魏佳佳 李 密** 馮雅琦 劉連慶

（1）中國科學(xué)院沈陽自動化研究所，機(jī)器人學(xué)國家重點實驗室，沈陽 110016；2）中國科學(xué)院機(jī)器人與智能制造創(chuàng)新研究院，沈陽 110169；3）中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

開展溶液流動環(huán)境下的細(xì)胞力學(xué)特性研究對于揭示癌癥等重大疾病的內(nèi)在機(jī)制具有重要科學(xué)意義。最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示2020年全球癌癥新發(fā)病例1 930萬，死亡病例1 000萬［1］，其中中國癌癥新增病例數(shù)（457萬）和死亡病例數(shù)（300萬）均位居全球第一［2］。癌癥已成為人類生命健康的重要威脅，闡明癌癥發(fā)生發(fā)展及演變過程的內(nèi)在機(jī)理對于癌癥的臨床診療及防控具有關(guān)鍵性的作用。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的最主要原因（>90%）［3］。過去的數(shù)十年中，研究人員針對轉(zhuǎn)移癌癥的發(fā)病機(jī)制及其臨床治療開展了大量研究，如腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)制［4］、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［5］、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞［6］、腫瘤基質(zhì)［7］、轉(zhuǎn)移癌癥靶向治療［8］等，增加了人們對轉(zhuǎn)移癌癥的認(rèn)識，但整體而言目前人們對癌癥轉(zhuǎn)移內(nèi)在機(jī)理的了解，特別是在癌細(xì)胞與體液流動環(huán)境之間的相互作用方面，仍然極其有限。體液流動環(huán)境及其力學(xué)特性在腫瘤的生長、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及治療過程中起著重要的調(diào)控作用［9］。在癌癥轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞處于多種不同類型的體液微環(huán)境中（如癌細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中運(yùn)動時處于組織液微環(huán)境中，癌細(xì)胞在血管/淋巴管中運(yùn)動時處于血液/淋巴液微環(huán)境中［10］），癌細(xì)胞與體液微環(huán)境之間的相互作用對于癌細(xì)胞的最終轉(zhuǎn)移及增殖具有重要影響［11］。特別是，近年來對腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中癌細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行的研究結(jié)果表明了正常細(xì)胞與良性腫瘤細(xì)胞及侵襲性腫瘤細(xì)胞之間力學(xué)特性的顯著差異［12-15］，顯示了細(xì)胞力學(xué)特性對癌細(xì)胞生理行為的重要指示作用。因此，對溶液流動環(huán)境下的細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行研究有助于揭示腫瘤轉(zhuǎn)移過程中癌細(xì)胞與體液微環(huán)境之間相互作用的力學(xué)機(jī)制。

原子力顯微鏡（AFM）的發(fā)明為細(xì)胞力學(xué)特性研究提供了新的強(qiáng)大工具。AFM可以直接在溶液環(huán)境下以前所未有的時空分辨率（納米級空間分辨率、毫秒級時間分辨率）［16］對活體狀態(tài)生物樣本的表面形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行免標(biāo)記成像。特別是，通過控制AFM探針在細(xì)胞表面進(jìn)行壓痕實驗并對壓痕實驗過程中獲取的力曲線進(jìn)行分析，AFM可以對細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行定量探測［17］。此外，近年來還出現(xiàn)了基于力曲線的AFM峰值力輕敲（PFT）多參數(shù)成像模式，可以同步快速獲取單個活細(xì)胞的形貌圖和力學(xué)特性圖［18-21］，極大地提升了AFM在細(xì)胞力學(xué)特性探測方面的能力。與光鑷、磁鑷等其他單細(xì)胞力學(xué)特性探測方法相比，AFM具有獨特的優(yōu)勢。光鑷導(dǎo)致的介質(zhì)熱效應(yīng)會對細(xì)胞生理活動造成損傷，磁鑷則需要預(yù)先對細(xì)胞進(jìn)行磁性顆粒標(biāo)記［22］。與光鑷、磁鑷相比，AFM無需預(yù)先對細(xì)胞進(jìn)行任何處理且可以在生理環(huán)境下對活體狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行無損探測，因此AFM已成為微納尺度生物樣本力學(xué)特性探測與表征的標(biāo)準(zhǔn)方法之一［23-25］，在生命科學(xué)域得到了廣泛應(yīng)用，為細(xì)胞和分子生物學(xué)帶來了大量新的認(rèn)識［26］。過去的數(shù)十年中，研究人員利用AFM對癌細(xì)胞的力學(xué)特性開展了廣泛的研究［13-14，27-31］，極大地增加了人們對癌細(xì)胞生理行為的認(rèn)識。然而需要指出的是，現(xiàn)有基于AFM的癌細(xì)胞力學(xué)特性研究集中在靜態(tài)溶液環(huán)境［13-14，27-31］，忽略了溶液流動環(huán)境對癌細(xì)胞力學(xué)特性的影響，測量結(jié)果無法反映完全反映癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的力學(xué)特性。

針對上述問題，本文通過將液流控制技術(shù)和AFM結(jié)合，實現(xiàn)了溶液流動環(huán)境下的細(xì)胞力學(xué)特性測量?；谝毫骺刂萍夹g(shù)構(gòu)建了細(xì)胞培養(yǎng)基動態(tài)液流系統(tǒng)并實現(xiàn)了溶液流動環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上通過將培養(yǎng)基動態(tài)液流系統(tǒng)和AFM結(jié)合實現(xiàn)了溶液流動環(huán)境下的細(xì)胞力學(xué)特性測量，實驗結(jié)果揭示了溶液流動環(huán)境對癌細(xì)胞力學(xué)特性的顯著影響。研究結(jié)果為研究腫瘤轉(zhuǎn)移過程中癌細(xì)胞與體液微環(huán)境之間的相互作用提供了新的方法和思路，對于生命科學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的基礎(chǔ)意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

實驗所用的MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞）和HGC-27（人未分化胃癌細(xì)胞）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海）。細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)液、RPMI-1640）以及磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海典瑞生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Thermo Fisher公司，青霉素-鏈霉素溶液購自美國Hyclone公司，多聚賴氨酸、抗熒光衰減封片劑購自北京索萊寶科技有限公司。細(xì)胞熒光染色相關(guān)試劑，包括鈣黃綠素（Calcein-AM）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、肌動蛋白紅色熒光探針（Actin-Tracker Red-555）、4%多聚甲醛固定液等，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。MCF-7細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HGC-27細(xì)胞在含有10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640培養(yǎng)。所有細(xì)胞均接種在培養(yǎng)皿中，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）中培養(yǎng)（37℃，5% CO2，95%空氣）。

1.2 樣本制作

利用去離子水（德國Milli-Q）將多聚賴氨酸原液稀釋10倍，隨后將干凈的蓋玻片置于稀釋后的多聚賴氨酸溶液中室溫孵育30 min。孵育完成后將蓋玻片置于生物安全柜（美國Thermo Fisher公司）內(nèi)并利用生物安全柜的紫外燈對蓋玻片進(jìn)行殺菌處理24 h。將滅菌處理后的蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，隨后在細(xì)胞傳代時將細(xì)胞懸浮液滴至蓋玻片上并靜置5 min。隨后往培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)皿置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞在蓋玻片表面貼壁生長至80%~90%時即可將蓋玻片置于動態(tài)液流細(xì)胞培養(yǎng)裝置（圖1a）進(jìn)行實驗。

1.3 培養(yǎng)基動態(tài)液流細(xì)胞培養(yǎng)裝置搭建

溶液流動環(huán)境下的細(xì)胞力學(xué)特性測量系統(tǒng)（圖1b）由AFM（Dimension Icon，美國Bruker公司）和培養(yǎng)基動態(tài)液流細(xì)胞培養(yǎng)裝置構(gòu)成。利用液流控制技術(shù)搭建培養(yǎng)基動態(tài)液流細(xì)胞培養(yǎng)裝置，主要包括注射泵（F6雙道微量注射泵，浙江史密斯醫(yī)學(xué)儀器有限公司）、抽取泵（LSP02-1B，蘭格恒流泵有限公司）、醫(yī)用注射器（50 ml）、醫(yī)用微量泵延長管（直徑2 mm）、加溫器（深圳博遠(yuǎn)太和科技有限公司）、三通旋塞、側(cè)面開孔的培養(yǎng)皿（底面直徑30 mm，高3 mm）和蓋玻片（長20 mm，寬20 mm，厚0.2 mm）等。側(cè)面開孔培養(yǎng)皿通過在培養(yǎng)皿對稱兩側(cè)利用電烙鐵穿孔（孔徑為2 mm）制作而成，隨后將側(cè)面開孔培養(yǎng)皿與微量泵延長管通過橡膠黏合劑連接。與注射泵相連的微量泵延長管置于加溫器的卡槽中，加溫器的作用是對微量泵延長管中的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)熱。三通旋塞的作用是使雙通道注射泵實現(xiàn)連續(xù)注射。注射泵以一定的流速（0.1~1 200 ml/h）向側(cè)面開孔培養(yǎng)皿內(nèi)注入DMEM或者RPMI-1640培養(yǎng)基，與此同時抽取泵以相同的流速在側(cè)面開孔培養(yǎng)皿的另一側(cè)抽取培養(yǎng)基，使側(cè)面開孔培養(yǎng)皿中形成連續(xù)穩(wěn)定的培養(yǎng)基動態(tài)液流環(huán)境，以此來模擬細(xì)胞所處的液流環(huán)境。為了研究培養(yǎng)基動態(tài)流動環(huán)境對細(xì)胞生長的影響，將培養(yǎng)基動態(tài)液流細(xì)胞培養(yǎng)裝置搭建在光學(xué)倒置顯微鏡（Eclipse Ti，日本Nikon公司）上（圖1c）并對細(xì)胞生長情況進(jìn)行連續(xù)觀測。該顯微鏡擁有加熱板可對側(cè)面開孔培養(yǎng)皿進(jìn)行加熱以維持細(xì)胞生長所需的37℃環(huán)境。

1.4 溶液流動環(huán)境下AFM細(xì)胞力學(xué)特性測量

利用AFM對培養(yǎng)基動態(tài)液流環(huán)境下培養(yǎng)下的細(xì)胞的力學(xué)特性進(jìn)行測量。所采用的AFM探針（圖1bIII，IV）型號為MLCT-C（美國Bruker公司），探針懸臂梁的標(biāo)準(zhǔn)彈簧系數(shù)為0.01 N/m，探針材料為氮化硅，針尖曲率半徑為20 nm。在光學(xué)顯微鏡導(dǎo)引下控制AFM探針移動到細(xì)胞進(jìn)行壓痕實驗并在細(xì)胞表面獲取力曲線。為保證測量數(shù)據(jù)之間的可比性，力曲線采集時的所有參數(shù)保持一致：力曲線范圍為2μm，探針逼近速度為4μm/s，力曲線采樣點數(shù)為256。在細(xì)胞表面獲取力曲線之前，通過控制AFM探針在蓋玻片空白區(qū)域獲取力曲線來校準(zhǔn)探針懸臂梁的偏轉(zhuǎn)靈敏度并通過AFM的熱噪聲模塊校準(zhǔn)精確懸臂梁的彈簧系數(shù)。

測量動態(tài)液流條件下的細(xì)胞力學(xué)特性時，首先將接種有細(xì)胞的蓋玻片置于動態(tài)培養(yǎng)裝置中，在光學(xué)顯微鏡導(dǎo)引下控制AFM探針對蓋玻片中心附近的10個細(xì)胞進(jìn)行測量并獲取力曲線（0 h），在每個細(xì)胞表面獲取20條力曲線。測量完成之后，啟動注射泵和抽取泵以使培養(yǎng)液以一定的流速（30、60、120 ml/h）持續(xù)流經(jīng)蓋玻片一定時間（1、2、3、4 h）后停止溶液流動。隨后控制AFM探針再次對蓋玻片中心附近的10個細(xì)胞進(jìn)行測量并獲取力曲線（每個細(xì)胞表面獲取20條力曲線）。

作為對照組，利用AFM對靜態(tài)溶液培養(yǎng)下的細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行測量。將接種有細(xì)胞的蓋玻片置于普通培養(yǎng)皿中并控制AFM探針在蓋玻片中心附近對10個細(xì)胞進(jìn)行測量以獲取力曲線（0 h）。隨后將含有細(xì)胞的普通培養(yǎng)皿置于光學(xué)倒置顯微鏡的加熱板中靜態(tài)培養(yǎng)一定時間（1、2、3、4 h）。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)皿置于AFM樣本臺，利用AFM再次對蓋玻片中心附近的10個細(xì)胞進(jìn)行測量獲取力曲線。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過對AFM壓痕實驗過程中獲取的力曲線進(jìn)行分析以提取細(xì)胞楊氏模量。原始力曲線包括逼近曲線和回退曲線（圖2a）。通常對逼近曲線分析得到細(xì)胞楊氏模量［32］，而回退曲線則主要用于分析細(xì)胞黏附特性。首先需要確定逼近曲線的接觸點。在逼近曲線上，接觸區(qū)域內(nèi)的方差將比非接觸區(qū)域內(nèi)的方差大得多，因此可通過遍歷逼近曲線上所有的點的右側(cè)小間隔N上的方差與左側(cè)小間隔N上方差的比值（ROV）來確定接觸點，即ROV取最大值的點［33］：

本文通過編寫Matlab（美國Mathworks公司）程序?qū)崿F(xiàn)接觸點自動選擇（N值設(shè)為10）并同時與人工識別結(jié)合以確定接觸點。根據(jù)接觸點（圖2b）將逼近曲線轉(zhuǎn)化為壓痕曲線（圖2c）后（壓痕深度等于探針垂直方向位置變化量減去探針懸臂梁形變量），利用Hertz-Sneddon模型對壓痕曲線進(jìn)行擬合（圖2d）即可得到細(xì)胞楊氏模量（Hertz模型適用于球形針尖而Sneddon模型適用于錐形針尖）［31］：

式中F為探針加載力，E為樣本的楊氏模量，R為球形針尖半徑，θ為錐形針尖半開角，δ為壓痕深度，υ為被測樣本的泊松比（一般認(rèn)為活細(xì)胞為不可壓縮材料，因此活細(xì)胞的泊松比為0.5）。本文使用的探針針尖形狀為錐形，因此采用Sneddon模型公式對力曲線進(jìn)行分析。根據(jù)胡克定律計算探針加載力：

式中k為探針懸臂梁的彈性系數(shù)，通過AFM熱噪聲模塊校正得到，x為探針懸臂梁的形變量，從獲取的力曲線得到。對壓痕曲線的Hertz-Sneddon擬合過程通過編寫的Matlab程序?qū)崿F(xiàn)。

使用數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件GraphPad Prism（美國GraphPad Software公司）對初始狀態(tài)（0 h）以及在培養(yǎng)基動態(tài)液流環(huán)境下生長一定時間（1、2、3、4 h）后的細(xì)胞楊氏模量數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗分析以評估兩組數(shù)據(jù)之間的顯著性差異，P值<0.05即說明數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。

1.6 熒光顯微成像

利用細(xì)胞活性熒光檢測試劑（Calcein對活細(xì)胞進(jìn)行染色，PI對死細(xì)胞進(jìn)行染色）分析動態(tài)液流環(huán)境對細(xì)胞生長增殖的影響。對于動態(tài)液流環(huán)境下生長8 h后的細(xì)胞（細(xì)胞生長在載玻片表面），首先利用PBS清洗細(xì)胞，隨后將含有Calcein和PI的染色液滴加至細(xì)胞并于室溫下避光孵育20 min。孵育完成后將載玻片置于光學(xué)倒置顯微鏡（Eclipse Ti，日本Nikon公司）上獲取細(xì)胞熒光圖像。作為對照，利用Calcein和PI染色液對靜態(tài)環(huán)境下生長8 h的細(xì)胞進(jìn)行熒光染色成像。

利用細(xì)胞骨架染色試劑并結(jié)合共聚焦熒光顯微鏡分析動態(tài)液流環(huán)境對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，實驗步驟如下：a.利用PBS溶液洗滌蓋玻片細(xì)胞樣本2次，隨后向樣品中加入多聚甲醛固定液對細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)固定20 min；b.化學(xué)固定完畢后再次利用PBS溶液洗滌細(xì)胞樣本3次（5 min/次）；c.取5μl細(xì)胞骨架熒光試劑（Actin-Tracker Red-555）并利用1 ml PBS對其進(jìn)行稀釋；d.取稀釋后的熒光試劑溶液對化學(xué)固定后的細(xì)胞進(jìn)行染色，并置于室溫下避光孵育60 min；e.使用抗熒光衰減封片劑將細(xì)胞蓋玻片與干凈載玻片黏結(jié)在一起，隨后將細(xì)胞樣本置于轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡（日本Nikon公司）樣本臺并利用60倍油鏡對細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察成像。

2 結(jié)果與討論

首先構(gòu)建了培養(yǎng)基動態(tài)液流系統(tǒng)并分析了溶液流動環(huán)境對細(xì)胞生長的影響。為了測試所搭建的培養(yǎng)基動態(tài)液流系統(tǒng)（圖1b），將1.5 ml黑色墨水（得力集團(tuán)有限公司）添加至動態(tài)液流裝置的培養(yǎng)皿中并將PBS加入至注射泵，設(shè)定不同流速啟動注射泵和抽取泵后對培養(yǎng)皿內(nèi)的溶液進(jìn)行連續(xù)成像（圖3）?？梢钥吹匠跏紶顟B(tài)時（0 min）培養(yǎng)皿中的溶液為黑色，而當(dāng)啟動注射泵和抽取泵后，注射泵中無色透明的PBS被快速注入到培養(yǎng)皿中（黃色箭頭指示），與此同時培養(yǎng)皿中的黑色溶液逐步被轉(zhuǎn)運(yùn)至抽取泵中（藍(lán)色箭頭指示）。當(dāng)流速為30 ml/h時，注射泵和抽取泵運(yùn)行10 min后，培養(yǎng)皿中的黑色溶液殘留非常微弱（圖3a）。當(dāng)流速增加時，則將培養(yǎng)皿中黑色溶液排盡所需的時間隨之顯著縮短（圖3b，c），顯示了所搭建動態(tài)液流系統(tǒng)的有效性。隨后將生長有MCF-7細(xì)胞的蓋玻片置于干凈滅菌的培養(yǎng)基動態(tài)液流系統(tǒng)的培養(yǎng)皿中，在30 ml/h流速下生長8 h。作為對照，將MCF-7細(xì)胞蓋玻片置于光學(xué)倒置顯微鏡加熱板（圖1c）在靜態(tài)培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)8 h。可以看到靜態(tài)培養(yǎng)8 h后，細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖4a），而動態(tài)液流環(huán)境下生長的細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖4b）。進(jìn)一步利用熒光試劑分別對培養(yǎng)基靜態(tài)環(huán)境下和培養(yǎng)基動態(tài)環(huán)境下（30 ml/h流速）生長8 h后的MCF-7細(xì)胞活性進(jìn)行檢測分析（圖5）?？梢钥吹脚囵B(yǎng)基動態(tài)環(huán)境下生長8 h后細(xì)胞具有活性（綠色熒光指示活細(xì)胞），與此同時培養(yǎng)基靜態(tài)環(huán)境下生長8 h后的死細(xì)胞數(shù)量顯著多于培養(yǎng)基動態(tài)環(huán)境下生長的死細(xì)胞數(shù)量（紅色熒光指示死細(xì)胞）。圖4和圖5的實驗結(jié)果表明了培養(yǎng)基動態(tài)環(huán)境更有助于細(xì)胞生長增殖。分析其原因，動態(tài)液流環(huán)境能夠?qū)⒓?xì)胞生長過程中產(chǎn)生的代謝物及時排出并可提供持續(xù)的細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)條件，因此更能促進(jìn)細(xì)胞生長。

隨后將培養(yǎng)基動態(tài)液流系統(tǒng)和AFM結(jié)合建立了溶液流動環(huán)境下的細(xì)胞力學(xué)特性測量流程。通過將培養(yǎng)基動態(tài)液流系統(tǒng)搭建在AFM樣品臺上（圖1b），控制AFM探針對兩側(cè)開孔培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行壓痕實驗（圖1bIII，IV）并獲取力曲線，應(yīng)用理論模型對獲取的力曲線進(jìn)行分析即可得到細(xì)胞楊氏模量（圖2）。需要指出的是，除了Hertz-Sneddon模型，還有多種模型可以從力曲線中提取細(xì)胞楊氏模量，如Johnson-Kendall-Roberts（JKR）模型和Derjaguin-Muller-Toporov（DMT）模型，但在實際中Hertz-Sneddon模型是應(yīng)用得最廣泛的模型［34-35］。需要指出的是，Hertz-Sneddon模型基于一系列對被探測樣本的假設(shè)，包括各向同性、均質(zhì)、無限厚等［36］。盡管活細(xì)胞并不符合Hertz-Sneddon模型的假設(shè)條件，但研究表明當(dāng)壓痕深度小于細(xì)胞厚度10%時，Hertz-Sneddon模型仍然適用［37-38］。利用Sneddon模型對壓痕曲線進(jìn)行擬合的結(jié)果（圖2d）顯示，實驗壓痕曲線和Sneddon理論壓痕曲線吻合，表明了Sneddon模型的有效性。目前AFM壓痕分析方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于探測細(xì)胞力學(xué)特性，但現(xiàn)有利用AFM對細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行的研究還集中在靜態(tài)溶液環(huán)境［39-41］，利用AFM對溶液流動環(huán)境下的細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行探測的研究還不多見。本文通過將培養(yǎng)基動態(tài)液流系統(tǒng)與AFM結(jié)合實現(xiàn)了對溶液流動環(huán)境下細(xì)胞力學(xué)特性的探測，為液流環(huán)境下的單細(xì)胞力學(xué)行為研究提供了新的可能。

基于所建立的方法揭示了溶液流動環(huán)境對癌細(xì)胞力學(xué)特性的影響。首先對培養(yǎng)基靜態(tài)環(huán)境下生長4 h的MCF-7細(xì)胞的楊氏模量進(jìn)行連續(xù)測量（圖6）。圖6（a~e）分別為0、1、2、3、4 h在MCF-7細(xì)胞表面獲取的典型力曲線及Sneddon擬合結(jié)果，圖6f為細(xì)胞楊氏模量變化統(tǒng)計結(jié)果?？梢钥吹組CF-7細(xì)胞在靜態(tài)環(huán)境下生長時細(xì)胞楊氏模量首先呈現(xiàn)上升的趨勢（0~2 h），當(dāng)細(xì)胞生長3 h時細(xì)胞楊氏模量下降，而當(dāng)細(xì)胞生長4 h時細(xì)胞楊氏模量再次上升。與初始狀態(tài)（0 h）相比，在靜態(tài)環(huán)境下生長4 h的MCF-7細(xì)胞楊氏模量顯著增加。隨后對培養(yǎng)基溶液流動環(huán)境下生長的MCF-7細(xì)胞楊氏模量變化進(jìn)行探測，分別對不同流速（30、60、120 ml/h）下生長的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行測量（圖7）。為了消除細(xì)胞傳代批次差異對測量結(jié)果的影響，進(jìn)行了12組獨立實驗。對于每組實驗，在將生長有MCF-7細(xì)胞的蓋玻片置于培養(yǎng)基動態(tài)流動裝置中時，首先對MCF-7細(xì)胞的楊氏模量進(jìn)行測量（0 h），隨后啟動注射泵和抽取泵，并在一定的流速（30、60、120 ml/h）下培養(yǎng)一定時間后（1、2、3、4 h）再次對MCF-7細(xì)胞的楊氏模量進(jìn)行測量。從圖7可以看到在培養(yǎng)基溶液流動環(huán)境下培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞的楊氏模量均呈現(xiàn)下降的趨勢，特別是當(dāng)流速增加時，細(xì)胞楊氏模量下降的趨勢更為明顯?？紤]到細(xì)胞骨架在細(xì)胞機(jī)械方面起著重要的調(diào)控作用［42］，通過對細(xì)胞肌動蛋白進(jìn)行染色分析溶液流動環(huán)境對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響（圖8）。可以看到初始狀態(tài)時（圖8a）細(xì)胞微絲骨架分布不規(guī)則，而當(dāng)在溶液流動環(huán)境下生長4 h后細(xì)胞的微絲骨架呈現(xiàn)線性分布（圖8b），表明了溶液流動環(huán)境對細(xì)胞骨架排列的影響。進(jìn)一步利用所建立的方法分別對靜態(tài)環(huán)境和流動環(huán)境下生長的HGC-27細(xì)胞楊氏模量變化情況進(jìn)行測量（圖9）。可以看到，靜態(tài)條件下生長的HGC-27細(xì)胞楊氏模量首先呈現(xiàn)下降的趨勢（0~3 h），而當(dāng)細(xì)胞生長4 h時細(xì)胞楊氏模量顯著增加（圖9a）。與初始狀態(tài)（0 h）相比，在靜態(tài)環(huán)境下生長4 h的HGC-27細(xì)胞楊氏模量無明顯差異。當(dāng)HGC-27細(xì)胞在溶液流動環(huán)境下生長時，細(xì)胞楊氏模量均呈現(xiàn)明顯下降的趨勢（圖9b~e）。綜合圖6、7、9的實驗結(jié)果，可以看到當(dāng)癌細(xì)胞在靜態(tài)環(huán)境下生長時，不同類型的癌細(xì)胞的楊氏模量變化具有差異性，而當(dāng)癌細(xì)胞在動態(tài)環(huán)境下生長時，細(xì)胞楊氏模量均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢，且溶液流速增加會導(dǎo)致細(xì)胞楊氏模量變化更明顯。

在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，從原發(fā)灶部位脫離的癌細(xì)胞需要穿過細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入血管或者淋巴管，隨著血液或者淋巴液到達(dá)轉(zhuǎn)移部位，并需要在血液或淋巴液的液流環(huán)境下生存下來以便最終穿出血管或者淋巴管進(jìn)入轉(zhuǎn)移部位進(jìn)行增殖［43］。脈管系統(tǒng)體液流動微環(huán)境在癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中起著重要的調(diào)控作用［11］，然而由于缺乏合適的觀測工具，目前對于溶液流動環(huán)境下的細(xì)胞力學(xué)特性行為的認(rèn)知還十分有限。事實上研究人員利用AFM對不同侵襲能力癌細(xì)胞的力學(xué)特性進(jìn)行測量的結(jié)果表明侵襲性癌細(xì)胞的楊氏模量要明顯小于惰性癌細(xì)胞的楊氏模量［14，44-45］。本文的測量結(jié)果（圖6、7、9）顯示，當(dāng)癌細(xì)胞置于培養(yǎng)基流動環(huán)境下生長時，癌細(xì)胞的楊氏模量會明顯下降，顯示了液流環(huán)境對癌細(xì)胞力學(xué)特性的顯著影響。2017年Oliveira等［46］利用開放式微流控芯片技術(shù)研究了培養(yǎng)基溶液流動環(huán)境（流速范圍為30~180 ml/h）下的成肌細(xì)胞（C2C12）生長分化情況，顯示了溶液流動環(huán)境對細(xì)胞分化的影響。本文通過構(gòu)建細(xì)胞培養(yǎng)基動態(tài)液流系統(tǒng)并與AFM結(jié)合探測了不同培養(yǎng)基流速下（30、60、120 ml/h）的癌細(xì)胞楊氏模量變化情況，實驗結(jié)果（圖6、7、9）顯示了溶液流動環(huán)境對細(xì)胞楊氏模量的顯著影響。與此同時，對溶液流動環(huán)境下生長的細(xì)胞骨架蛋白進(jìn)行共聚焦成像，結(jié)果顯示在溶液流動環(huán)境下生長的細(xì)胞微絲骨架呈現(xiàn)明顯的線性分布（圖8），顯示了溶液流動環(huán)境對細(xì)胞骨架的影響。以往的研究［47-48］表明，微絲骨架對于細(xì)胞力學(xué)特性具有重要影響，微絲骨架的重排會導(dǎo)致細(xì)胞力學(xué)特性的相應(yīng)變化。本文的研究顯示當(dāng)癌細(xì)胞在培養(yǎng)基流動環(huán)境下生長時，其細(xì)胞骨架和力學(xué)特性均會發(fā)生顯著變化，顯示了溶液流動環(huán)境與細(xì)胞結(jié)構(gòu)及力學(xué)特性之間的關(guān)聯(lián)，為液流環(huán)境下癌細(xì)胞的力學(xué)行為提供了新的認(rèn)識。

基于AFM的溶液流動環(huán)境下細(xì)胞力學(xué)特性探測將對于生命科學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的積極意義。體液流動微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及演變和臨床治療過程中（如腫瘤血管生成［49］、腫瘤藥物遞送［50］、腫瘤內(nèi)部血流時間變化［51］、血腦屏障以及血腫瘤屏障［52］等）起著重要的作用，研究溶液流動環(huán)境與癌細(xì)胞之間的相互作用對于揭示腫瘤活動內(nèi)在機(jī)制具有重要意義。AFM目前被廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞力學(xué)特性研究，但利用AFM對溶液流動環(huán)境下的細(xì)胞力學(xué)特性進(jìn)行探測的研究還未見報道。本文利用注射泵/抽取泵液流控制技術(shù)構(gòu)建了培養(yǎng)基動態(tài)液流系統(tǒng)并將其與AFM集成，實現(xiàn)了溶液流動環(huán)境下細(xì)胞力學(xué)特性的定量測量，對靜態(tài)和動態(tài)環(huán)境下生長的癌細(xì)胞進(jìn)行探測的實驗結(jié)果顯示了培養(yǎng)基溶液流動環(huán)境會顯著影響細(xì)胞力學(xué)特性和骨架結(jié)構(gòu)，證明了AFM探測溶液流動環(huán)境下細(xì)胞力學(xué)特性的能力，為溶液流動環(huán)境下細(xì)胞力學(xué)行為研究提供了新的方法。體液循環(huán)系統(tǒng)在人體生命活動過程中起著重要作用，如血液將氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、激素等運(yùn)送到全身各處組織器官以維持生命活動運(yùn)轉(zhuǎn)［53］。特別是細(xì)胞在生命活動過程中會分泌各種物質(zhì)（如外泌體）至體液中循環(huán)以調(diào)節(jié)生理病理活動過程［54］。因此本文所發(fā)展的溶液流動環(huán)境下細(xì)胞力學(xué)特性探測方法不僅有助于研究癌細(xì)胞流變力學(xué)行為，還可廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域相關(guān)科學(xué)問題的研究。

3 結(jié) 論

本文提出了基于AFM的溶液流動環(huán)境下細(xì)胞力學(xué)特性測量方法，揭示了溶液流動環(huán)境對癌細(xì)胞力學(xué)特性的顯著影響，為單細(xì)胞流變力學(xué)行為研究提供了新的方法，對于探索發(fā)現(xiàn)生命活動內(nèi)在奧秘機(jī)制具有廣泛積極意義。