劉 琇 臧傳寶 林彥超 程 龍 付曉萌

（銀豐低溫醫(yī)學(xué)科技有限公司，濟南 250102）

組織工程產(chǎn)品是近年來組織修復(fù)領(lǐng)域的熱門話題，已逐漸成為目前臨床手術(shù)治療及意外等導(dǎo)致的人體組織器官缺失和各種損傷的重要治療措施，目前組織工程產(chǎn)品面臨的關(guān)鍵問題之一是尋求理想的生物支架材料［1-3］。隨著生物材料技術(shù)的發(fā)展，脫細胞組織基質(zhì)（acellular tissue matrix，ACTM）因其具有天然的三維支架、含有多種細胞活性因子備受關(guān)注，ACTM經(jīng)過各種脫細胞技術(shù)等處理后獲得，主要由膠原蛋白組成，且去除細胞和抗原成分，故較少引起宿主免疫排異反應(yīng)［4-6］。ACTM既可單獨應(yīng)用，也可以負載種子細胞、細胞因子及藥物等，在組織工程再生修復(fù)方面發(fā)揮重要作用。

胎盤、臍帶作為分娩廢棄物，在胎兒出生之后，大都作為醫(yī)療廢物而遺棄，造成極大的浪費。胎盤為母體及胎兒之間物質(zhì)交換的器官，是胚胎與母體組織的結(jié)合體，含有大量的膠原及纖維成分，同時具有多種生長因子促進細胞的生長與代謝。臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）來源于新生兒臍帶組織，目前分離、培養(yǎng)技術(shù)比較成熟，為應(yīng)用比較廣泛的多功能干細胞之一，它能分化成許多種組織細胞，具有成脂、成骨、成軟骨、成肌分化潛能，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［7-11］。

本研究采用脫細胞方法制備胎盤脫細胞基質(zhì)，單獨或負載UC-MSCs進行大鼠皮下植入實驗，評價其生物相容性并探討其作為組織修復(fù)材料的可行性，為組織工程研究尋找合適的支架材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

本研究為隨機對照動物實驗，于2018年11月在濟南市藥監(jiān)局動物實驗中心完成。

1.2 材料

1.2.1 實驗動物

健康SD大鼠，普通級，6周齡，體質(zhì)量120～150 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。本研究所采用的實驗動物及操作程序符合動物實驗相關(guān)倫理學(xué)要求。

1.2.2 主要試劑和儀器

胎牛血清（Gibco，USA），α-MEM細胞培養(yǎng)基（Gibco，USA），EDTA（Sigma，USA），脫氧膽酸鈉（索萊寶，中國），磷酸鹽緩沖液（索萊寶，中國），HEPES（Sigma，USA），DNaseⅠ（索萊寶，中國）；XFA6130全自動血液細胞分析儀（普朗，中國）；石蠟切片機（Leica，GER）；倒置相差顯微鏡（Olympus，JPN）；GM300刀式混合研磨儀（Retsch，GER）；低速離心機（Thermo，USA）；超凈工作臺（蘇州凈化，中國）；CO2培養(yǎng)箱（Heal Force，中國上海）；戊巴比妥鈉（上海榕柏生物技術(shù)有限公司），常規(guī)手術(shù)器械等。

1.3 方法

1.3.1 臍帶間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)、傳代

取健康足月新生兒臍帶組織（由健康產(chǎn)婦分娩后自愿捐贈），于超凈工作臺中采用無菌PBS反復(fù)沖洗臍帶表面，洗凈表面血液及體液，將臍帶剪成3～5 cm小段，剝除臍動、靜脈血管，保留華通膠部分，用組織剪剪碎至1 mm3組織塊，采用組織塊貼壁培養(yǎng)法將剪碎的組織塊離心清洗2遍后，加入含體積分數(shù)10%FBS的ɑ-MEM細胞培養(yǎng)基，將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中進行全貼壁培養(yǎng)。待細胞出現(xiàn)集落生長并融合至80%以上時去除組織塊，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，之后按照1∶4的比例傳至第3代，收集細胞用作后續(xù)實驗。

1.3.2 胎盤脫細胞海綿基質(zhì)材料制備及檢測

胎盤脫細胞海綿基質(zhì)材料制備方法為本課題組開發(fā)且擁有自主產(chǎn)權(quán)的發(fā)明專利（中國專利號CN201911162947.1）［12］。合法取得臨床實驗用胎盤（由健康產(chǎn)婦分娩后自愿捐贈），采集前產(chǎn)婦HBV、HCV、HIV、梅毒標(biāo)志物等病毒檢測均為陰性。用生理鹽水清洗3遍，剪成約2 cm3小塊，生理鹽水反復(fù)清洗3遍至基本無血色；GM300刀式混合研磨儀打碎（3 500 r/min，12 s，4次），1 500×g離心10 min，加入脫細胞溶液（含10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）+10 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）+1.0%（w/v）脫氧膽酸納，pH 8.0）過夜處理16 h；次日1 500×g離心10 min后加入生理鹽水清洗3遍去除洗滌劑；0.1%過氧乙酸處理2 h進行病毒滅活，然后加入2 000 U/L DNaseⅠ酶的緩沖液，搖床過夜處理去除DNA；次日生理鹽水反復(fù)清洗后將胎盤脫細胞基質(zhì)平鋪于不銹鋼器皿中，進行真空冷凍干燥處理，得到海綿基質(zhì)材料（以下簡稱“材料”）。采用電子束滅菌，劑量為18 kGy。

1.3.3 大體觀察及蘇木精-伊紅（HE）染色

觀察胎盤脫細胞海綿基質(zhì)的顏色及形態(tài)，另取脫細胞前胎盤組織及基質(zhì)材料4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片進行HE染色，光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)。

1.3.4 掃描電鏡觀察

取基質(zhì)材料2.5%戊二醛固定，噴金進行掃描電鏡觀察微結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Image J軟件分析材料孔隙率。

1.3.5 實驗動物分組及實驗方法

選取健康雄性SD大鼠39只，體質(zhì)量120～150 g，隨機分為實驗1組、實驗2組及對照組（表1）。具體操作步驟：實驗大鼠于術(shù)前12 h禁飲食，分別稱重后以2%戊巴比妥鈉2 ml/kg麻醉大鼠后背部備皮，選取背部肌肉豐厚的脊柱旁肌為植入位點，消毒后以手術(shù)刀逐層切開皮膚、淺筋膜、深筋膜，分離深筋膜形成一皮囊。實驗1組植入胎盤脫細胞海綿基質(zhì)材料（1 cm×1 cm×4 mm），逐層縫合；實驗2組植入胎盤脫細胞海綿基質(zhì)材料（1 cm×1 cm×4 mm）后，用注射器注入臍帶間充質(zhì)干細胞1 ml（細胞數(shù)為1×105個），逐層縫合；對照組只進行皮下皮囊制備，不植入任何材料，逐層縫合。手術(shù)后每天觀察術(shù)口炎性反應(yīng)及切口愈合情況，分別于第3、5、7天大鼠頸靜脈取血進行血常規(guī)檢測，檢測白細胞（WBC）總數(shù)、淋巴細胞（LY）總數(shù)、單核細胞（MO）總數(shù)、粒細胞（GR）總數(shù)。于術(shù)后第1、2、4、8、9周各處死3只實驗動物，取植入材料及周圍組織，觀察材料降解情況，并進行脫水，石蠟包埋，HE染色觀察炎性細胞浸潤及新生血管情況。

Table 1 Grouping of experimental animals

2 結(jié) 果

2.1 胎盤脫細胞基質(zhì)材料外觀特征及結(jié)構(gòu)特征

按照所示方法構(gòu)建的胎盤脫細胞基質(zhì)材料呈乳白色，海綿狀，置于生理鹽水中復(fù)水后不散落（圖1a、b）。HE染色顯微鏡下觀察脫細胞的胎盤組織未見明顯藍染的細胞核（圖1d）。

2.2 電鏡觀察及孔隙率測定

對材料進行掃描電鏡觀察，可見材料內(nèi)部空隙比較明顯，材料交聯(lián)度較好，且進一步驗證脫細胞效果明顯，無細胞殘留（圖2）。應(yīng)用Image J軟件分析材料平均孔隙率為（77.54±2.53）%。

2.3 炎性反應(yīng)觀察及血常規(guī)檢測結(jié)果分析

術(shù)后每天觀察切口處無紅腫、滲液等炎性反應(yīng)，手術(shù)區(qū)域毛發(fā)正常生長，切口處愈合良好（圖3）。

為了進一步驗證材料是否引起炎性反應(yīng)，分別于皮下植入后第3、5、7天取靜脈血進行血常規(guī)檢測，檢測WBC總數(shù)、LY總數(shù)、MO總 數(shù)、GR總數(shù)。實驗結(jié)果如圖4所示，實驗1組，實驗2組相比于對照組未見明顯的炎性細胞數(shù)增高，未出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)，植入材料存在一定的安全性。

2.4 組織學(xué)觀察

胎盤脫細胞海綿基質(zhì)材料HE染色結(jié)果未見細胞結(jié)構(gòu)，材料呈現(xiàn)網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)（圖5a）。于手術(shù)后第7天對植入材料部位進行取材，進行HE染色分析，可見機體細胞逐漸嵌入材料內(nèi)部生長，實驗2組（圖5c）可見血管深入，初步血管化現(xiàn)象，相對于實驗1組（圖5b），材料靠近中間位置形成較多細胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可見間充質(zhì)干細胞的加入能夠促進機體細胞的遷入生長及血管化。

之后分別于植入后2、4、8、9周取材進行HE染色分析（圖6），植入材料與機體都有很好的組織相容性，實驗2組間充質(zhì)干細胞的加入能夠促進機體細胞的嵌入生長。從第2周開始，植入材料內(nèi)部開始出現(xiàn)明顯血管化（箭頭所示）。實驗1組第8周及第9周HE可以看出，植入材料只剩少量遺留，而實驗2組細胞遷入生長較好，材料相容性好，降解率低。

3 討 論

中國的手術(shù)量居世界首位，對于組織器官缺損傳統(tǒng)的修復(fù)方法是自體組織植入術(shù)，雖然可以取得滿意療效，但它是以犧牲自體健康組織為代價，導(dǎo)致很多并發(fā)癥及附加損傷；人的器官功能衰竭，采用藥物治療、暫時性替代療法可挽救部分病人生命，但供體器官來源極為有限，因免疫排斥反應(yīng)需長期使用免疫抑制劑，由此而帶來的并發(fā)癥有時是致命的［13-15］。

自20世紀80年代科學(xué)家首次提出“組織工程學(xué)”概念以后，為眾多的組織缺損、器官功能衰竭病人的治療帶來了曙光［16-18］。隨著技術(shù)的發(fā)展，組織工程產(chǎn)品逐漸成為臨床上重要的手術(shù)修復(fù)和替代物，目前組織工程材料主要應(yīng)用于心血管手術(shù)、燒傷、骨外科、手足外科、假體、整形等領(lǐng)域，需求量日益增大［19-22］。

組織工程學(xué)核心技術(shù)是將活細胞與生物材料結(jié)合，修復(fù)、重建、維持、恢復(fù)或提高人體組織的功能。脫細胞基質(zhì)（ECM）是種子細胞及再生相關(guān)分子復(fù)合良好支架，保留了細胞外基質(zhì)的生理結(jié)構(gòu)，為種子細胞的種植提供了良好的三維空間結(jié)構(gòu)和生長環(huán)境。種子細胞可以進入脫細胞后，與ECM成分相互作用，產(chǎn)生新生組織［23-27］。植入體內(nèi)后干細胞能在體內(nèi)分化、增殖，理論上能豐富組織細胞和組織結(jié)構(gòu)，解決組織修復(fù)不足的矛盾，提高遠期效果［28］。

本實驗研究中采用胎盤等合法來源的同種異體組織經(jīng)過脫細胞技術(shù)，構(gòu)建成的支架材料，具有免疫原性低、組織相容性好等優(yōu)點，在組織工程材料構(gòu)建及應(yīng)用過程中，細胞的黏附和生長是確定組織工程支架材料安全性及有效性的關(guān)鍵指標(biāo)，按照本實驗方法構(gòu)建的胎盤脫細胞海綿基質(zhì)材料呈海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，平均孔隙率為（77.54±2.53）%，可以為機體細胞的遷入生長提供良好的三維空間結(jié)構(gòu)，其支架結(jié)構(gòu)還可以為細胞黏附提供支撐，促進創(chuàng)面愈合。

本實驗將胎盤脫細胞海綿基質(zhì)材料大鼠皮下植入后未產(chǎn)生明顯的炎性反應(yīng)，血常規(guī)檢測也未見明顯的炎性細胞量升高，在SD大鼠的正常范圍內(nèi)；大鼠皮下植入之后，材料可以很快的與皮下組織融合，細胞嵌入生長，表現(xiàn)出良好的生物相容性，且臍帶間充質(zhì)干細胞的添加能夠短時間內(nèi)促進機體細胞的嵌入生長及血管化。

4 結(jié) 論

胎盤脫細胞海綿基質(zhì)材料具有良好的生物相容性，可作為組織工程材料的理想來源。但由于皮下植入實驗存在一定的局限性，為了更進一步探究胎盤脫細胞海綿基質(zhì)材料的生物安全性及有效性，還需進行大量實驗室驗證及臨床前研究，這對今后組織工程材料開發(fā)及臨床組織修復(fù)應(yīng)用至關(guān)重要。