李少君，李 靜，于佳新，張 沛

1.河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北唐山 063000；2.河北省唐山市工人醫(yī)院心內(nèi)科，河北唐山 063000

《中國心血管健康與疾病報(bào)告2019概要》[1]顯示，我國冠心病現(xiàn)患病人數(shù)達(dá)1 100萬，城市、農(nóng)村病死率分別為115.32/100 000、122.04/100 000，由其導(dǎo)致的心血管死亡與全因死亡成為威脅人民生命健康的首要疾病類型，防治形勢嚴(yán)峻，因此對此進(jìn)行研究意義重大。一項(xiàng)共納入267 500例中國人群的隊(duì)列研究隨訪6～19年發(fā)現(xiàn)，血脂異常是心血管死亡與全因死亡的相關(guān)危險(xiǎn)因素，其中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)<1.3 mmol/L時(shí)死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[2]。臨床工作中應(yīng)用調(diào)脂藥物進(jìn)行預(yù)防，以期降低心血管死亡與全因死亡的風(fēng)險(xiǎn)，但一部分冠心病患者經(jīng)規(guī)范調(diào)脂治療HDL-C水平達(dá)標(biāo)后，仍遺留較高的心血管剩余風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，遺傳因素與心血管死亡和全因死亡有關(guān)[5-6]。載脂蛋白(Apo)A1、ApoA2基因多態(tài)性可影響血脂譜及調(diào)脂治療療效，并且與冠心病發(fā)生有關(guān)，由此推測，ApoA1/2基因多態(tài)性可影響冠心病患者的預(yù)后?；谝陨媳尘?，本研究嘗試探討ApoA1/2基因多態(tài)性與HDL-C水平在老年冠心病心血管死亡與全因死亡中的交互作用，旨在為其臨床預(yù)防不良預(yù)后提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年1月唐山市中醫(yī)醫(yī)院收治的385例老年冠心病患者作為研究對象，其中有36例失訪，男164例，女185例，年齡60～82歲，平均(68.09±5.44)歲。根據(jù)5年預(yù)后情況分為死亡組(61例)和存活組(288例)。兩組患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、民族、冠心病病程、疾病類型、美國紐約心臟病學(xué)會(huì)心功能分級(NYHA分級)、加拿大心臟病學(xué)會(huì)心絞痛嚴(yán)重度分級(CCSC分級)、吸煙、飲酒、合并疾病等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《內(nèi)科學(xué)》第8版冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；年齡≥60歲；長期在本地居?。蛔栽竻⑴c本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：精神異常、認(rèn)知障礙等無法配合本研究者；吸毒者；入組前2周有調(diào)脂藥物應(yīng)用史者。

表1 兩組患者一般資料比較或n(%)]

續(xù)表1 兩組患者一般資料比較或n(%)]

組別n吸煙否是飲酒否是合并疾病糖尿病高血壓死亡組6143(70.49)18(29.51)47(77.05)14(22.95)25(40.98)19(31.15)存活組288212(73.61)76(26.39)231(80.21)57(19.79)129(44.79)78(27.08)t/χ20.2490.3100.296P0.6180.5780.586

1.2儀器與試劑 全血基因組提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司，批號(hào)：252250AX)、PCR試劑盒(美國Genecopoeia公司；批號(hào)：CO2011A)、DL2000 DNA Marker(日本Takara公司，批號(hào)：D502A)、引物合成(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)、全自動(dòng)生化檢測儀(日本日立公司，760)、離心機(jī)(美國Eppendorf公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司，QuantStudio 6)、微量分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，752)、電熱恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表有限公司，HW-SY11-K P2)、全自動(dòng)生化分析儀(Olympus公司AU400)。

1.3方法

1.3.1生存狀態(tài)隨訪 本研究結(jié)局包括心血管死亡與全因死亡，根據(jù)國際疾病分類第10版(ICD-10)[8]標(biāo)準(zhǔn)，心血管死亡包括缺血性心臟病(ICD-10編碼I20～I(xiàn)25)、腦卒中(ICD-10編碼I60～I(xiàn)69)、其他各種類型的心血管疾病(ICD-10編碼I00～I(xiàn)99)引起的死亡；全因死亡是指隨訪期間因任何一種原因所致的死亡，隨訪方式為電話、微信等，每位患者至少留取3名親屬的聯(lián)系方式，隨訪時(shí)間5年。

1.3.2一般資料收集方法 采用一般資料調(diào)查表收集患者年齡、性別、BMI、民族、冠心病病程、吸煙、飲酒、合并疾病資料，其中BMI=體質(zhì)量(kg)/身高(m)2，吸煙定義為每日吸煙3支或以上，吸煙史≥6個(gè)月，飲酒定義為每周飲酒≥1次，每次折合酒精量>40 g，連續(xù)飲酒≥6個(gè)月；采用NYHA分級[9]評估心功能，采用CCSC分級[10]評估心絞痛嚴(yán)重程度。所有參與調(diào)查人員均經(jīng)過培訓(xùn)，調(diào)查過程遵循《調(diào)查員手冊》，確保數(shù)據(jù)的客觀性，數(shù)據(jù)錄入時(shí)采用雙錄入法，并進(jìn)行一致性檢驗(yàn)。

1.3.3ApoA1/2基因多態(tài)性及HDL-C水平檢測 (1)入院時(shí)采集患者外周靜脈血5 mL，采用全血基因組提取試劑盒提取血細(xì)胞基因組DNA，以微量分光光度計(jì)對所提取的DNA質(zhì)量進(jìn)行鑒定，A260/A280為1.6～1.8符合要求。采用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的完整性，檢測的基因位點(diǎn)有ApoA1-75G/A、ApoA1+83C/T、ApoA2-256C/T。PCR體系包括引物、4種dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反應(yīng)緩沖液共20 μL。ApoA1-75G/A上、下游引物分別為5′-TTAAGTTCCACATTGCCAGGAC-3′、5′-CCTCCTTCTCGCAGTCTCTAAG-3′；ApoA1+83C/T上、下游引物分別為5′-CTCCCCAGCTCAAGGTTC-3′、5′-ACACCTACCCGTCAGGAAG-3′；ApoA2-256C/T上、下游引物分別為5′-ATCAGCATCCAGGTCATTC-3′、5′-AGGAGAGGACAAGCACAT-3′。反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，150 V電泳15 min后取出凝膠，紫外線投射儀上觀察結(jié)果。(2)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清HDL-C水平。

2 結(jié) 果

2.1隨訪結(jié)果 385例老年冠心病患者隨訪5年，36例(9.35%)失訪，349例(90.65%)有完整隨訪資料。獲訪患者中共有61例死亡，其中36例死于心血管疾病，包括腦卒中14例，缺血性心臟病16例，其他各種類型的心血管疾病6例。

2.2兩組患者ApoA1/2基因多態(tài)性與HDL-C水平比較 基因分型檢測結(jié)果顯示，ApoA1-75G/A基因型：GG、GA、AA；ApoA1+83C/T基因型：CC、CT、TT；ApoA2-256C/T基因型：CC、CT、TT；PCR擴(kuò)增目的片段后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選擇條帶清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物15 μL進(jìn)行基因測序驗(yàn)證。采用BioEdit version5.0.6軟件查看測序結(jié)果，證實(shí)ApoA1-75G/A、ApoA1+83C/T、ApoA2-256C/T均存在多態(tài)性。兩組患者基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，具有人群代表性(P>0.05)。兩組患者ApoA1-75G/A基因型與等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者ApoA1+83C/T、ApoA2-256C/T基因型與等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；死亡組患者HDL-C水平低于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者ApoA1/2基因多態(tài)性與HDL-C水平比較[n(%)或

組別nApoA2-256C/T基因型CCCTTTApoA2-256C/T等位基因CTHDL-C(mmol/L)死亡組6156(91.80)4(6.56)1(1.64)116(95.08)6(4.92)1.05±0.19存活組288256(88.89)27(9.38)5(1.74)539(93.58)37(6.42)1.32±0.14χ2/t0.5010.39512.784P0.7790.530<0.001

2.3不同ApoA1-75G/A基因型患者HDL-C水平比較 ApoA1-75G/A基因型AA患者HDL-C水平為(1.58±0.10)mmol/L，高于基因型GA患者的(1.40±0.11)mmol/L和基因型GG患者的(1.24±0.13)mmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=75.915，P<0.001)。ApoA1-75G/A基因型AA患者、基因型GA患者和基因型GG患者HDL-C水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4心血管死亡與全因死亡的多因素Logistic回歸分析 將心血管死亡與全因死亡作為結(jié)局變量，納入兩組比較P<0.05的資料作為自變量，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，ApoA1-75G/A基因型GA、AA及HDL-C均是心血管死亡與全因死亡的影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 心血管死亡與全因死亡的多因素Logistic回歸分析

2.5ApoA1-75G/A基因多態(tài)性與HDL-C水平對心血管死亡與全因死亡的交互作用 單獨(dú)HDL-C水平降低所致的OR為5.691，單獨(dú)ApoA1-75G/A基因突變所致的OR為0.400，二者同時(shí)存在時(shí)，交互作用的OR為5.333，且γ為0.931，提示ApoA1-75G/A基因型GA、AA與HDL-C降低在心血管死亡與全因死亡中呈負(fù)向交互作用，即ApoA1-75G/A基因突變對心血管死亡與全因死亡的相關(guān)因素HDL-C水平降低的效應(yīng)具有減弱作用；同時(shí)5.333>5.691×0.400，則ApoA1-75G/A基因突變與HDL-C水平降低交互作用符合超相乘模型。見表4。

表4 ApoA1-75G/A基因多態(tài)性與HDL-C因素對心血管死亡與全因死亡的交互作用

3 討 論

目前，關(guān)于血脂與老年冠心病發(fā)病、病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的報(bào)道較多，已明確血脂代謝異常在心血管死亡與全因死亡中起消極作用，但血脂指標(biāo)較多，既往報(bào)道常集中于甘油三脂和低密度脂蛋白，關(guān)于HDL-C的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，死亡組患者HDL-C水平低于存活組，提示HDL-C水平與老年冠心病患者心血管死亡和全因死亡有關(guān)。李明卓等[11]研究顯示，在血脂水平正常人群中，HDL-C水平縱向升高是冠心病的獨(dú)立保護(hù)因素。HDL-C具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，可將膽固醇從肝外轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行代謝，故HDL-C水平降低患者在長期生活中發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)度增加，從而增加缺血性心臟病、腦卒中等的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[12]。

ApoA1/2是與HDL-C密切相關(guān)的載脂蛋白類型，其中ApoA1可激活卵磷脂-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶，促進(jìn)膽固醇釋放，是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程的核心組分；ApoA2對膽固醇的影響目前尚存爭議，部分觀點(diǎn)認(rèn)為，ApoA2可強(qiáng)化HDL-C保護(hù)低密度脂蛋白被氧化的功能，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生[13]。部分資料顯示，ApoA2不利于HDL-C的轉(zhuǎn)運(yùn)和抗氧化作用，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組患者ApoA1+83C/T、ApoA2-256C/T基因型與等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示ApoA1+83C/T、ApoA2-256C/T基因多態(tài)性與心血管死亡和全因死亡無關(guān)。兩組患者ApoA1-75G/A基因型與等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明ApoA1-75G/A基因多態(tài)性與心血管死亡和全因死亡有關(guān)。且ApoA1-75G/A基因型AA患者HDL-C水平高于基因型GA患者和基因型GG患者，說明攜帶A等位基因的冠心病患者HDL-C水平較高。DE LUIS等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ApoA1-75G/A基因多態(tài)性與飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗有關(guān)，并獲得了A等位基因攜帶者在低熱量飲食后HDL-C水平升高的額外證據(jù)，本研究的觀點(diǎn)與之存在相似之處。另一項(xiàng)研究顯示，ApoA1-75G/A與代謝綜合征有關(guān)，未攜帶A等位基因的男性表現(xiàn)出高比例向心性肥胖、低水平HDL-C和高血糖，而肥胖、低水平HDL-C和高血糖均可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，引發(fā)心血管死亡[16]。PANDITH等[17]研究顯示，ApoA1-75G/A基因型在發(fā)生急性心肌梗死與未發(fā)生急性心肌梗死患者中比例相似，與急性心肌梗死無關(guān)，本研究結(jié)論與之不一致，一方面可能是因?yàn)榉N族、國度不同；另一方面是以急性心肌梗死為結(jié)局事件。本研究是以全因死亡與心血管死亡為結(jié)局事件，可能導(dǎo)致了研究結(jié)論不同，仍需后續(xù)納入多種族、多國度人群進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

在以上研究基礎(chǔ)上本研究還發(fā)現(xiàn)，ApoA1-75G/A基因型GA、AA與HDL-C水平降低在心血管死亡與全因死亡中呈負(fù)向交互作用，即ApoA1-75G/A基因突變可減低因HDL-C水平降低對心血管死亡與全因死亡的影響效應(yīng)，ApoA1-75G/A基因突變與HDL-C水平降低的交互作用符合超相乘模型。分析其原因發(fā)現(xiàn)，ApoA1-75G/A基因位于ApoA1基因啟動(dòng)子區(qū)的第75個(gè)堿基，相對于野生GG基因型，突變雜合子與突變純合子中的A等位基因可能影響了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的識(shí)別，使ApoA1基因轉(zhuǎn)錄活性降低，抑制了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，進(jìn)而對老年冠心病心血管死亡與全因死亡起保護(hù)作用，但其確切的機(jī)制需要更為系統(tǒng)和深入的研究證實(shí)。本研究也有一定局限性，如樣本量小，研究對象人群來源國度單一，可能造成統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)偏倚，縮小了研究成果適用范圍，仍需后續(xù)多中心、多國度隨機(jī)對照研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，ApoA1/2基因多態(tài)性、HDL-C水平均與老年冠心病患者心血管死亡與全因死亡有關(guān)，且ApoA1-75G/A基因突變可減低因HDL-C水平降低對心血管死亡與全因死亡的影響效應(yīng)，呈現(xiàn)出預(yù)后保護(hù)作用。