李莉，楊立新，周寧

作者單位：1安徽理工大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，安徽 淮南 232000；2蚌埠醫(yī)學院研究生院，安徽 蚌埠 233000

夏科雷登結(jié)晶（CLCs）是由半乳糖凝集素-10（gal-10）形成的蛋白質(zhì)晶體，主要由活化的嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞以及一些T細胞產(chǎn)生，也是人類嗜酸粒細胞中含量最高的蛋白質(zhì)之一。其廣泛存在于哮喘、嗜酸粒細胞增多綜合征、變應(yīng)性鼻炎、慢性鼻竇炎（CRS）等嗜酸性疾病中，是導(dǎo)致疾病的直接原因之一，因而成為嗜酸粒細胞類疾病治療的靶點。這一發(fā)現(xiàn)為慢性鼻竇炎的治療提供了新的思路。本文就夏科雷登結(jié)晶的研究進展及對慢性鼻竇炎診斷、治療的意義作一綜述。

1 夏科雷登結(jié)晶的發(fā)現(xiàn)

1853年，Jean-Martin Charcot首次在白血病病人的脾臟和心臟血液中發(fā)現(xiàn)了一種細長的雙錐體六角形晶體，1872年，Ernst Viktor von Leyden也描述了哮喘病人痰液中的類似晶體，因而被命名為夏科雷登結(jié)晶（CLCs）。當時對于CLCs的性質(zhì)和意義并不明確。CLCs曾被錯誤地認為是溶血磷脂酶，隨后有學者通過評估其在外周血嗜酸粒細胞和嗜酸粒細胞系（AML14.3D10）中酶的活性發(fā)現(xiàn)CLCs的多肽鏈與任何已知的溶血磷脂酶或其他脂解酶均無相似之處，CLCs不是嗜酸粒細胞性溶血磷脂酶，而是以新型的結(jié)構(gòu)方式結(jié)合溶血磷脂酶抑制劑［1］。陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，CLCs蛋白基因的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)類似于半乳糖凝集素（gal），其碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域（CRD）與gal同源且有高度相似的重疊，因此CLCs晶體蛋白被重新命名為Gal-10［2］。通過人類基因組計劃，CLCs蛋白基因被精確地定位到人的19q13.2號染色體上。目前的研究發(fā)現(xiàn)，Gal-10可存在于人類嗜酸粒細胞、嗜堿性粒細胞、巨噬細胞和T細胞亞群中［3-6］，較多的報道和研究集中在人類嗜酸粒細胞中。

2 CLCs的形成及病理機制

體內(nèi)CLCs的存在與嗜酸粒細胞溶解有關(guān)［7］。細胞溶解代表ETosis的發(fā)生［8-9］，這是一種活躍的非凋亡細胞死亡過程，可以釋放出網(wǎng)狀染色質(zhì)結(jié)構(gòu)［8，10］。ETosis代表一種最初在人類中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)的自殺性細胞死亡的過程（即NETosis）。在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）-氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生的活性氧（ROS）作用下，中性粒細胞細胞核解聚，細胞內(nèi)膜崩解，核與細胞質(zhì)成分混合，最終，質(zhì)膜破裂釋放中性粒細胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)（NETs）以捕殺細菌、真菌和寄生蟲等，這種特殊的細胞死亡途徑被稱為NETosis。NETs由染色質(zhì)（組蛋白和DNA）和顆粒蛋白組成［11］。嗜酸粒細胞ETosis（EETosis）與NETosis類似。嗜酸粒細胞是源自骨髓的終末分化粒細胞。從血液進入組織后，未活化的嗜酸粒細胞發(fā)生凋亡，活化的嗜酸粒細胞發(fā)生NADPH-氧化酶依賴性ETosis，釋放完整的游離顆粒、gal-10、CLCs、胞外囊泡（EVs）、胞外誘捕網(wǎng)（ETs）和其他細胞內(nèi)報警蛋白，從而加劇組織的損傷。后續(xù)的研究也證實了EETosis導(dǎo)致CLCs形成的假說［12］。Gal-10不存在于分泌顆粒中。在活的嗜酸粒細胞中，Gal-10偏心地位于外周細胞質(zhì)中［13-14］，在EETosis的過程中，Gal-10在細胞質(zhì)中均勻地重新分布，與核的形狀變化一致，隨后形成細胞內(nèi)CLCs［12］，延時成像顯示，一旦細胞內(nèi)結(jié)晶開始，相對較小（＜10 μm）的CLCs會在1～2 min內(nèi)累積，最后，質(zhì)膜破裂并出現(xiàn)細胞外CLCs。由此可以得出，活化的嗜酸粒細胞發(fā)生ETosis，Gal-10在細胞質(zhì)中定位變化導(dǎo)致細胞內(nèi)CLCs的形成，質(zhì)膜裂解后釋放的游離Gal-10和胞內(nèi)形成的CLCs促進了細胞外CLCs的形成，CLCs的形成取決于Gal-10的濃度。Gal-10可存在于細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜碎片、顆粒和細胞周質(zhì)中。人類外周嗜酸粒細胞的免疫熒光顯微鏡檢查顯示，有大量的Gal-10集中在細胞核中［15］，最近對Gal-10的研究表明，帶有增強綠色熒光蛋白（EGFP）標記的凝集素主要分布在HeLa細胞核中，表明Gal-10可以主動轉(zhuǎn)運到細胞核中［16］。這也暗示Gal-10可能通過與未知配體的相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯。關(guān)于CLCs是否僅由EETosis產(chǎn)生尚沒有定論。

目前關(guān)于Gal-10的體內(nèi)分子作用機制尚不十分明確。已知Gal-10對T細胞有抑制作用，Gal-10可以與T細胞膜上的未知聚糖結(jié)合，從而下調(diào)T細胞功能。最新的研究表明［17］CLCs與其他晶體（例如尿酸和膽固醇晶體）類似，可以激活Nod樣受體蛋白-3（NLRP3）炎性小體，并在體外被人類巨噬細胞攝取后引起白細胞介素-1β（IL-1β）驅(qū)動的炎癥。Persson等［12］通過將體外合成熒光CLCs注入到小鼠模型體中的方法，得出CLCs可以激活先天性（僅在結(jié)晶狀態(tài)下）和獲得性免疫反應(yīng)，且其誘導(dǎo)的2型免疫是T細胞依賴性的。遺憾的是目前為止尚沒有內(nèi)源性形成CLCs的哮喘動物模型。關(guān)于Gal-10是如何導(dǎo)致嗜酸性炎癥的以及其細胞配體、轉(zhuǎn)移運輸途徑、在信號傳導(dǎo)中的作用等仍然是懸而未知的事情。

3 CLCs與慢性鼻竇炎的關(guān)系

來自人體或異物的刺激信號可能會觸發(fā)大量嗜酸粒細胞釋放Gal-10，從病原體和寄生蟲釋放的有毒物質(zhì)也可能誘發(fā)嗜酸粒細胞凋亡或壞死從而產(chǎn)生CLCs。當大量的Gal-10相互作用時，他們可以在很短的時間內(nèi)形成CLCs。因此，CLCs的形成與嗜酸粒細胞性疾病有關(guān)，表明CLCs可用作這些疾病的潛在標志物［18］。隨著研究的進展，學者們證明了在各種病理條件下，于組織、體液等嗜酸粒細胞浸潤部位均觀察到了CLCs/Gal-10（表1）。慢性鼻竇炎（CRS）病人的黏膜、分泌物及氣道中存在大量的嗜酸粒細胞。嗜酸粒細胞的分泌顆粒中含有許多豐富的蛋白質(zhì)，例如嗜酸粒細胞陽離子蛋白（ECP）、嗜酸性細胞過氧化物酶（EPX）、主要的髓鞘堿性蛋白（MBP-1、MBP-2）和嗜酸粒細胞來源的神經(jīng)毒素（EDN）。這些高度陽離子的蛋白質(zhì)不僅對病原體有直接毒性，對組織也有毒性。它們通過破壞脂質(zhì)雙膜的完整性，發(fā)揮神經(jīng)毒性、核糖核酸酶活性，并參與活性氧化劑和自由基的生成［19］，因而被視為嗜酸粒細胞類炎癥和疾病如嗜酸粒細胞性慢性鼻竇炎伴鼻息肉（ECRSwNP）的生物標志物，但不是藥物治療的靶點，而嗜酸粒細胞來源的CLCs可能直接導(dǎo)致疾病，成為嗜酸粒細胞類疾病診斷和治療的靶點［12］。

表1 與CLCs/Gal-10有關(guān)的疾病

Gal-10的mRNA水平已被證明是體外人全血中CRTH2活化的標志物［33］。張羅等通過logistic回歸分析與受試者工作特征（ROC）曲線得出基于實時熒光定量PCR（qRT-PCR）的CLCs mRNA水平可以作為鑒定ECRSwNP的可靠和替代方法（AUC=0.95）［34］。隨后其所在的團隊［35-36］通過對CRSwNP病人術(shù)后隨訪，發(fā)現(xiàn)與未復(fù)發(fā)的病人相比，復(fù)發(fā)病人的鼻分泌物中CLCs濃度及CLCs mRNA水平均顯著增加，得出鼻分泌物中CLCs濃度及其mRNA水平可作為預(yù)測復(fù)發(fā)的非侵入性指標。目前診斷ECRSwNP的金標準是組織病理學檢查，然而此為有創(chuàng)操作，不利于日常診療，鼻腔分泌物中CLCs作為一種無創(chuàng)檢查，簡便快捷，值得大力推廣使用。

通過調(diào)查CRSwNP病人鼻分泌物中CLCs濃度對糖皮質(zhì)激素反應(yīng)的預(yù)測意義［37］，張羅的團隊發(fā)現(xiàn)鼻分泌物中的CLCs濃度與糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)相關(guān)，并且糖皮質(zhì)激素治療可顯著降低CLCs濃度，由此得出結(jié)論：鼻分泌物中CLCs的濃度可以預(yù)測CRSwNP病人對糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)。鼻息肉組織中性粒細胞增多、血清淀粉樣蛋白A（與高密度脂蛋白相關(guān)的載脂蛋白）水平升高、黏蛋白4的上調(diào)、黏蛋白1的下調(diào)、白細胞介素-25（IL-25）均與糖皮質(zhì)激素抵抗有關(guān)，可以預(yù)測CRSwNP病人對糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)，與以上指標相比，CLCs的簡便易得是個不可忽略的優(yōu)點，在臨床實踐中常規(guī)使用這種生物標志物，可能會在將來為CRSwNP病人提供更好的糖皮質(zhì)激素治療策略。Persson等［12］通過使用無佐劑的Gal-10晶體免疫非洲駝得到3種治療性單克隆抗體：1D11、4E8及6F5抗體，并通過實驗得出這些抗體可以溶解源自CRSwNP病人黏液樣本中的CLCs以及哮喘小鼠模型氣道內(nèi)的外源性重組Gal-10晶體，抑制了CLCs誘導(dǎo)的氣道炎癥、粘液的產(chǎn)生、杯狀細胞化生等，為CLCs導(dǎo)致的嗜酸性疾病的治療提供了新的方向。但是目前，研究尚停留在基礎(chǔ)實驗階段，是否可以通過清除CLCs來緩解CRSwNP病人的病情，仍有待考證。

有研究表明嗜酸粒細胞的ETosis與疾病的嚴重程度有關(guān)［24］。那么是否可以通過某種途徑抑制EETosis的發(fā)生或者阻斷其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而減少CLCs的生成來減輕病情？已知在嗜酸粒細胞中，包括鈣離子載體，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸鹽，伴隨有白細胞介素-5（IL-5）或者粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的血小板活化因子（PAF），免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白A（IgA），自身抗體和真菌在內(nèi)的各種刺激均可誘導(dǎo)快速（30～180 min內(nèi)）EETosis［8，38-42］。添加包括血漿和紅細胞分解產(chǎn)物在內(nèi)的物質(zhì)可以防止CLCs的形成［8］。這些理論因素是否可以影響人體內(nèi)源性CLCs的含量以及如何轉(zhuǎn)換為實踐因素去指導(dǎo)有關(guān)疾病的治療，可能是日后研究的方向。

4 總結(jié)

綜上所述，CLCs廣泛存在于哮喘、CRS等嗜酸性疾病中，可作為嗜酸性疾病的生物標志物。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)CLCs可以作為CRSwNP預(yù)測診斷、復(fù)發(fā)及治療的標志物。CLCs取材簡便，若能應(yīng)用于臨床將極大便利臨床診療工作，前景可觀。目前的研究進展顯示，CLCs的產(chǎn)生與EETosis有關(guān)，然而目前關(guān)于Gal-10的體內(nèi)分子作用機理并不完全清楚，仍需要廣大學者繼續(xù)努力。