李莉,楊立新,周寧
作者單位:1安徽理工大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科,安徽 淮南 232000;2蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院,安徽 蚌埠 233000
夏科雷登結(jié)晶(CLCs)是由半乳糖凝集素-10(gal-10)形成的蛋白質(zhì)晶體,主要由活化的嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞以及一些T細(xì)胞產(chǎn)生,也是人類嗜酸粒細(xì)胞中含量最高的蛋白質(zhì)之一。其廣泛存在于哮喘、嗜酸粒細(xì)胞增多綜合征、變應(yīng)性鼻炎、慢性鼻竇炎(CRS)等嗜酸性疾病中,是導(dǎo)致疾病的直接原因之一,因而成為嗜酸粒細(xì)胞類疾病治療的靶點。這一發(fā)現(xiàn)為慢性鼻竇炎的治療提供了新的思路。本文就夏科雷登結(jié)晶的研究進(jìn)展及對慢性鼻竇炎診斷、治療的意義作一綜述。
1853年,Jean-Martin Charcot首次在白血病病人的脾臟和心臟血液中發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)長的雙錐體六角形晶體,1872年,Ernst Viktor von Leyden也描述了哮喘病人痰液中的類似晶體,因而被命名為夏科雷登結(jié)晶(CLCs)。當(dāng)時對于CLCs的性質(zhì)和意義并不明確。CLCs曾被錯誤地認(rèn)為是溶血磷脂酶,隨后有學(xué)者通過評估其在外周血嗜酸粒細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞系(AML14.3D10)中酶的活性發(fā)現(xiàn)CLCs的多肽鏈與任何已知的溶血磷脂酶或其他脂解酶均無相似之處,CLCs不是嗜酸粒細(xì)胞性溶血磷脂酶,而是以新型的結(jié)構(gòu)方式結(jié)合溶血磷脂酶抑制劑[1]。陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn),CLCs蛋白基因的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)類似于半乳糖凝集素(gal),其碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(CRD)與gal同源且有高度相似的重疊,因此CLCs晶體蛋白被重新命名為Gal-10[2]。通過人類基因組計劃,CLCs蛋白基因被精確地定位到人的19q13.2號染色體上。目前的研究發(fā)現(xiàn),Gal-10可存在于人類嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞亞群中[3-6],較多的報道和研究集中在人類嗜酸粒細(xì)胞中。
體內(nèi)CLCs的存在與嗜酸粒細(xì)胞溶解有關(guān)[7]。細(xì)胞溶解代表ETosis的發(fā)生[8-9],這是一種活躍的非凋亡細(xì)胞死亡過程,可以釋放出網(wǎng)狀染色質(zhì)結(jié)構(gòu)[8,10]。ETosis代表一種最初在人類中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的自殺性細(xì)胞死亡的過程(即NETosis)。在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)-氧化酶復(fù)合物產(chǎn)生的活性氧(ROS)作用下,中性粒細(xì)胞細(xì)胞核解聚,細(xì)胞內(nèi)膜崩解,核與細(xì)胞質(zhì)成分混合,最終,質(zhì)膜破裂釋放中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)(NETs)以捕殺細(xì)菌、真菌和寄生蟲等,這種特殊的細(xì)胞死亡途徑被稱為NETosis。NETs由染色質(zhì)(組蛋白和DNA)和顆粒蛋白組成[11]。嗜酸粒細(xì)胞ETosis(EETosis)與NETosis類似。嗜酸粒細(xì)胞是源自骨髓的終末分化粒細(xì)胞。從血液進(jìn)入組織后,未活化的嗜酸粒細(xì)胞發(fā)生凋亡,活化的嗜酸粒細(xì)胞發(fā)生NADPH-氧化酶依賴性ETosis,釋放完整的游離顆粒、gal-10、CLCs、胞外囊泡(EVs)、胞外誘捕網(wǎng)(ETs)和其他細(xì)胞內(nèi)報警蛋白,從而加劇組織的損傷。后續(xù)的研究也證實了EETosis導(dǎo)致CLCs形成的假說[12]。Gal-10不存在于分泌顆粒中。在活的嗜酸粒細(xì)胞中,Gal-10偏心地位于外周細(xì)胞質(zhì)中[13-14],在EETosis的過程中,Gal-10在細(xì)胞質(zhì)中均勻地重新分布,與核的形狀變化一致,隨后形成細(xì)胞內(nèi)CLCs[12],延時成像顯示,一旦細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶開始,相對較?。ǎ?0 μm)的CLCs會在1~2 min內(nèi)累積,最后,質(zhì)膜破裂并出現(xiàn)細(xì)胞外CLCs。由此可以得出,活化的嗜酸粒細(xì)胞發(fā)生ETosis,Gal-10在細(xì)胞質(zhì)中定位變化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)CLCs的形成,質(zhì)膜裂解后釋放的游離Gal-10和胞內(nèi)形成的CLCs促進(jìn)了細(xì)胞外CLCs的形成,CLCs的形成取決于Gal-10的濃度。Gal-10可存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜碎片、顆粒和細(xì)胞周質(zhì)中。人類外周嗜酸粒細(xì)胞的免疫熒光顯微鏡檢查顯示,有大量的Gal-10集中在細(xì)胞核中[15],最近對Gal-10的研究表明,帶有增強綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的凝集素主要分布在HeLa細(xì)胞核中,表明Gal-10可以主動轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中[16]。這也暗示Gal-10可能通過與未知配體的相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯。關(guān)于CLCs是否僅由EETosis產(chǎn)生尚沒有定論。
目前關(guān)于Gal-10的體內(nèi)分子作用機制尚不十分明確。已知Gal-10對T細(xì)胞有抑制作用,Gal-10可以與T細(xì)胞膜上的未知聚糖結(jié)合,從而下調(diào)T細(xì)胞功能。最新的研究表明[17]CLCs與其他晶體(例如尿酸和膽固醇晶體)類似,可以激活Nod樣受體蛋白-3(NLRP3)炎性小體,并在體外被人類巨噬細(xì)胞攝取后引起白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)驅(qū)動的炎癥。Persson等[12]通過將體外合成熒光CLCs注入到小鼠模型體中的方法,得出CLCs可以激活先天性(僅在結(jié)晶狀態(tài)下)和獲得性免疫反應(yīng),且其誘導(dǎo)的2型免疫是T細(xì)胞依賴性的。遺憾的是目前為止尚沒有內(nèi)源性形成CLCs的哮喘動物模型。關(guān)于Gal-10是如何導(dǎo)致嗜酸性炎癥的以及其細(xì)胞配體、轉(zhuǎn)移運輸途徑、在信號傳導(dǎo)中的作用等仍然是懸而未知的事情。
來自人體或異物的刺激信號可能會觸發(fā)大量嗜酸粒細(xì)胞釋放Gal-10,從病原體和寄生蟲釋放的有毒物質(zhì)也可能誘發(fā)嗜酸粒細(xì)胞凋亡或壞死從而產(chǎn)生CLCs。當(dāng)大量的Gal-10相互作用時,他們可以在很短的時間內(nèi)形成CLCs。因此,CLCs的形成與嗜酸粒細(xì)胞性疾病有關(guān),表明CLCs可用作這些疾病的潛在標(biāo)志物[18]。隨著研究的進(jìn)展,學(xué)者們證明了在各種病理條件下,于組織、體液等嗜酸粒細(xì)胞浸潤部位均觀察到了CLCs/Gal-10(表1)。慢性鼻竇炎(CRS)病人的黏膜、分泌物及氣道中存在大量的嗜酸粒細(xì)胞。嗜酸粒細(xì)胞的分泌顆粒中含有許多豐富的蛋白質(zhì),例如嗜酸粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)、嗜酸性細(xì)胞過氧化物酶(EPX)、主要的髓鞘堿性蛋白(MBP-1、MBP-2)和嗜酸粒細(xì)胞來源的神經(jīng)毒素(EDN)。這些高度陽離子的蛋白質(zhì)不僅對病原體有直接毒性,對組織也有毒性。它們通過破壞脂質(zhì)雙膜的完整性,發(fā)揮神經(jīng)毒性、核糖核酸酶活性,并參與活性氧化劑和自由基的生成[19],因而被視為嗜酸粒細(xì)胞類炎癥和疾病如嗜酸粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎伴鼻息肉(ECRSwNP)的生物標(biāo)志物,但不是藥物治療的靶點,而嗜酸粒細(xì)胞來源的CLCs可能直接導(dǎo)致疾病,成為嗜酸粒細(xì)胞類疾病診斷和治療的靶點[12]。
表1 與CLCs/Gal-10有關(guān)的疾病
Gal-10的mRNA水平已被證明是體外人全血中CRTH2活化的標(biāo)志物[33]。張羅等通過logistic回歸分析與受試者工作特征(ROC)曲線得出基于實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的CLCs mRNA水平可以作為鑒定ECRSwNP的可靠和替代方法(AUC=0.95)[34]。隨后其所在的團(tuán)隊[35-36]通過對CRSwNP病人術(shù)后隨訪,發(fā)現(xiàn)與未復(fù)發(fā)的病人相比,復(fù)發(fā)病人的鼻分泌物中CLCs濃度及CLCs mRNA水平均顯著增加,得出鼻分泌物中CLCs濃度及其mRNA水平可作為預(yù)測復(fù)發(fā)的非侵入性指標(biāo)。目前診斷ECRSwNP的金標(biāo)準(zhǔn)是組織病理學(xué)檢查,然而此為有創(chuàng)操作,不利于日常診療,鼻腔分泌物中CLCs作為一種無創(chuàng)檢查,簡便快捷,值得大力推廣使用。
通過調(diào)查CRSwNP病人鼻分泌物中CLCs濃度對糖皮質(zhì)激素反應(yīng)的預(yù)測意義[37],張羅的團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)鼻分泌物中的CLCs濃度與糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)相關(guān),并且糖皮質(zhì)激素治療可顯著降低CLCs濃度,由此得出結(jié)論:鼻分泌物中CLCs的濃度可以預(yù)測CRSwNP病人對糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng)。鼻息肉組織中性粒細(xì)胞增多、血清淀粉樣蛋白A(與高密度脂蛋白相關(guān)的載脂蛋白)水平升高、黏蛋白4的上調(diào)、黏蛋白1的下調(diào)、白細(xì)胞介素-25(IL-25)均與糖皮質(zhì)激素抵抗有關(guān),可以預(yù)測CRSwNP病人對糖皮質(zhì)激素治療的反應(yīng),與以上指標(biāo)相比,CLCs的簡便易得是個不可忽略的優(yōu)點,在臨床實踐中常規(guī)使用這種生物標(biāo)志物,可能會在將來為CRSwNP病人提供更好的糖皮質(zhì)激素治療策略。Persson等[12]通過使用無佐劑的Gal-10晶體免疫非洲駝得到3種治療性單克隆抗體:1D11、4E8及6F5抗體,并通過實驗得出這些抗體可以溶解源自CRSwNP病人黏液樣本中的CLCs以及哮喘小鼠模型氣道內(nèi)的外源性重組Gal-10晶體,抑制了CLCs誘導(dǎo)的氣道炎癥、粘液的產(chǎn)生、杯狀細(xì)胞化生等,為CLCs導(dǎo)致的嗜酸性疾病的治療提供了新的方向。但是目前,研究尚停留在基礎(chǔ)實驗階段,是否可以通過清除CLCs來緩解CRSwNP病人的病情,仍有待考證。
有研究表明嗜酸粒細(xì)胞的ETosis與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)[24]。那么是否可以通過某種途徑抑制EETosis的發(fā)生或者阻斷其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而減少CLCs的生成來減輕病情?已知在嗜酸粒細(xì)胞中,包括鈣離子載體,佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸鹽,伴隨有白細(xì)胞介素-5(IL-5)或者粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的血小板活化因子(PAF),免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白A(IgA),自身抗體和真菌在內(nèi)的各種刺激均可誘導(dǎo)快速(30~180 min內(nèi))EETosis[8,38-42]。添加包括血漿和紅細(xì)胞分解產(chǎn)物在內(nèi)的物質(zhì)可以防止CLCs的形成[8]。這些理論因素是否可以影響人體內(nèi)源性CLCs的含量以及如何轉(zhuǎn)換為實踐因素去指導(dǎo)有關(guān)疾病的治療,可能是日后研究的方向。
綜上所述,CLCs廣泛存在于哮喘、CRS等嗜酸性疾病中,可作為嗜酸性疾病的生物標(biāo)志物。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)CLCs可以作為CRSwNP預(yù)測診斷、復(fù)發(fā)及治療的標(biāo)志物。CLCs取材簡便,若能應(yīng)用于臨床將極大便利臨床診療工作,前景可觀。目前的研究進(jìn)展顯示,CLCs的產(chǎn)生與EETosis有關(guān),然而目前關(guān)于Gal-10的體內(nèi)分子作用機理并不完全清楚,仍需要廣大學(xué)者繼續(xù)努力。