譚 佳 郭瑩瑩 周新麗

（上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093）

近年來(lái)，由于各種因素（包括放化療、遺傳和先天性疾病等）引起的不孕不育發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。不孕癥還會(huì)破壞患者的心理健康［1］，保留生育能力對(duì)于保證患者的生活質(zhì)量至關(guān)重要［2］。常用的男性生殖力保存方法為精子保存，是一種有效并且無(wú)創(chuàng)的生育力保存方法［3-6］。但是，患有少精癥或無(wú)精癥的男子難以采集正?；钚缘木印Ａ硗?，由于癌癥患者趨于年輕化，被診斷患有癌癥的兒童，治愈率可能高達(dá)80%［7-8］，而癌癥治療可能對(duì)睪丸生殖細(xì)胞帶來(lái)?yè)p害，30%的男性兒童癌癥幸存者在成年時(shí)將患無(wú)精子癥［9］。因此，對(duì)于無(wú)精子癥及無(wú)法產(chǎn)生精子的青春期前癌癥患者，無(wú)法采用精子冷凍方法對(duì)他們進(jìn)行生殖力保存，冷凍保存睪丸組織用于后期移植可能是保持生育力的另一有效選擇。睪丸組織可以用兩種不同的形態(tài)進(jìn)行保存：a.睪丸細(xì)胞懸液；b.睪丸組織塊凍存。細(xì)胞懸浮液制備需要機(jī)械或酶促消化組織，存在影響細(xì)胞活性的風(fēng)險(xiǎn)。此外，睪丸組織本身的功能結(jié)構(gòu)有明顯的細(xì)胞間依賴關(guān)系，細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用的缺失也可能對(duì)細(xì)胞增殖和分化造成危害。為了保持精原干細(xì)胞的成熟能力，青春期前睪丸組織中的所有不同生殖細(xì)胞需要一起保存［10］。因此，睪丸組織塊的保存被認(rèn)為是一種良好的替代方法，保存組織中完整的生精小管可維持細(xì)胞間相互作用以保留精原干細(xì)胞存活所必需的生理環(huán)境。

目前，常用的塊狀睪丸組織低溫保存技術(shù)是慢速冷凍保存。Milazzo等［11］對(duì)未成熟小鼠睪丸組織冷凍保存方案進(jìn)行了優(yōu)化，得出睪丸組織的慢速冷凍程序：4℃停留30 min以加載低溫保護(hù)劑，2℃/min降至-9℃，停留8 min，0.3℃/min降至-40℃，25℃/min降至-150℃，后投入液氮。解凍后顯示了代表細(xì)胞增殖能力的抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體約80%呈陽(yáng)性表達(dá)，與對(duì)照組（91%）仍有一些差距。Unni等［12］運(yùn)用類似程序?qū)θ瞬G丸組織凍存后培養(yǎng)48 h，結(jié)果顯示了約50%的活性，遠(yuǎn)低于對(duì)照組（70%）。Kvist等［13］、Keros等［14-15］、Travers等［16］、Shinohara等［17］均運(yùn)用相似程序?qū)θ嘶騽?dòng)物模型睪丸組織進(jìn)行了慢速冷凍保存。雖然睪丸組織的慢速冷凍取得了一定的成果，但是根據(jù)慢速冷凍的原理，上述睪丸組織冷凍程序存在兩個(gè)問(wèn)題：一是常用慢速冷凍程序所用加載保護(hù)劑時(shí)間為30 min，即使所需保護(hù)劑濃度較低，長(zhǎng)時(shí)間浸泡仍會(huì)對(duì)組織造成不可逆的毒性損傷；二是降溫的第一、二階段的降溫速率較慢，保護(hù)劑加載完成后經(jīng)過(guò)近2 h才投入液氮，對(duì)組織造成較大的溶質(zhì)損傷及毒性損傷。

慢速冷凍過(guò)程中常用的低溫保護(hù)劑二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）具有一定的生物毒性［18］。苗俊英等［19］發(fā)現(xiàn)，DMSO會(huì)誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞核DNA凝縮和核片段化，最后形成凋亡小體，且隨著DMSO濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯下降，用2%的DMSO處理細(xì)胞12 h后凋亡率達(dá)17.21%。在臨床應(yīng)用中已有研究表明，DMSO未完全洗脫將引起血管內(nèi)溶血和血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高等副作用［20］，患者出現(xiàn)腎功能衰竭肺水腫、心臟驟停和支氣管痙攣等副作用［21］。因此，有必要研究在保證凍存效果的前提下減少滲透保護(hù)劑DMSO用量的方法。Huang等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在溶液降溫至成核溫度之前進(jìn)行置核操作，使溶液中形成局部冰晶以提高胞外滲透壓，在滲透壓差作用下細(xì)胞緩慢脫水，以減少胞內(nèi)冰的形成，可達(dá)到替代滲透性保護(hù)劑的作用。另外，置核可釋放大量自由能，抑制升溫期間再結(jié)晶現(xiàn)象以提高凍后效果。在慢速冷凍過(guò)程中，若冰晶以極快的速率在胞外形成，胞內(nèi)水來(lái)不及脫出，將對(duì)細(xì)胞造成冰晶損傷，凍結(jié)過(guò)程的早期增加置核程序可通過(guò)在相對(duì)較高的零下溫度下人為形成晶核，可以降低過(guò)冷的破壞作用［23-24］。目前，還未有研究者探究通過(guò)置核降低睪丸組織凍存所需滲透保護(hù)劑DMSO濃度，以及不同置核溫度下形成冰晶對(duì)睪丸組織凍存效果的影響機(jī)理。

針對(duì)以上問(wèn)題，本文首先提出改進(jìn)兩步法冷凍，縮短了保護(hù)劑的加載時(shí)間，將第一步的降溫速率提升至1℃/min降至-40℃后直接投入液氮。比較常用慢速冷凍程序與改進(jìn)兩步法冷凍對(duì)睪丸組織的保存效果。其次，在-6℃、-8℃、-10℃下對(duì)睪丸組織進(jìn)行置核，并運(yùn)用低溫顯微鏡分析置核過(guò)程中冰晶形成和生長(zhǎng)情況，結(jié)合睪丸組織的凍后效果篩選最佳置核溫度。本研究對(duì)小鼠塊狀睪丸組織的慢速冷凍保存方法進(jìn)行了優(yōu)化，旨在提高其凍后質(zhì)量，為臨床上人睪丸組織的凍存提供參考。

1 材料與方法

1.1 保護(hù)劑溶液配制

按照體積百分比濃度配置以下溶液。睪丸組織基礎(chǔ)液（BS）：含20%FBS的DF12（DMEM/F-12）培養(yǎng)液。低溫保護(hù)劑1：5% DMSO+10% FBS+0.1 mol/L蔗 糖+DF12。低 溫 保 護(hù) 劑2：10%DMSO+10%FBS+0.1 mol/L蔗糖+DF12。低溫保護(hù)劑3：15%DMSO+10%FBS+0.1 mol/L蔗糖+DF12。

1.2 小鼠睪丸組織采集

選取5~8周齡的雄性小鼠，將其安樂(lè)死后快速置于手術(shù)臺(tái)上，用酒精棉輕輕擦拭腹部，用消毒后的無(wú)菌剪刀剪開(kāi)小鼠下腹部，找到睪丸后剪去附睪連接組織以取出睪丸，置于室溫下（約24~26℃）的睪丸組織基礎(chǔ)液中，用鑷子與剪刀夾住睪丸表面白膜輕輕撕開(kāi)，獲得睪丸內(nèi)部組織，備用。

1.3 保護(hù)劑加載對(duì)睪丸組織的毒性損傷

分別將半個(gè)小鼠睪丸組織浸泡于5%、10%、15%DMSO保護(hù)劑溶液，30 min后取出，放入培養(yǎng)液中10 min去除保護(hù)劑，并用培養(yǎng)液洗滌3次。對(duì)照組則在培養(yǎng)液中浸泡40 min。接著立即用DCFH-DA（2',7-dichlorofluorescein diacetate，Sigma-Aldrich，UK）染色30 min后在熒光顯微鏡下觀察。DCFH-DA自身沒(méi)有熒光，其穿過(guò)細(xì)胞膜后，在胞內(nèi)水解生成DCFH，DCFH被胞內(nèi)活性氧氧化為有熒光的二氯熒光素（dichlorofluorescein，DCF），置于熒光顯微鏡下觀察，使用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，515~565 nm發(fā)射波長(zhǎng)拍攝熒光照片。通過(guò)Image J軟件記錄DCF的熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)胞內(nèi)活性氧水平，結(jié)果用平均熒光值表示。

1.4 睪丸組織慢速冷凍程序

在3支1.8 ml凍存管中分別裝入1 ml低溫保護(hù)劑1、2、3，每組取半顆小鼠睪丸，放入3支凍存管中，將小鼠睪丸組織分別以常用慢速和改進(jìn)兩步法在程序降溫儀（CryoMed Freezer 7453，Thermo Fisher Scientific，USA）中進(jìn)行冷凍。常用慢速冷凍程序?yàn)椋篴.4℃停留30 min以加載低溫保護(hù)劑；b.2℃/min降至-9℃，停留8 min；c.0.3℃/min降至-40℃；d.25℃/min降至-150℃；e.快速取出投入液氮保存1 h。改進(jìn)兩步法冷凍程序?yàn)椋篴.4℃停留10 min以加載低溫保護(hù)劑；b.1℃/min降至-40℃，停留1 min；c.快速取出投入液氮。兩種冷凍方法的降溫程序如圖1所示。

復(fù)溫時(shí)從液氮中快速取出凍存管，置于37℃恒溫水浴鍋復(fù)溫，至冰晶融化。后將冷凍管中的組織塊取出，放入1 ml的培養(yǎng)液中10 min去除保護(hù)劑，并用培養(yǎng)液洗滌3次。將組織放入裝有1 ml培養(yǎng)液的孔板內(nèi)，放置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。

1.5 睪丸組織的置核冷凍程序

3個(gè)1.8 ml凍存管中均裝入1 ml低溫保護(hù)劑1，分別放入半個(gè)睪丸組織，于4℃冰箱內(nèi)放置10 min進(jìn)行保護(hù)劑加載。將程序降溫儀預(yù)先降至4℃，將完成保護(hù)劑加載的3只凍存管放入程序降溫儀，分別以1℃/min的降溫速率降至-6℃、-8℃、-10℃，達(dá)到設(shè)定溫度后，用液氮預(yù)冷的不銹鋼鑷子觸碰液面置核，繼續(xù)放入程序降溫儀保持10 min，然后將凍存管直接投入液氮。復(fù)溫步驟與慢速冷凍組相同。

1.6 冰晶的低溫顯微觀察

運(yùn)用低溫顯微鏡（BX51，Olympus，日本）觀察置核實(shí)驗(yàn)中的冰晶形態(tài)及生長(zhǎng)，每組實(shí)驗(yàn)取5μl低溫保護(hù)劑滴加于載物坩鍋內(nèi)，蓋1.6 cm直徑玻璃蓋玻片。將3組樣品分別以1℃/min的降溫速率冷卻至-6℃、-8℃、-10℃，用液氮預(yù)冷的不銹鋼鑷子觸碰坩鍋外圍置核，觀察形成冰晶生長(zhǎng)速率及形態(tài)。在置核溫度保持10 min后觀察冰晶形態(tài)。

1.7 睪丸組織的凍存效果評(píng)價(jià)

睪丸組織形態(tài)，以及生精小管內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整性主要通過(guò)HE染色評(píng)價(jià)。半定量評(píng)估切片組織的管腔完整性，正常結(jié)構(gòu)評(píng)分為1，管腔受到損傷結(jié)構(gòu)評(píng)分為0。當(dāng)觀察到以下結(jié)構(gòu)變化時(shí)結(jié)構(gòu)評(píng)分為0：a.精原細(xì)胞從基底膜分離；b.基底膜破裂；c.小管內(nèi)出現(xiàn)體積較大的空泡；d.小管內(nèi)空泡面積超過(guò)單根小管截面積的40%。最終管腔完整率計(jì)算方法見(jiàn)公式（1），每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，最終取平均值。

冷凍復(fù)溫后睪丸組織的凋亡水平采用Tunel試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行組織染色，染色后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況（顯色后陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核為棕黃色，存活細(xì)胞核顯藍(lán)色）。在生精小管內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法（細(xì)胞形狀、核致密性和相對(duì)于基底膜的位置等）來(lái)確定各種細(xì)胞類型［25］。分別計(jì)算各類細(xì)胞總數(shù)及各類細(xì)胞凋亡數(shù)量，各生精細(xì)胞Tunel陰性率通過(guò)公式（2）計(jì)算，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，最后取平均值。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS Statistics 19.0軟件中One way ANOVA、Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行分析，以P<0.05作為差異顯著評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 保護(hù)劑加載的毒性損傷

毒性損傷不僅與保護(hù)劑接觸時(shí)間相關(guān)，還受保護(hù)劑濃度影響。對(duì)睪丸組織進(jìn)行所用3種不同濃度保護(hù)劑的毒性試驗(yàn)，分別在3組保護(hù)劑濃度中浸泡30 min后測(cè)量睪丸組織的活性氧水平，熒光強(qiáng)度如圖2。相對(duì)于對(duì)照組，在保護(hù)劑溶液中浸泡后組織內(nèi)活性氧水平顯著上升，且隨著保護(hù)劑濃度增高組織內(nèi)活性氧水平增高，15%DMSO浸泡后組織內(nèi)活性氧水平（9.27）顯著高于5%（3.30）及10%（4.34）組。活性氧的產(chǎn)生和去除的調(diào)節(jié)是通過(guò)細(xì)胞中的抗氧化劑機(jī)制進(jìn)行的，一旦活性氧濃度超過(guò)細(xì)胞抗氧化劑保護(hù)機(jī)制的能力，就會(huì)導(dǎo)致無(wú)法修復(fù)的細(xì)胞損傷［26］。Unni等［12］以酶解后大鼠睪丸組織的平均細(xì)胞存活率為依據(jù)，對(duì)低溫保護(hù)劑的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在15 min的保護(hù)劑加載時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞的存活率隨保護(hù)劑濃度的升高而下降，其結(jié)果與本文毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。經(jīng)15% DMSO浸泡30 min后活性氧水平顯著升高，說(shuō)明高濃度保護(hù)劑浸泡會(huì)對(duì)睪丸組織帶來(lái)較大的不可逆毒性損傷，應(yīng)盡量減少睪丸組織在保護(hù)劑中的浸泡時(shí)間。

2.2 常用慢速冷凍與改進(jìn)兩步法冷凍的凍存結(jié)果

運(yùn)用5%、10%、15% DMSO保護(hù)劑對(duì)睪丸組織分別按照常用慢速冷凍與改進(jìn)兩步法冷凍程序保存，凍后對(duì)睪丸組織進(jìn)行HE染色觀察組織形態(tài)，另外進(jìn)行Tunel染色觀察管腔內(nèi)生殖細(xì)胞的凋亡情況（圖3），管腔完整率及生精細(xì)胞凋亡陰性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

Table 1 Lumen integrity rate and negative rate of cell apoptosis in testicular tissue after freezing

在常用慢速冷凍降溫保存與改進(jìn)兩步法冷凍降溫程序中，低濃度保護(hù)劑組的管腔完整率相對(duì)較高，結(jié)合圖2的活性氧熒光結(jié)果分析可知，高濃度保護(hù)劑將會(huì)對(duì)睪丸組織造成較大毒性損傷，可能是造成管腔完整率降低的原因。Tunel結(jié)果顯示，在常用慢速冷凍降溫保存與改進(jìn)兩步法冷凍降溫程序中，當(dāng)DMSO的濃度為5%時(shí)，組織內(nèi)細(xì)胞的凋亡率都較高，可能是低濃度保護(hù)劑阻冰作用的缺失使得細(xì)胞受到較大的冰晶損傷。當(dāng)DMSO的濃度為10%時(shí)，兩種方法凍后組織內(nèi)生殖細(xì)胞的凋亡陰性率均顯著提高，改進(jìn)兩步法帶來(lái)的對(duì)比更加突出。當(dāng)DMSO濃度為15%時(shí)，細(xì)胞凋亡陰性率都有所降低，但仍高于5%DMSO組。對(duì)比睪丸組織改進(jìn)兩步法冷凍及常用慢速冷凍法在5%、10%、15%DMSO保護(hù)劑溶液中的凍后效果，兩種方法的最優(yōu)保護(hù)劑濃度均為10% DMSO。這可能是因?yàn)?0%DMSO組比5%DMSO組更能顯著降低結(jié)晶量；而10%DMSO帶來(lái)的毒性損傷與5%DMSO無(wú)顯著性差異，并顯著低于15% DMSO組。Pukazhenthi等［27］在室溫下將新生羊羔睪丸組織塊浸泡于20%DMSO一段時(shí)間后放入程序降溫盒轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱過(guò)夜，次日投入液氮，結(jié)果顯示了75%左右的凍后總細(xì)胞活力。本研究改進(jìn)兩步法10%DMSO濃度時(shí)凍后細(xì)胞活力為精原細(xì)胞98.4%、精母細(xì)胞99.2%、精子細(xì)胞88.4%、支持細(xì)胞98.1%，證明了改進(jìn)兩步法的有效性。

改進(jìn)兩步法所得管腔完整率及細(xì)胞凋亡陰性率均高于常用慢速冷凍法，其原因可能包括以下幾個(gè)方面。a.改進(jìn)兩步法所用加載時(shí)間為10 min，縮短了浸泡時(shí)間。毒性損傷受保護(hù)劑濃度及接觸時(shí)間共同影響［28］，縮短了組織與保護(hù)劑接觸時(shí)間可減小組織在加載過(guò)程中所受毒性損傷。b.將第一階段降溫速率提高至1℃/min，減小了降溫所需時(shí)間與細(xì)胞所受滲透損傷。Liu等［29］指出細(xì)胞所受滲透損傷不僅與滲透壓差相關(guān)，還受細(xì)胞體積變化經(jīng)歷時(shí)間相關(guān)。Abrishami等［30］將豬睪丸組織在22℃下于10%DMSO中浸泡10 min后，通過(guò)程序降溫儀接連使用1℃/min、0.3℃/min、0.5℃/min、10℃/min的降溫速率經(jīng)近3 h降至-90℃，隨后投入液氮，結(jié)果顯示了解凍后平均75%的細(xì)胞活力。而在相同的10%DMSO濃度下，本文的改進(jìn)兩步法凍后細(xì)胞活力為精原細(xì)胞98.4%、精母細(xì)胞99.2%、精子細(xì)胞88.4%、支持細(xì)胞98.1%，這一研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了滲透損傷的減少是本文改進(jìn)兩步法提高存活率的關(guān)鍵。c.改進(jìn)兩步法在第二階段直接扔入液氮，提高此階段的降溫速率，促進(jìn)未凍溶液的非晶態(tài)固化從而減小冷凍中潛在的冰晶損傷。

2.3 置核對(duì)降低保護(hù)劑濃度的作用

采用低濃度保護(hù)劑（5%DMSO）對(duì)睪丸組織進(jìn)行置核溫度分別為-6℃、-8℃、-10℃的凍存，分別在不同溫度置核后平衡10 min，然后直接扔入液氮保存。凍后睪丸組織的HE及Tunel染色結(jié)果見(jiàn)圖4，管腔完整率及生精細(xì)胞凋亡陰性率見(jiàn)表2。

Table 2 Lumen integrity rate and negative rate of germ cell apoptosis in testicular tissue after ice seeding

由HE染色結(jié)果可知，采用5%DMSO作為保護(hù)劑，置核溫度為-10℃時(shí)，部分管腔結(jié)構(gòu)受到損傷，且組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷，因此凍后睪丸組織的管腔完整率（66.1%）低于-6℃及-8℃置核組。由Tunel染色可知，使用5%DMSO保護(hù)劑溶液進(jìn)行-10℃置核操作后，各生殖細(xì)胞的凍后凋亡陰性率與改進(jìn)兩步法的10%DMSO溶液未置核相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明置核操作可減小具有生物毒性的滲透保護(hù)劑的用量，并取得相似的保護(hù)效果。但本實(shí)驗(yàn)未完全替代滲透性保護(hù)劑，置核替代滲透性保護(hù)劑時(shí)仍需部分滲透性保護(hù)劑以減小細(xì)胞在胞外冰晶生長(zhǎng)過(guò)程中所受滲透應(yīng)激［22］，因此本研究中適當(dāng)?shù)蜐舛鹊?%DMSO可緩解組織在滲透平衡失水時(shí)受到的滲透損傷以提高凍存效果。

在3個(gè)置核溫度下，置核后生精細(xì)胞的凋亡水平均顯著低于未置核組，說(shuō)明置核操作也可顯著降低細(xì)胞凋亡，可能原因在于：經(jīng)置核操作后冰晶在組織外形成并生長(zhǎng)提高了組織外滲透壓，細(xì)胞內(nèi)溶液濃度增大，置核后直接投入液氮，使高濃度胞外未凍溶液及達(dá)到滲透平衡的胞內(nèi)溶液在快速冷卻中形成部分玻璃化，抑制冰晶的生成以減小組織所受冰晶損傷。Huang等［22］通過(guò)熵和自由能的變化發(fā)現(xiàn)在零度以下的高溫下（-10℃～0℃）置核可以釋放巨大的自由能，避免這些自由能在冷卻期間儲(chǔ)存在樣品中，并在復(fù)溫期間釋放后觸發(fā)胞外重結(jié)晶和胞內(nèi)冰。因此置核可能避免了睪丸組織復(fù)溫過(guò)程中的重結(jié)晶現(xiàn)象，提高凍后效果。

分別在-6℃、-8℃、-10℃溫度下用預(yù)冷鑷子觸碰坩鍋邊緣置核并維持10 min，運(yùn)用低溫顯微鏡觀察3種置核溫度所得冰晶形態(tài)（圖5）。由圖5可知，-6℃置核時(shí)，初始較鋒利的冰晶可能對(duì)組織造成較大機(jī)械損傷，-8℃置核初始冰晶未出現(xiàn)鋒利紋理，在-10℃置核，初始冰晶較前兩組更為致密，置核時(shí)組織在溶液形成冰晶的過(guò)程中受到的機(jī)械損傷最小。不同溫度置核后分別維持10 min觀察冰晶生長(zhǎng)情況，在-6℃下置核10 min后冰晶聚集成較大冰晶并形成溝壑。-8℃置核10 min后，部分冰晶聚集成塊，形成體積較大冰晶，帶來(lái)少量溝壑。而在-10℃置核10 min后未觀察到冰晶明顯變化，冰晶依舊較為均勻致密，未觀察到明顯溝壑。這可能是由于過(guò)冷度較大則形成的晶核小而多，形成密集的小冰晶，過(guò)冷度較小則形成的晶核大而少，形成大冰晶［31］。同時(shí)，過(guò)冷度增大，溶液黏度增加，使質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)困難，難以從溶液擴(kuò)散到晶核表面，不利于晶體的成核或長(zhǎng)大［32］。冰晶再生長(zhǎng)形成的溝壑可能對(duì)細(xì)胞造成擠壓應(yīng)力，對(duì)組織帶來(lái)機(jī)械損傷。綜合分析，-10℃置核可減小組織所受機(jī)械損傷。

本文的置核凍存方法區(qū)別于傳統(tǒng)的慢速冷凍和玻璃化方法，它消除了常規(guī)慢速冷凍的限制，可在指定溫度置核后直接放入液氮保存，通過(guò)提高降溫速率促進(jìn)未凍溶液的非晶態(tài)固化，既不需要傳統(tǒng)用于慢速冷凍的專用冷凍容器（如程序降溫盒）［33］，也避免了傳統(tǒng)慢速冷凍所需的復(fù)雜繁瑣冷凍程序［17，34］。3個(gè)溫度置核后凋亡陰性率均高于未置核組，驗(yàn)證了置核操作對(duì)冰晶重結(jié)晶的抑制效果。在5%DMSO保護(hù)劑溶液進(jìn)行-10℃置核操作后的凍存效果與改進(jìn)兩步法10%DMSO溶液未置核無(wú)顯著差異，說(shuō)明了置核對(duì)降低保護(hù)劑濃度的效果。Lauterboeck等［35］分別用5% DMSO和10% DMSO作為保護(hù)劑，分別在-4℃、-10℃、-14℃對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行手動(dòng)置核，以膜完整性和再培養(yǎng)率為依據(jù)篩選最佳保護(hù)劑濃度和置核溫度，也得到近似的結(jié)果。加載保護(hù)劑后將細(xì)胞從4℃以7.5℃/min冷卻到所需的成核溫度，置核后接著以7.5℃/min冷卻至-30℃，然后以3℃/min冷卻至-80℃，而后轉(zhuǎn)至-150℃電冰箱儲(chǔ)存。結(jié)果顯示，濃度為5%的DMSO在-10℃置核時(shí)是最有益于間充質(zhì)干細(xì)胞低溫保存的。其中，5%DMSO在-10℃置核時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞的膜完整性和再培養(yǎng)率都顯著高于10%DMSO在-10℃置核組。

值得注意的是，組織凍存不同于細(xì)胞凍存，一般情況下組織中不同種類的細(xì)胞對(duì)應(yīng)著不同的最優(yōu)凍存程序。不過(guò)本研究?jī)山M實(shí)驗(yàn)選取的最優(yōu)組中，不同種細(xì)胞（精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、支持細(xì)胞）的存活率均相對(duì)其他組較好，不同種細(xì)胞間差異不顯著，說(shuō)明4種細(xì)胞對(duì)低溫凍存的敏感性相近，因此對(duì)應(yīng)的最優(yōu)保存程序也近似。此外，睪丸組織自身的結(jié)構(gòu)也對(duì)不同種類的細(xì)胞得到近似的保存效果有幫助。睪丸組織主要由結(jié)締組織與許多生精小管組成，而每根生精小管由生精上皮與管腔構(gòu)成，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、支持細(xì)胞等有序分布在數(shù)十微米的生精上皮管壁上［36］，降溫與復(fù)溫時(shí)4種細(xì)胞溫度變化幾乎同步，不會(huì)出現(xiàn)熱應(yīng)力釋放導(dǎo)致的損傷。

3 結(jié) 論

冷凍保存睪丸組織用于后期移植是除精子凍存以外保存男性生育力的另一有效的選擇。本文通過(guò)縮短保護(hù)劑加載時(shí)間、提高第一階段的冷卻速率、第二階段直接投入液氮等方法對(duì)睪丸組織的常用慢速冷凍方法進(jìn)行了優(yōu)化，并在不同溫度對(duì)睪丸組織進(jìn)行置核，得到如下結(jié)論：

a.當(dāng)使用10% DMSO對(duì)睪丸組織進(jìn)行改進(jìn)兩步法降溫凍存時(shí)，凍后組織內(nèi)生殖細(xì)胞的凋亡陰性率均較高，其中精原細(xì)胞100%、精母細(xì)胞100%、精子細(xì)胞88.4%、支持細(xì)胞100%，顯著高于常用慢速冷凍組，且與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異。

b.相較于未置核組，低濃度保護(hù)劑5%DMSO組在-10℃置核時(shí)的凍存結(jié)果與較高濃度保護(hù)劑10% DMSO組無(wú)顯著性差異，生殖細(xì)胞的凋亡陰性率為精原細(xì)胞82.9%、精子細(xì)胞92.1%、精母細(xì)胞93.2%及支持細(xì)胞88.9%，證明了置核能夠降低所需保護(hù)劑的濃度。

本研究通過(guò)改進(jìn)兩步法和置核提高了小鼠睪丸組織凍后的質(zhì)量，為臨床上人睪丸組織凍存時(shí)保護(hù)劑濃度和凍存工藝的確定提供參考。