謝琰琰 王國磊

肺曲霉菌病(pulmonary aspergillosis,PA)又稱為肺曲霉菌感染,主要是指肺曲霉菌侵襲肺部而引發(fā)的肺部疾病,其臨床表現(xiàn)為咳嗽、咯血、發(fā)熱、氣短等,嚴(yán)重者還會(huì)由于肺功能損傷、免疫力降低等因素引發(fā)器官功能衰竭［1］。臨床依據(jù)發(fā)病部位、侵襲情況以及宿主免疫狀態(tài)將PA 分為寄生性肺曲霉菌病(parasitic pulmonary aspergillosis,PPA)、過敏性肺曲霉菌病(allergic pulmonary aspergillosis,APA) 和侵襲性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)3 種 亞 型。PA 患者通常需要接受抗真菌藥物治療,因而在治療前應(yīng)給予患者較為準(zhǔn)確的微生物檢驗(yàn),對(duì)患者的疾病類型進(jìn)行鑒別診斷［2］。本研究主要給予PA 患者GM 試驗(yàn)、G 試驗(yàn)以及痰培養(yǎng),探究微生物檢驗(yàn)在PA 患者臨床診治中的應(yīng)用效果,報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2020 年6 月～2022 年5 月收治的152 例PA 患者作為研究對(duì)象,所有患者均經(jīng)組織病理切片檢查確診為PA,其中PPA 患者63 例,APA 患者57 例,IPA 患者32 例。PPA 患者中男37 例,女26 例；年齡21～71 歲,平均年齡(46.84±3.51)歲。APA 患者中男34 例,女23 例；年齡20～73 歲,平均年齡(47.11±3.45)歲。IPA 患者中男18 例,女14 例；年齡21～66 歲,平均年齡(46.75±3.36)歲。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)核批,且患者及其家屬對(duì)本次研究知情并簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①住院時(shí)間≥5 d；②體溫＞38.3℃；③患者存在不同程度的呼吸道感染癥狀；④胸部影像學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)符合曲霉菌感染特征；⑤同意纖維支氣管鏡下取肺泡灌洗液進(jìn)行GM 檢測(cè)及肺組織活檢；⑥臨床資料完整；⑦精神狀態(tài)良好,具備較高的檢測(cè)依從性。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①年齡≤18 歲；②入院1 周內(nèi)接受股溝抗真菌治療或是正在使用半合成青霉素；③合并其他部位真菌感染或其他呼吸系統(tǒng)疾??；④使用高劑量激素；⑤接受透析治療；⑥輸注白蛋白或球蛋白；⑦化療后存在嚴(yán)重黏膜炎患者。

1.4 方法 所有患者均采用GM 試驗(yàn)、G 試驗(yàn)以及痰培養(yǎng)檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.1 GM 試驗(yàn) ①試劑及儀器：GM 試劑盒(北海市興龍生物制品有限公司)、全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光酶免分析儀(天津喜諾有限公司有限公司)、低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)、漩渦震蕩儀(上?？岛坦怆妰x器有限公司)、4℃/-20℃電冰箱(海爾集團(tuán)公司)。②檢測(cè)過程：于患者入院后為其進(jìn)行常規(guī)禁水禁食,并于第2 天采集空腹靜脈血,置入高速離心機(jī)中以3000 r/min 的速度進(jìn)行10～15 min 的離心,取血清保存于2～8℃冰箱之中,2 h 內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。嚴(yán)重溶血、黃疸、脂血的樣本不給予檢測(cè)。將GM 試劑盒取出于室溫下進(jìn)行溫度平衡20 min,試劑條從密閉盒中取出,將樣本倉和吸頭倉封膜撕下后插入試劑槽中,整個(gè)過程不能讓吸頭跳出或者樣本倉液體濺出。用1 ml 溶解液溶解質(zhì)控品,并在漩渦儀震蕩1 min,直到完全溶解后備用。將溶解后的質(zhì)控品和樣本血清分別吸300 μl依次加入樣本倉里,并反復(fù)吸排6 次以上,加樣過程中避免氣泡產(chǎn)生,啟動(dòng)FASIC 測(cè)量流程進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后檢測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算出每個(gè)樣本的半乳甘露聚糖濃度。半乳甘露聚糖濃度≥0.5 μg/L 則認(rèn)為是半乳甘露聚糖陽性,則發(fā)生曲霉菌深部感染的風(fēng)險(xiǎn)高；半乳甘露聚糖濃度＜0.25 μg/L 則認(rèn)為是半乳甘露聚糖陰性,發(fā)生曲霉菌深部感染的風(fēng)險(xiǎn)低。

1.4.2 G 試驗(yàn) ①試劑及儀器：真菌(1,3)-β-D 葡聚糖檢測(cè)試劑盒(北京金山川科技發(fā)展有限公司,MB-T80)。②檢測(cè)過程：于患者入院后為其進(jìn)行常規(guī)禁水禁食,并于第2 天用專用試管采集空腹靜脈血4 ml,放入高速離心機(jī)內(nèi),以3000 r/min 的速度進(jìn)行10～15 min 離心,分離血漿后2 h 內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)本需要保存于2～8℃條件下,且保存時(shí)間≤24 h,運(yùn)輸過程應(yīng)保障冷藏。取上述血清0.1 ml 加入0.9 ml 處理液之中混合均勻后于70℃條件下孵育10 min,取出后放置于冷卻槽中冷卻5 min。反應(yīng)主劑溶液的配置主要依據(jù)如下原則：GKT-1M：無需復(fù)溶,GKT-2M、GKT-5M、GKT-10M、GKT-20M：分別取反應(yīng)主劑溶液0.6、1.2、2.8、5.6 ml 混勻并靜置代用,復(fù)溶后的試劑于2～8℃保存,并于30 min 內(nèi)使用。將血清樣本0.2 ml 加入酶反應(yīng)主劑之中,溶解后通過微量加樣器將其轉(zhuǎn)移至9 mm×65 mm 標(biāo)準(zhǔn)無熱源平底試管中,在此過程中應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,隨后將其插入MB-80 微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)之中進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后由檢測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算出待檢測(cè)的血清樣本之中(1,3)-β-D 葡聚糖含量。

1.4.3 痰培養(yǎng) 為入院的PA 患者采集痰液做真菌培養(yǎng)以及涂片檢查,采集過程中應(yīng)嚴(yán)格遵循無菌操作。患者晨起后應(yīng)用朵貝氏液及清水漱口,充分去除口腔中的細(xì)菌,然后由采集人員指導(dǎo)患者進(jìn)行深呼吸,用力咳出氣管深部的痰液至無菌容器之中,30 min 內(nèi)送檢。依據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行痰液培養(yǎng),將樣本接種于實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)沙保羅氏培養(yǎng)基和科瑪嘉玉米顯色培養(yǎng)基之中,經(jīng)25℃孵育。對(duì)生長的菌落進(jìn)行染色,并于顯微鏡下觀察菌體的形態(tài),經(jīng)全自動(dòng)微生物系統(tǒng)鑒定及藥敏試驗(yàn)。涂片鏡檢：臨床標(biāo)本經(jīng)過10%～20%的KOH 固定處理5～10 min 或革蘭氏染色涂片后,直接用電子顯微鏡在高倍鏡下觀察菌絲、孢子。依據(jù)臨床對(duì)深部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行判斷,將標(biāo)本接種于沙保羅氏培養(yǎng)基和科瑪嘉玉米顯色培養(yǎng)基之后24～48 h,如若菌落呈孔狀生長則記為陽性,如偏厚經(jīng)染色后鏡檢,如若發(fā)現(xiàn)孢子及菌絲判定為陽性。

1.5 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)比三種亞型患者不同檢測(cè)方法陽性率及臨床癥狀,分析三種亞型患者治療措施及預(yù)后效果。①聯(lián)合檢驗(yàn)中GM 試驗(yàn)、G 試驗(yàn)、痰培養(yǎng)任意一項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果為陽性即記為陽性。②臨床癥狀主要包括發(fā)熱、咳嗽、咯血、胸悶、肺啰音等。③依據(jù)患者的實(shí)際情況給予手術(shù)、藥物治療,探究不同類型患者的治療情況及預(yù)后效果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種亞型患者不同檢測(cè)方法的陽性率對(duì)比PPA、APA、IPA 患者GM 試驗(yàn)的陽性率高于G 試驗(yàn)與痰培養(yǎng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；且PPA、APA、IPA 患者聯(lián)合檢驗(yàn)的陽性率高于G 試驗(yàn)與痰培養(yǎng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PPA、APA、IPA 患者聯(lián)合檢驗(yàn)的陽性率略高于GM 試驗(yàn),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 三種亞型患者不同檢測(cè)方法的陽性率對(duì)比［n(%)］

2.2 三種亞型患者臨床癥狀對(duì)比 PPA 患者癥狀多表現(xiàn)為咳嗽、咯血、胸悶,APA 患者癥狀多表現(xiàn)為咳嗽、咯血、胸悶、肺啰音,而IPA 患者癥狀多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、胸悶、肺啰音。IPA 患者的發(fā)熱、咳嗽、胸悶、肺啰音發(fā)生率高于APA、PPA 患者,APA 患者的發(fā)熱、咳嗽、胸悶、肺啰音發(fā)生率高于PPA 患者,PPA 患者咯血發(fā)生率高于APA、IPA 患者,APA 患者咯血發(fā)生率高于IPA 患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 三種亞型患者臨床癥狀對(duì)比［n(%)］

2.3 三種亞型患者治療措施及預(yù)后效果分析 PPA 患者85.71%采用手術(shù)治療,APA 患者87.72%采用藥物治療,IPA 患者100.00%采用藥物治療。治療后,三種亞型患者的治療效果均較好,PPA 治愈率為95.24%,APA 治愈率為92.98%,IPA 治愈率為90.63%。見表3。

表3 三種亞型患者治療措施及預(yù)后效果分析［n(%)］

3 討論

PA 在臨床重癥患者之中高發(fā),由于該類患者往往需要長期接受抗生素以及激素等藥物治療,導(dǎo)致免疫力降低,因而發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高。PA 患者主要可以分為PPA、APA 以及IPA 三種亞型,PPA 發(fā)病較為隱匿,且癥狀缺少特異性,診斷較為困難；APA 多與哮喘、慢性嗜酸粒細(xì)胞肺炎等進(jìn)行鑒別；IPA 則病情進(jìn)展較為迅速,對(duì)患者的生命安全造成嚴(yán)重影響［3］。因而為了更好地保障臨床針對(duì)性治療措施的開展,需要通過微生物檢驗(yàn)以及臨床癥狀對(duì)患者疾病亞型進(jìn)行分辨,選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒ㄒ蕴嵘R床療效［4］。

微生物檢驗(yàn)作為以微生物學(xué)理論為基礎(chǔ),利用微生物試驗(yàn)技術(shù)研究微生物種類、性質(zhì)、活動(dòng)規(guī)律等的重要技術(shù),在真菌感染性疾病的診斷中具有良好的應(yīng)用價(jià)值［5］。本次研究對(duì)152 例PA 患者分別進(jìn)行微生物檢驗(yàn)——GM 試驗(yàn)、G 試驗(yàn)以及痰培養(yǎng)檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),PPA、APA、IPA 患者GM 試驗(yàn)的陽性率高于G 試驗(yàn)與痰培養(yǎng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；且PPA、APA、IPA 患者聯(lián)合檢驗(yàn)的陽性率高于G 試驗(yàn)與痰培養(yǎng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PPA、APA、IPA 患者聯(lián)合檢驗(yàn)的陽性率略高于GM 試驗(yàn),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。對(duì)其原因進(jìn)行分析,主要是由于痰培養(yǎng)為微生物檢驗(yàn)的基礎(chǔ)措施,主要通過致病菌培養(yǎng)的措施對(duì)感染疾病的類型進(jìn)行判斷。G 試驗(yàn)通過對(duì)真菌細(xì)胞壁的主要成分特異性進(jìn)行檢驗(yàn),從而判斷患者真菌感染的情況,如若患者機(jī)體受到真菌深部侵襲,則會(huì)導(dǎo)致(1,3)-β-D 葡聚糖在體內(nèi)釋放,含量不斷提升［6-9］。而GM 的主要檢測(cè)成分為半乳甘露聚糖,該成分廣泛存在于曲霉與青霉細(xì)胞壁之中,該指標(biāo)的釋放量與菌量呈正比,因而對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè),能夠更好地反映感染的程度,并通過對(duì)其的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)能夠評(píng)估患者的臨床治療效果,并依據(jù)檢測(cè)結(jié)果優(yōu)化治療方案,改善患者預(yù)后［10-13］。

同時(shí)本次研究對(duì)患者的癥狀進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PPA 患者癥狀多表現(xiàn)為咳嗽、咯血、胸悶,APA 患者癥狀多表現(xiàn)為咳嗽、咯血、胸悶、肺啰音,而IPA 患者癥狀多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、胸悶、肺啰音。IPA 患者的發(fā)熱、咳嗽、胸悶、肺啰音發(fā)生率高于APA、PPA 患者,APA 患者的發(fā)熱、咳嗽、胸悶、肺啰音發(fā)生率高于PPA 患者,PPA 患者咯血發(fā)生率高于APA、IPA 患者,APA 患者咯血發(fā)生率高于IPA 患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。因而臨床通過微生物檢驗(yàn)的方法能夠?qū)θNPA 亞型進(jìn)行鑒別診斷,為病情的評(píng)估提供更進(jìn)一步的參考信息［14-16］。既往研究中開展涂片直接鏡檢,操作較為便捷,可更快速得出結(jié)果。但通常無法對(duì)真菌菌屬進(jìn)行區(qū)分。痰培養(yǎng)的應(yīng)用能夠?qū)φ婢鶎龠M(jìn)行區(qū)分,致病性真菌培養(yǎng)呈現(xiàn)陽性即可確診,但對(duì)于條件致病性真菌,則需要進(jìn)行連續(xù)2 次培養(yǎng)分離出同種曲霉菌才能夠作出診斷。真菌感染會(huì)合并細(xì)菌感染,故在臨床工作中需提高警惕,盡早作出診斷,避免誤診、漏診。乳甘露聚糖同樣是真菌細(xì)胞壁的主要成分,具有一定的抗原性,因而GM 試驗(yàn)對(duì)于早期診斷曲霉菌病有一定價(jià)值。開展GM 試驗(yàn),同時(shí)可聯(lián)合肺泡灌洗液培養(yǎng),盡可能采取多種試驗(yàn)檢測(cè)方法,提高肺曲霉菌的診斷率。真菌的抗原檢測(cè)主要有(1,3)-β-D 葡聚糖及半乳甘露聚糖為真菌細(xì)胞壁的主要成分,其普遍存在于真菌屬的細(xì)胞壁中,為所有酵母菌及絲狀真菌細(xì)胞壁中特有的成分。對(duì)于BDG 的檢測(cè)稱為G 試驗(yàn),可被用于肺曲霉菌病的早期診斷。

此外,不同PA 亞型患者的表現(xiàn)不同,也會(huì)使得臨床治療方案存在差異,其中PPA 患者主要是由于曲霉球絕大多數(shù)發(fā)生于原有的肺空洞內(nèi),形團(tuán)塊狀肉芽腫性曲霉菌球,導(dǎo)致患者出現(xiàn)咯血癥狀,因而臨床中主張應(yīng)用手術(shù)治療,其主要目的在于將肺部原發(fā)疾病和寄生性曲菌球切除,避免出血［17-19］。APA 是由曲霉引起的一種過敏性疾病,幾乎僅由煙曲霉引起,主要表現(xiàn)有反復(fù)發(fā)作的哮喘癥狀,該類患者可經(jīng)歷3 個(gè)臨床階段：早期激素敏感性哮喘,中期激素依賴性哮喘,晚期肺纖維化、蜂窩肺［20］。因而該亞型早期通過藥物治療可阻止病情進(jìn)展,晚期則需通過手術(shù)保障預(yù)后效果。IPA 臨床上則主要采用抗真菌藥的治療方法,本研究中,PPA以手術(shù)為主,APA 以用藥為主,IPA 患者則未經(jīng)手術(shù)治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn),三種亞型患者治療效果均較好,PPA 治愈率為95.24%,APA 治愈率為92.98%,IPA 治愈率為90.63%。

總之,微生物檢驗(yàn)方法聯(lián)合應(yīng)用能夠更好地提升PA 患者的診斷率,并對(duì)患者進(jìn)行亞型判斷,從而確定后續(xù)治療的開展。經(jīng)治療后各亞型患者均取得較好的預(yù)后效果,該微生物檢驗(yàn)為臨床疾病的診斷、鑒別診斷及治療提供了較高的參考依據(jù),值得廣泛應(yīng)用于臨床。