李莉，楊立新，周寧

作者單位：1安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，安徽 淮南 232000；2蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院，安徽 蚌埠 233000

夏科雷登結(jié)晶（CLCs）是由半乳糖凝集素-10（gal-10）形成的蛋白質(zhì)晶體，主要由活化的嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞以及一些T細(xì)胞產(chǎn)生，也是人類嗜酸粒細(xì)胞中含量最高的蛋白質(zhì)之一。其廣泛存在于哮喘、嗜酸粒細(xì)胞增多綜合征、變應(yīng)性鼻炎、慢性鼻竇炎（CRS）等嗜酸性疾病中，是導(dǎo)致疾病的直接原因之一，因而成為嗜酸粒細(xì)胞類疾病治療的靶點(diǎn)。這一發(fā)現(xiàn)為慢性鼻竇炎的治療提供了新的思路。本文就夏科雷登結(jié)晶的研究進(jìn)展及對慢性鼻竇炎診斷、治療的意義作一綜述。

1 夏科雷登結(jié)晶的發(fā)現(xiàn)

1853年，Jean-Martin Charcot首次在白血病病人的脾臟和心臟血液中發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)長的雙錐體六角形晶體，1872年，Ernst Viktor von Leyden也描述了哮喘病人痰液中的類似晶體，因而被命名為夏科雷登結(jié)晶（CLCs）。當(dāng)時(shí)對于CLCs的性質(zhì)和意義并不明確。CLCs曾被錯(cuò)誤地認(rèn)為是溶血磷脂酶，隨后有學(xué)者通過評估其在外周血嗜酸粒細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞系（AML14.3D10）中酶的活性發(fā)現(xiàn)CLCs的多肽鏈與任何已知的溶血磷脂酶或其他脂解酶均無相似之處，CLCs不是嗜酸粒細(xì)胞性溶血磷脂酶，而是以新型的結(jié)構(gòu)方式結(jié)合溶血磷脂酶抑制劑［1］。陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，CLCs蛋白基因的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)類似于半乳糖凝集素（gal），其碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域（CRD）與gal同源且有高度相似的重疊，因此CLCs晶體蛋白被重新命名為Gal-10［2］。通過人類基因組計(jì)劃，CLCs蛋白基因被精確地定位到人的19q13.2號染色體上。目前的研究發(fā)現(xiàn)，Gal-10可存在于人類嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞亞群中［3-6］，較多的報(bào)道和研究集中在人類嗜酸粒細(xì)胞中。

2 CLCs的形成及病理機(jī)制

體內(nèi)CLCs的存在與嗜酸粒細(xì)胞溶解有關(guān)［7］。細(xì)胞溶解代表ETosis的發(fā)生［8-9］，這是一種活躍的非凋亡細(xì)胞死亡過程，可以釋放出網(wǎng)狀染色質(zhì)結(jié)構(gòu)［8，10］。ETosis代表一種最初在人類中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的自殺性細(xì)胞死亡的過程（即NETosis）。在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）-氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生的活性氧（ROS）作用下，中性粒細(xì)胞細(xì)胞核解聚，細(xì)胞內(nèi)膜崩解，核與細(xì)胞質(zhì)成分混合，最終，質(zhì)膜破裂釋放中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)（NETs）以捕殺細(xì)菌、真菌和寄生蟲等，這種特殊的細(xì)胞死亡途徑被稱為NETosis。NETs由染色質(zhì)（組蛋白和DNA）和顆粒蛋白組成［11］。嗜酸粒細(xì)胞ETosis（EETosis）與NETosis類似。嗜酸粒細(xì)胞是源自骨髓的終末分化粒細(xì)胞。從血液進(jìn)入組織后，未活化的嗜酸粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，活化的嗜酸粒細(xì)胞發(fā)生NADPH-氧化酶依賴性ETosis，釋放完整的游離顆粒、gal-10、CLCs、胞外囊泡（EVs）、胞外誘捕網(wǎng)（ETs）和其他細(xì)胞內(nèi)報(bào)警蛋白，從而加劇組織的損傷。后續(xù)的研究也證實(shí)了EETosis導(dǎo)致CLCs形成的假說［12］。Gal-10不存在于分泌顆粒中。在活的嗜酸粒細(xì)胞中，Gal-10偏心地位于外周細(xì)胞質(zhì)中［13-14］，在EETosis的過程中，Gal-10在細(xì)胞質(zhì)中均勻地重新分布，與核的形狀變化一致，隨后形成細(xì)胞內(nèi)CLCs［12］，延時(shí)成像顯示，一旦細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶開始，相對較?。ǎ?0 μm）的CLCs會(huì)在1～2 min內(nèi)累積，最后，質(zhì)膜破裂并出現(xiàn)細(xì)胞外CLCs。由此可以得出，活化的嗜酸粒細(xì)胞發(fā)生ETosis，Gal-10在細(xì)胞質(zhì)中定位變化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)CLCs的形成，質(zhì)膜裂解后釋放的游離Gal-10和胞內(nèi)形成的CLCs促進(jìn)了細(xì)胞外CLCs的形成，CLCs的形成取決于Gal-10的濃度。Gal-10可存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜碎片、顆粒和細(xì)胞周質(zhì)中。人類外周嗜酸粒細(xì)胞的免疫熒光顯微鏡檢查顯示，有大量的Gal-10集中在細(xì)胞核中［15］，最近對Gal-10的研究表明，帶有增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的凝集素主要分布在HeLa細(xì)胞核中，表明Gal-10可以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中［16］。這也暗示Gal-10可能通過與未知配體的相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯。關(guān)于CLCs是否僅由EETosis產(chǎn)生尚沒有定論。

目前關(guān)于Gal-10的體內(nèi)分子作用機(jī)制尚不十分明確。已知Gal-10對T細(xì)胞有抑制作用，Gal-10可以與T細(xì)胞膜上的未知聚糖結(jié)合，從而下調(diào)T細(xì)胞功能。最新的研究表明［17］CLCs與其他晶體（例如尿酸和膽固醇晶體）類似，可以激活Nod樣受體蛋白-3（NLRP3）炎性小體，并在體外被人類巨噬細(xì)胞攝取后引起白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）驅(qū)動(dòng)的炎癥。Persson等［12］通過將體外合成熒光CLCs注入到小鼠模型體中的方法，得出CLCs可以激活先天性（僅在結(jié)晶狀態(tài)下）和獲得性免疫反應(yīng)，且其誘導(dǎo)的2型免疫是T細(xì)胞依賴性的。遺憾的是目前為止尚沒有內(nèi)源性形成CLCs的哮喘動(dòng)物模型。關(guān)于Gal-10是如何導(dǎo)致嗜酸性炎癥的以及其細(xì)胞配體、轉(zhuǎn)移運(yùn)輸途徑、在信號傳導(dǎo)中的作用等仍然是懸而未知的事情。

3 CLCs與慢性鼻竇炎的關(guān)系

來自人體或異物的刺激信號可能會(huì)觸發(fā)大量嗜酸粒細(xì)胞釋放Gal-10，從病原體和寄生蟲釋放的有毒物質(zhì)也可能誘發(fā)嗜酸粒細(xì)胞凋亡或壞死從而產(chǎn)生CLCs。當(dāng)大量的Gal-10相互作用時(shí)，他們可以在很短的時(shí)間內(nèi)形成CLCs。因此，CLCs的形成與嗜酸粒細(xì)胞性疾病有關(guān)，表明CLCs可用作這些疾病的潛在標(biāo)志物［18］。隨著研究的進(jìn)展，學(xué)者們證明了在各種病理?xiàng)l件下，于組織、體液等嗜酸粒細(xì)胞浸潤部位均觀察到了CLCs/Gal-10（表1）。慢性鼻竇炎（CRS）病人的黏膜、分泌物及氣道中存在大量的嗜酸粒細(xì)胞。嗜酸粒細(xì)胞的分泌顆粒中含有許多豐富的蛋白質(zhì)，例如嗜酸粒細(xì)胞陽離子蛋白（ECP）、嗜酸性細(xì)胞過氧化物酶（EPX）、主要的髓鞘堿性蛋白（MBP-1、MBP-2）和嗜酸粒細(xì)胞來源的神經(jīng)毒素（EDN）。這些高度陽離子的蛋白質(zhì)不僅對病原體有直接毒性，對組織也有毒性。它們通過破壞脂質(zhì)雙膜的完整性，發(fā)揮神經(jīng)毒性、核糖核酸酶活性，并參與活性氧化劑和自由基的生成［19］，因而被視為嗜酸粒細(xì)胞類炎癥和疾病如嗜酸粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎伴鼻息肉（ECRSwNP）的生物標(biāo)志物，但不是藥物治療的靶點(diǎn)，而嗜酸粒細(xì)胞來源的CLCs可能直接導(dǎo)致疾病，成為嗜酸粒細(xì)胞類疾病診斷和治療的靶點(diǎn)［12］。

表1 與CLCs/Gal-10有關(guān)的疾病

Gal-10的mRNA水平已被證明是體外人全血中CRTH2活化的標(biāo)志物［33］。張羅等通過logistic回歸分析與受試者工作特征（ROC）曲線得出基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）的CLCs mRNA水平可以作為鑒定ECRSwNP的可靠和替代方法（AUC=0.95）［34］。隨后其所在的團(tuán)隊(duì)［35-36］通過對CRSwNP病人術(shù)后隨訪，發(fā)現(xiàn)與未復(fù)發(fā)的病人相比，復(fù)發(fā)病人的鼻分泌物中CLCs濃度及CLCs mRNA水平均顯著增加，得出鼻分泌物中CLCs濃度及其mRNA水平可作為預(yù)測復(fù)發(fā)的非侵入性指標(biāo)。目前診斷ECRSwNP的金標(biāo)準(zhǔn)是組織病理學(xué)檢查，然而此為有創(chuàng)操作，不利于日常診療，鼻腔分泌物中CLCs作為一種無創(chuàng)檢查，簡便快捷，值得大力推廣使用。

通過調(diào)查CRSwNP病人鼻分泌物中CLCs濃度對糖皮質(zhì)激素反應(yīng)的預(yù)測意義［37］，張羅的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)鼻分泌物中的CLCs濃度與糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)相關(guān)，并且糖皮質(zhì)激素治療可顯著降低CLCs濃度，由此得出結(jié)論：鼻分泌物中CLCs的濃度可以預(yù)測CRSwNP病人對糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)。鼻息肉組織中性粒細(xì)胞增多、血清淀粉樣蛋白A（與高密度脂蛋白相關(guān)的載脂蛋白）水平升高、黏蛋白4的上調(diào)、黏蛋白1的下調(diào)、白細(xì)胞介素-25（IL-25）均與糖皮質(zhì)激素抵抗有關(guān)，可以預(yù)測CRSwNP病人對糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)，與以上指標(biāo)相比，CLCs的簡便易得是個(gè)不可忽略的優(yōu)點(diǎn)，在臨床實(shí)踐中常規(guī)使用這種生物標(biāo)志物，可能會(huì)在將來為CRSwNP病人提供更好的糖皮質(zhì)激素治療策略。Persson等［12］通過使用無佐劑的Gal-10晶體免疫非洲駝得到3種治療性單克隆抗體：1D11、4E8及6F5抗體，并通過實(shí)驗(yàn)得出這些抗體可以溶解源自CRSwNP病人黏液樣本中的CLCs以及哮喘小鼠模型氣道內(nèi)的外源性重組Gal-10晶體，抑制了CLCs誘導(dǎo)的氣道炎癥、粘液的產(chǎn)生、杯狀細(xì)胞化生等，為CLCs導(dǎo)致的嗜酸性疾病的治療提供了新的方向。但是目前，研究尚停留在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，是否可以通過清除CLCs來緩解CRSwNP病人的病情，仍有待考證。

有研究表明嗜酸粒細(xì)胞的ETosis與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)［24］。那么是否可以通過某種途徑抑制EETosis的發(fā)生或者阻斷其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而減少CLCs的生成來減輕病情？已知在嗜酸粒細(xì)胞中，包括鈣離子載體，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸鹽，伴隨有白細(xì)胞介素-5（IL-5）或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的血小板活化因子（PAF），免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白A（IgA），自身抗體和真菌在內(nèi)的各種刺激均可誘導(dǎo)快速（30～180 min內(nèi)）EETosis［8，38-42］。添加包括血漿和紅細(xì)胞分解產(chǎn)物在內(nèi)的物質(zhì)可以防止CLCs的形成［8］。這些理論因素是否可以影響人體內(nèi)源性CLCs的含量以及如何轉(zhuǎn)換為實(shí)踐因素去指導(dǎo)有關(guān)疾病的治療，可能是日后研究的方向。

4 總結(jié)

綜上所述，CLCs廣泛存在于哮喘、CRS等嗜酸性疾病中，可作為嗜酸性疾病的生物標(biāo)志物。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)CLCs可以作為CRSwNP預(yù)測診斷、復(fù)發(fā)及治療的標(biāo)志物。CLCs取材簡便，若能應(yīng)用于臨床將極大便利臨床診療工作，前景可觀。目前的研究進(jìn)展顯示，CLCs的產(chǎn)生與EETosis有關(guān)，然而目前關(guān)于Gal-10的體內(nèi)分子作用機(jī)理并不完全清楚，仍需要廣大學(xué)者繼續(xù)努力。