途徑產(chǎn)生自由基：一是在酸性環(huán)境中過(guò)氧乙酸的末端氧發(fā)生質(zhì)子化，脫去一分子水，最終形成帶有多余電子的乙酸根離子；二是給出一個(gè)電子后形成過(guò)氧?；杂苫蝗怯赏饧幽芰科茐倪^(guò)氧化物或O—H后解離產(chǎn)生自由基。另一種重要的過(guò)氧化物，即HO，其與過(guò)渡金屬鐵離子共同參與Fenton反應(yīng)也可以產(chǎn)生大量自由基。這些自由基可以對(duì)蛋白質(zhì)和酶的巰基（—SH）以及二硫鍵（—S—S—）起到極強(qiáng)的破壞性作用，從而影響了由激酶、磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子控制的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境。

通常，細(xì)菌的抗氧化性由強(qiáng)到弱為細(xì)菌芽孢＞革蘭氏陽(yáng)性菌＞革蘭氏陰性菌，且細(xì)菌存活率隨氧化劑濃度或用量的增加而下降。另外，在氧化水平較低的情況下，細(xì)菌胞內(nèi)的過(guò)氧化氫酶或其他過(guò)氧化物酶的存在會(huì)增加細(xì)菌對(duì)氧化的耐受性。但與超聲波聯(lián)用后，即使氧化劑濃度較低，也可以達(dá)到較好的殺菌效果，特別是聯(lián)用后自由基水平的增加大大提高了殺菌效率。Rubio-Clemente等采用高級(jí)氧化工藝（advanced oxidation processes，AOPs），對(duì)飲用水中的病原體大腸桿菌進(jìn)行紫外/HO、紫外/超聲和紫外/超聲/HO處理，發(fā)現(xiàn)紫外/超聲/HO體系處理5 min即可使大腸桿菌完全失活（檢測(cè)限為1 CFU/100 mL）。該研究還發(fā)現(xiàn)，超聲波聯(lián)合HO處理的細(xì)菌去除率相比于單獨(dú)超聲作用時(shí)增加了62.16%，這是因?yàn)槌暡ǖ目栈?yīng)促進(jìn)了HO熱分解產(chǎn)生更多的羥自由基。Giannakis等利用超聲波和Fenton反應(yīng)聯(lián)合處理廢水，單獨(dú)超聲波或Fenton反應(yīng)處理時(shí)細(xì)菌數(shù)量分別可減少27.9%和24.4%，聯(lián)合處理使細(xì)菌數(shù)量減少82.1%，達(dá)到兩種單獨(dú)處理下細(xì)菌減少量之和的1.57 倍，Giannakis等認(rèn)為其協(xié)同效應(yīng)是因?yàn)镠O重組并不斷引發(fā)新的Fenton反應(yīng)，同時(shí)，超聲波使細(xì)胞膜的滲透性暫時(shí)性地提高，F(xiàn)e更易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生更多自由基，造成活性物質(zhì)的氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)菌失活。

2.3 無(wú)機(jī)金屬氧化物

無(wú)機(jī)金屬氧化物因其良好的抗菌性、化學(xué)穩(wěn)定性、低毒性、不使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)而被廣泛研究。無(wú)機(jī)金屬氧化物的殺菌機(jī)理研究較多的主要有3 種：一是因靜電作用聚集在細(xì)胞表面，影響物質(zhì)交換；二是滲透入細(xì)胞內(nèi)，與胞內(nèi)含硫蛋白質(zhì)以及DNA等含磷化合物相互作用，影響細(xì)菌的呼吸鏈、分裂等過(guò)程，最終導(dǎo)致死亡；三是通過(guò)形成高氧化活性的自由基氧化細(xì)菌細(xì)胞。在實(shí)際研究中，這3 種機(jī)理往往同時(shí)存在。

近年來(lái)，金屬氧化物納米顆粒（nanoparticles，NPs）優(yōu)良的光催化活性是研究的熱點(diǎn)。在光催化下，NPs吸收能量，在導(dǎo)帶產(chǎn)生負(fù)電子，在價(jià)帶產(chǎn)生帶正電的空穴，自由電子可以攻擊周?chē)难鹾退肿?，形成ROS，介導(dǎo)細(xì)菌死亡。而超聲波的聲致發(fā)光效應(yīng)可以為NPs提供光催化環(huán)境。Zhang Lingling等利用聲光催化ZnO納米流體，發(fā)現(xiàn)聲光催化可以提高ROS水平，而上清液中鋅離子的濃度卻沒(méi)有增加，與此同時(shí)，聲光催化下大腸桿菌的失活效率提高了約20%，Zhang Lingling等指出聲光催化下大腸桿菌失活效率的提高主要是因?yàn)镽OS水平提高而不是鋅離子。Rahman等開(kāi)發(fā)了一種使用Fe/ZnO NPs的可見(jiàn)光輔助聲光催化方法對(duì)志賀氏菌進(jìn)行處理，也得到了類(lèi)似的結(jié)論，他們還發(fā)現(xiàn)該方法會(huì)影響細(xì)菌細(xì)胞的脂肪酸組成，并減弱細(xì)菌形成生物被膜的能力。

目前對(duì)NPs和超聲波聯(lián)用的研究處于起步階段，其殺菌機(jī)理研究并不深入，還需進(jìn)一步研究。

2.4 季銨化合物

QACs，即一個(gè)帶正電的氮原子與4 個(gè)相同或不相同的脂烴基或芳烴基共價(jià)連接的化合物，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有殺菌效果，能抑制細(xì)菌芽孢的生長(zhǎng)但不能抑制其萌發(fā)。帶正電的氮使QACs容易與細(xì)菌表面產(chǎn)生靜電吸引而吸附到細(xì)胞膜上破壞其電荷分布，同時(shí)QACs的長(zhǎng)烷基鏈能滲透細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合，其鏈長(zhǎng)在C～C范圍內(nèi)可達(dá)到最佳殺菌效果。但是細(xì)菌自身編碼的多種外排泵、細(xì)胞膜成分的改變等會(huì)提高細(xì)菌對(duì)QACs的耐受性。

超聲波與QACs聯(lián)用常被用于去除生物被膜，聯(lián)用后既能減少Q(mào)ACs用量，又能保持一定的生物被膜清除能力。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（以下簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特菌）是一種易在與食品接觸的塑料、鋼材等表面形成生物被膜的常見(jiàn)菌。Torlak等聯(lián)合超聲波與苯扎氯銨處理聚苯乙烯表面的單增李斯特菌生物被膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理1 min的殺菌效果優(yōu)于相同濃度下苯扎氯銨單獨(dú)處理5 min的效果，說(shuō)明聯(lián)合處理可以減少殺菌所需時(shí)間；同時(shí)，Torlak等還發(fā)現(xiàn)在處理5 min條件下，聯(lián)合超聲波與100 mg/L苯扎氯銨的殺菌效果優(yōu)于單獨(dú)使用400 mg/L苯扎氯銨的殺菌效果，說(shuō)明聯(lián)合處理可以降低苯扎氯銨的使用量。Torlak等推測(cè)兩者的協(xié)同效應(yīng)可能是超聲波提高了傳質(zhì)效率，促進(jìn)了苯扎氯銨向生物被膜的傳輸，破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層，通過(guò)解離導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)泄漏，最終清除生物被膜。Berrang等也得到了相似的結(jié)果。

2.5 酸

酸作為廣譜殺菌劑在生產(chǎn)生活中應(yīng)用廣泛，其中大多為有機(jī)酸。有機(jī)酸以非解離的形式進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)并解離，產(chǎn)生的陰離子和質(zhì)子促使細(xì)胞排出過(guò)多的質(zhì)子，該過(guò)程消耗了維持胞內(nèi)pH值穩(wěn)態(tài)的能量，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。當(dāng)pH值相同時(shí)，無(wú)機(jī)酸的解離常數(shù)高于有機(jī)酸，無(wú)機(jī)酸完全解離，在胞外對(duì)細(xì)菌影響相對(duì)較小，而有機(jī)酸未解離，可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，因此pH值越低，未解離形式的酸所占比例越高，抗菌效果也就越好。

據(jù)報(bào)道，超聲波聯(lián)合乳酸、檸檬酸或蘋(píng)果酸處理生菜葉片，可使單增李斯特菌和大腸桿菌對(duì)數(shù)值減少約2.5（lg（CFU/g）），比單一有機(jī)酸處理額外減少0.8～1.0（lg（CFU/g））。聯(lián)合處理提升殺菌效果的原因可能是超聲空化效應(yīng)將細(xì)菌從生菜葉上剝離下來(lái)，增加了有機(jī)酸與生菜葉褶皺內(nèi)細(xì)菌的接觸，提升了酸的作用效率。

2.6 精油

精油作為從芳香植物中提取的天然抗菌劑，具有顯著的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗寄生蟲(chóng)活性。精油可以抑制細(xì)菌胞外多糖和蛋白的分泌、調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)抑制生物被膜的形成、干擾膜電位、陰礙DNA合成，抑制多種酶系統(tǒng)，影響細(xì)菌糖代謝途徑。

超聲波處理可減小精油液滴尺寸，增大液滴的比表面積，增加液滴與微生物的接觸面積，從而達(dá)到協(xié)同殺菌效果。精油也可在細(xì)菌細(xì)胞的磷脂雙分子層中堆積，使其對(duì)超聲波更敏感。另外，為了改善精油的水不溶性、提高化學(xué)穩(wěn)定性和生物利用度，研究人員常將其制成乳液。He Qiao等聯(lián)合超聲波（3.33 W/mL）與百里香精油納米乳液處理金黃色葡萄球菌3 min，與兩者單獨(dú)處理的加和相比，殺菌量對(duì)數(shù)值顯著增加了1.44（lg（CFU/mL）），He Qiao等認(rèn)為協(xié)同效應(yīng)產(chǎn)生的原因可能是超聲波處理使細(xì)菌細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致表面疏水性降低，進(jìn)一步提高了精油乳液與細(xì)菌的互作機(jī)率，兩者的聯(lián)用使得胞內(nèi)物質(zhì)大量流失、細(xì)胞膜失去膜電位、膜成分變性最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

2.7 氣體

一些氣體如臭氧、二氧化碳、二氧化氯等溶于液體介質(zhì)中可用于殺菌，它們都作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，但在具體作用機(jī)理上有所差別。臭氧具有較高的氧化電位（2.07 eV），經(jīng)鏈衰減可以產(chǎn)生羥自由基和ROS，主要攻擊細(xì)胞壁上的脂質(zhì)、蛋白、酶以及胞內(nèi)的酶和核酸，但關(guān)于臭氧分子與自由基在殺菌機(jī)制中哪一種為主要途徑并不明確。高壓二氧化碳作為“一般認(rèn)為安全”、環(huán)境友好的新型殺菌技術(shù)，具有無(wú)毒、價(jià)格低廉、易于獲取的優(yōu)點(diǎn)。二氧化碳可以通過(guò)降低胞內(nèi)外pH值、改變細(xì)胞膜流動(dòng)性、影響酶促反應(yīng)等方式提高殺菌效率。二氧化氯也是一種強(qiáng)氧化性氣體，作為氯氣的有效替代物，其活性為氯氣的2.5 倍，可通過(guò)改變細(xì)胞膜透性造成胞內(nèi)物質(zhì)外流導(dǎo)致細(xì)菌死亡，且不產(chǎn)生致癌物。

超聲波與氣體殺菌劑聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同效果的原因主要為超聲波促進(jìn)了氣體與細(xì)菌的接觸或?qū)?xì)菌細(xì)胞的滲透。Yu Hang等采用超聲波（20 kHz、60 W）和質(zhì)量濃度1、4 mg/L的二氧化氯聯(lián)合處理金黃色葡萄球菌生物被膜時(shí)均產(chǎn)生了明顯的協(xié)同效果，Yu Hang等認(rèn)為一方面超聲波促進(jìn)了二氧化氯對(duì)細(xì)菌的滲透作用；另一方面超聲波促進(jìn)了二氧化氯氣體的均勻分布，為空化泡提供了更多成核位點(diǎn)，有利于局部升壓和熱點(diǎn)的產(chǎn)生。而超臨界二氧化碳與超聲波聯(lián)用時(shí)，超聲波的機(jī)械攪拌作用提高了二氧化碳的溶解度，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH值下降加快，從而加速細(xì)菌失活最終導(dǎo)致死亡。

3 超聲波聯(lián)合殺菌劑對(duì)殺菌效果的影響因素

3.1 殺菌劑的種類(lèi)

殺菌劑種類(lèi)不同，其殺菌機(jī)理也存在差異，故在超聲波與不同種類(lèi)殺菌劑聯(lián)用時(shí)效果也有差異。?ístková等發(fā)現(xiàn)在5 種化學(xué)試劑和低頻超聲波處理朝井桿菌屬（）生物被膜的過(guò)程中，以過(guò)氧乙酸為主要成分的復(fù)配試劑單獨(dú)使用時(shí)效果最好，而聯(lián)用時(shí)，以二氧化氯為主要成分的復(fù)配試劑和超聲波顯示出更好的清除效果。Palanisamy等發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫與超聲波的聯(lián)用效果優(yōu)于氫氧化鈉與超聲波的聯(lián)用效果。

3.2 超聲參數(shù)

超聲參數(shù)主要包括超聲頻率、超聲功率（或振幅）、作用時(shí)長(zhǎng)。目前應(yīng)用最多的超聲頻率為20 kHz，因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)，在功率超聲條件下（頻率20～100 kHz、功率10～1000 W/cm），超聲波產(chǎn)生的剪切力等機(jī)械作用對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有很強(qiáng)的破壞效果。一方面，功率超聲在傳播過(guò)程中會(huì)引起液體介質(zhì)激烈振蕩；另一方面，功率超聲的空化效應(yīng)會(huì)產(chǎn)生剪切力、沖擊波、微射流、湍流等機(jī)械作用，都會(huì)破壞細(xì)菌細(xì)胞。當(dāng)超聲頻率一定時(shí)，超聲波對(duì)細(xì)菌的破壞效果隨功率增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)。如遲媛等聯(lián)合超聲波和次氯酸鈉處理腐敗菌，致死率隨著超聲功率、處理時(shí)長(zhǎng)的增加而提高，且高功率下的聯(lián)合處理有顯著的協(xié)同殺菌效果，這可能是由于在一定范圍內(nèi)超聲強(qiáng)度的增加增強(qiáng)了空化效應(yīng)，提高了對(duì)細(xì)菌外層結(jié)構(gòu)的破壞強(qiáng)度，促進(jìn)次氯酸鈉直接作用于細(xì)菌而加速細(xì)菌死亡。可見(jiàn)，空化效應(yīng)強(qiáng)度受超聲參數(shù)調(diào)節(jié)，對(duì)殺菌效率有重要影響，較好的殺菌效果需在施加聲壓高于空化閾值且空化效應(yīng)較強(qiáng)時(shí)實(shí)現(xiàn)。許多研究表明，低頻超聲發(fā)生空化效應(yīng)所需的空化閾值低于高頻超聲，低頻超聲條件下的殺菌效果也往往優(yōu)于高頻超聲。

3.3 細(xì)菌的特性

殺菌效果不僅取決于外界脅迫，還取決于細(xì)菌的特性，包括細(xì)胞形態(tài)和大小、基因型、細(xì)胞濃度、生長(zhǎng)周期、膜結(jié)構(gòu)等。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌比革蘭氏陰性細(xì)菌、球狀細(xì)菌比桿狀細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境刺激有更高的抗性。其中，芽孢有多層致密結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的抗逆性，能在多種極端條件刺激下維持活性。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁有一層較厚（20～80 nm）的肽聚糖層，不利于通過(guò)直接接觸方式起作用的殺菌技術(shù)發(fā)揮效果。革蘭氏陰性菌則有脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和磷脂提供機(jī)械強(qiáng)度。不同大小的細(xì)菌對(duì)聯(lián)合處理有不同的耐受程度，如相比于常見(jiàn)的大腸桿菌，細(xì)胞更小的缺陷短波單胞菌（）對(duì)超聲波聯(lián)用超臨界二氧化碳處理的耐受性更低。通常不同尺寸的細(xì)菌耐受性也不同，尺寸大的細(xì)菌往往比尺寸小的細(xì)菌對(duì)超聲波更敏感，這可能是因?yàn)榍罢呔哂懈蟮谋砻娣e，因此受到更多的超聲作用。

殺菌效果還受細(xì)菌胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)響應(yīng)的影響。如在微氣泡存在下，低頻超聲與陽(yáng)離子抗菌肽人β防御素聯(lián)用處理耐抗生素葡萄球菌，控制葡萄球菌生物被膜形成的基因表達(dá)提高，基因和基因表達(dá)被抑制，導(dǎo)致耐抗生素葡萄球菌生物被膜形成能力下降，抑菌效果提高。另外，細(xì)菌包膜應(yīng)激響應(yīng)（bacterial envelope stress responses，ESRs）系統(tǒng)也可影響殺菌效果。在革蘭氏陰性菌中定義了5 種ESRs，分別是（sigma factor）、Cpx（conjugative pilus expression）、Bae（bacterial adaptive respons）、Psp（phage shock protein）、Rcs（regulator of capsule synthesis）響應(yīng)系統(tǒng)。然而，關(guān)于聯(lián)用后細(xì)菌基因水平變化的研究較少，仍需進(jìn)一步探索從分子水平揭示聯(lián)用技術(shù)具有協(xié)同效果、無(wú)明顯作用或?qū)е罗卓棺饔玫臋C(jī)理，以及細(xì)胞的響應(yīng)通路，為解決微生物安全問(wèn)題提供更多參考。

3.4 介質(zhì)的特性

液體介質(zhì)通常為含水體系，超聲波的空化效應(yīng)可引起水分子裂解，并借由液體的振動(dòng)傳播能量，該過(guò)程中介質(zhì)溫度上升，而溫度的變化可能會(huì)影響細(xì)菌細(xì)胞膜的狀態(tài)；殺菌劑則需以液體介質(zhì)作為媒介接觸細(xì)菌達(dá)到殺菌效果，故介質(zhì)的黏度、固形物含量、溫度等均會(huì)影響殺菌效果。介質(zhì)黏度是表示流體流動(dòng)時(shí)陰力大小的指標(biāo)，當(dāng)液體黏度高時(shí)，其傳質(zhì)效率低，殺菌難度提高，效果變差。對(duì)于超聲空化而言，其強(qiáng)度受介質(zhì)黏度影響，產(chǎn)生空化泡需要克服介質(zhì)分子間力，若介質(zhì)黏性較大，則難以產(chǎn)生空化。介質(zhì)中含有的固形物除了有提高介質(zhì)黏度不利于超聲波傳播外的特性外，細(xì)菌也可附著在大而粗糙的固形物表面，如果蔬的表面縫隙、與食品直接接觸的粗糙鋼材表面，更“隱蔽”的同時(shí)還能形成生物膜，降低殺菌劑與細(xì)菌的接觸概率及超聲波的作用效果。另外，介質(zhì)中的固體微粒也可以為超聲波提供成核位點(diǎn)，提高空化活性，增強(qiáng)殺菌效果。研究發(fā)現(xiàn)，牛乳中含有的乳糖有助于細(xì)菌合成滲透保護(hù)劑或通過(guò)結(jié)合自身的游離羥基與細(xì)菌細(xì)胞磷脂層的極性頭部而提高抗性。介質(zhì)的酸堿性也會(huì)影響超聲波聯(lián)合殺菌劑的殺菌效果。當(dāng)介質(zhì)中酸性較強(qiáng)時(shí)，殺菌效率更高，如de Freitas等使用145.54 μmol/L乳酸鏈球菌素聯(lián)合超聲波處理志賀氏菌15 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 4.5時(shí)的殺菌效率高于在pH 6.5時(shí)的殺菌效率，這可能是低pH值影響了細(xì)菌細(xì)胞的穩(wěn)定性。另外，介質(zhì)內(nèi)含物還可以作為細(xì)菌損傷后的修復(fù)材料，包括已經(jīng)死亡的個(gè)體也可以為活細(xì)胞提供養(yǎng)分，如Yamamoto等的研究表明在不添加營(yíng)養(yǎng)物的條件下，大腸桿菌菌液（含10CFU/mL死菌和10CFU/mL活菌）25 ℃下1 d內(nèi)活菌數(shù)可恢復(fù)至10～10CFU/mL，Yamamoto等認(rèn)為這是因?yàn)榛罴?xì)胞吸收了死細(xì)胞。

4 超聲波聯(lián)合殺菌劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用

超聲波聯(lián)合殺菌劑在果蔬表面清洗、肉制品保鮮、乳制品殺菌等方面均有應(yīng)用，表1整理了部分研究。在果蔬加工中，兩者聯(lián)用可有效去除農(nóng)藥殘留，抑制多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶和細(xì)胞壁降解酶的活性，穩(wěn)定細(xì)胞壁多糖，并除去表面微生物來(lái)減緩腐爛。Bal等用水楊酸（1 mmol/L）、超聲波（32 kHz）以及超聲波與水楊酸聯(lián)合處理甜櫻桃果實(shí)（10 min），貯藏40 d后腐爛率分別為13.5%、10.8%、3.8%，而對(duì)照組腐敗率高達(dá)24.4%。Mustapha等將超聲波分別與二氯異氰尿酸鈉、過(guò)氧乙酸、過(guò)氧乙酸、過(guò)氧化氫聯(lián)用，其中40 mg/L過(guò)氧乙酸、5%過(guò)氧化氫及超聲波聯(lián)用可使櫻桃番茄表面微生物對(duì)數(shù)值減少3.07～3.10（lg（CFU/g））。同樣地，超聲波與殺菌劑也可用于肉類(lèi)表面除菌，同時(shí)，超聲波還可以起到肉嫩化的作用。乳制品中牛奶常被作為研究對(duì)象，微生物可以附著在脂肪球上而增加殺菌難度，聯(lián)合技術(shù)可以有效滅活牛奶中的微生物群。如Shamila-Syuhada等將5 種腐敗菌、致病菌接種至牛奶中（初始菌量約為8.1（lg（CFU/mL））），采用超聲波（24 kHz、125 μm振幅）和過(guò)氧化氫（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%）聯(lián)用處理10 min即可殺滅接種菌，最大程度維持牛奶品質(zhì)。食品加工過(guò)程中涉及許多塑料管道、不銹鋼器材等，對(duì)這些表面的清潔也是食品質(zhì)量安全控制的重要一環(huán)。Yu Hang等聯(lián)合超聲波（20 kHz、60 W）和二氧化氯（4 mg/L）用于清除4 種與食品直接接觸材料表面的金黃色葡萄球菌生物被膜，處理10 min后金黃色葡萄球菌失活率為99.03%，體現(xiàn)出協(xié)同效果（單獨(dú)超聲波處理為15.86%，單獨(dú)二氧化氯處理為82.62%），Yu Hang等發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理通過(guò)介導(dǎo)群體感應(yīng)信號(hào)分子、細(xì)胞間黏附和多糖細(xì)胞間黏附素產(chǎn)生減少了生物被膜的形成，腸毒素的分泌也被抑制，且接觸材料表面越粗糙，聯(lián)合處理的生物被膜清除率越低。

表1 超聲波聯(lián)合殺菌劑殺菌的研究Table 1 Selected studies of microbial killing by combined treatment of ultrasound with bactericides

5 結(jié) 語(yǔ)

超聲波作為一項(xiàng)有潛力的非熱加工技術(shù)，具有綠色、無(wú)污染的特點(diǎn)，但在單獨(dú)使用時(shí)殺菌效果不理想，需要提高處理強(qiáng)度來(lái)彌補(bǔ)，高強(qiáng)度超聲下大量能量以熱能形式耗散造成浪費(fèi)，也會(huì)縮短儀器壽命；殺菌劑應(yīng)用廣泛，但也存在單獨(dú)使用滲透性不高、濃度高易產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物等問(wèn)題，而殺菌劑聯(lián)合超聲波進(jìn)行殺菌處理，往往可以達(dá)到協(xié)同殺菌效果，既可以解決單獨(dú)超聲波殺菌效果不佳的問(wèn)題，還可以彌補(bǔ)殺菌劑的不足。聯(lián)合殺菌技術(shù)目前雖已在果蔬表面清洗、肉制品保鮮、乳制品殺菌方面有一定的應(yīng)用，但是由于其提高了體系的復(fù)雜程度，目前對(duì)協(xié)同殺菌機(jī)理的研究并不深入，導(dǎo)致其應(yīng)用受限，在今后的研究中可以下列工作為重點(diǎn)：1）明確微生物的應(yīng)急響應(yīng)機(jī)制，結(jié)合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等多組學(xué)對(duì)聯(lián)合技術(shù)影響微生物的分子機(jī)制進(jìn)行整合分析；2）明確超聲波空化效應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，優(yōu)化超聲波空化參數(shù)，實(shí)現(xiàn)空化程度精確調(diào)控，既可以明確在殺菌效果中空化效應(yīng)所占比重，又可以為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考；3）確定通用的基礎(chǔ)細(xì)菌模型、統(tǒng)一的關(guān)鍵殺菌技術(shù)參數(shù)，使各項(xiàng)研究結(jié)果之間能夠互相比較，并整合結(jié)果建立數(shù)據(jù)庫(kù)，為創(chuàng)建新的殺菌模型提供數(shù)據(jù)支持；4）開(kāi)展在食品基質(zhì)中的實(shí)際應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，明確聯(lián)合技術(shù)與食品基質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，為工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。