王 玨，徐桂珍，熊暮珺

湖南省郴州市第一人民醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科；2.血液內(nèi)科，湖南郴州 423000

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種以漿細(xì)胞異常增殖為特征的惡性血液系統(tǒng)疾病，其異質(zhì)性較強(qiáng)，且治愈困難、復(fù)發(fā)率較高，嚴(yán)重威脅患者生命安全[1]。MM能夠在血液或尿液中生成大量的單克隆免疫球蛋白，從而導(dǎo)致貧血、骨質(zhì)破壞及腎衰竭等[1]。因此，高效準(zhǔn)確地評(píng)估患者預(yù)后情況是目前臨床亟待解決的熱點(diǎn)問(wèn)題。共刺激因子B7 同源體3(B7H3)是B7家族的新成員，定位于人15號(hào)染色體，廣泛存在于脾臟和胸腺等淋巴器官中，能夠介導(dǎo)抗原遞呈、調(diào)控T細(xì)胞增殖及啟動(dòng)細(xì)胞免疫等過(guò)程[2]。有研究表明，抑制B7H3表達(dá)能夠使套細(xì)胞淋巴瘤的腫瘤細(xì)胞周期處于G0/G1期，同時(shí)抑制免疫組織化學(xué)指標(biāo)Ki-67表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的快速增殖[2]。泛素連接酶c(c-Cbl)是一種泛素蛋白酶體，定位于人染色體11q23.3，能夠在真核細(xì)胞內(nèi)特異性結(jié)合底物蛋白，使其泛素化降解，對(duì)酪氨酸激酶及其受體具有重要的調(diào)控作用[3]。有研究表明，在急性髓細(xì)胞白血病中，c-Cbl編碼基因的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，使其轉(zhuǎn)錄受到抑制，導(dǎo)致T 細(xì)胞受體(TCR)及B細(xì)胞受體(BCR)功能異常，使其抑制白血病進(jìn)展的能力減弱[4]。目前，B7H3、c-Cbl與MM的研究較少，且二者對(duì)MM患者預(yù)后的評(píng)估能力尚不清楚。因此，本研究旨在探討B(tài)7H3和c-Cbl在MM中的表達(dá)水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2017年1月至2018年9月收治的92例MM患者納入MM組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2015年修訂)》[5]中的診斷準(zhǔn)則；(2)均經(jīng)骨髓穿刺活檢確診；(3)均為首次確診，既往無(wú)放化療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤(如淋巴瘤、肺癌及肝癌等)；(2)合并其他血液系統(tǒng)疾病，如再生障礙性貧血、特發(fā)性血小板減少癥及巨幼細(xì)胞性貧血等；(3)先天性免疫系統(tǒng)異常；(4)對(duì)硼替佐米和地塞米松過(guò)敏；(5)肝腎功能異常；(6)臨床資料缺失或不全。另選取90例同期同年齡層來(lái)本院體檢的健康者納入對(duì)照組。MM組中男50例，女42例；年齡52～70歲，平均(61.06±7.29)歲；高分化50例，中分化30例，低分化12例；有貧血71例，無(wú)貧血21例；有高鈣血癥60例，無(wú)高鈣血癥32例；國(guó)際分期系統(tǒng)(ISS)分期[6]：Ⅰ期49例，Ⅱ期35例，Ⅲ期8例。對(duì)照組中男47例，女43例；年齡50～69歲，平均(61.25±7.08)歲。所有研究對(duì)象均自愿加入本研究，且簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法 采集所有研究對(duì)象外周靜脈血10 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，通過(guò)離心機(jī)(山東博科科學(xué)儀器有限公司；型號(hào)：TD-6M)離心5 min，條件為6 000 r/min，取其上清液置于試管中，在-80 ℃冰箱中保存。采用Trizol試劑(Invitrogen公司，批號(hào)：20161226)提取總RNA，嚴(yán)格遵循試劑盒的操作規(guī)定。將提取的總RNA滴入20 μL無(wú)核糖核酸酶的水中溶解，通過(guò)紫外分光光度儀(美國(guó)Promega公司)檢測(cè)A260和A280，計(jì)算其RNA的純度和濃度，選取A260/A280為1.8～2.0的標(biāo)本用于后續(xù)試驗(yàn)。采用HG TaqMan miRNA試劑盒(新?；驒z測(cè)有限公司，批號(hào)：20161230)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。B7H3 mRNA和c-Cbl mRNA的反轉(zhuǎn)錄條件均為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)B7H3 mRNA和c-Cbl mRNA的表達(dá)水平。通過(guò)SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(Qiagen公司，批號(hào)：20161221)測(cè)定二者的表達(dá)水平，嚴(yán)格遵循操作流程。PCR 擴(kuò)增體系：SYBR Premix 10.0 μL、cDNA樣品3.0 μL、ddH2O 5.0 μL、正向引物1.0 μL及反向引物1.0 μL，共計(jì)20.0 μL。B7H3 mRNA的正向引物序列為5′-GCTCCACTCCACTCAGCCAGTAC-3′；反向引物序列為5′-GCTCATCTTTGCCTTCTT-3′。內(nèi)參基因GAPDH的正向引物序列為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；反向引物序列為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。c-Cbl mRNA的正向引物序列為5′-GCCCATTAGTAGGTCCAGAGTG-3′；反向引物序列為5′-GATGTATCCAAAGGCCGTA GAG-3′。內(nèi)參基因U6的正向引物序列為5′-GAATCCTGATCTGACTGGCTTATG-3′；反向引物序列為5′-GCTGCGGCAGAAGGTCAAGT-3′。B7H3 mRNA和c-Cbl mRNA的PCR反應(yīng)條件均為預(yù)變性95 ℃ 20 s、變性95 ℃ 20 s、退火60 ℃ 30 s、延伸70 ℃ 5 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每份標(biāo)本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物序列由蘇州瑞博生物技術(shù)股份有限公司合成。以Ct值法檢測(cè)B7H3 mRNA和c-Cbl mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，相對(duì)于GAPDH和U6的比值為2—ΔΔCt，以ΔCt值為結(jié)果，其中ΔCt=Ct目的基因— Ct內(nèi)參基因。

1.3治療方法 MM患者均采用硼替佐米(西安楊森制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20160071)聯(lián)合地塞米松(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H44024469)及沙利度胺(常州制藥廠有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H32026130)的化療方案[7]。以21 d為1個(gè)療程，在第1、4、8、11天采用硼替佐米，劑量為1.3 mg/m2。沙利度胺每日服用100 mg，地塞米松每個(gè)療程應(yīng)用總量為80～160 mg，口服，按平均每天每次劑量應(yīng)用，具體每天每次劑量視患者具體情況而定。共計(jì)治療6個(gè)療程。采用國(guó)際骨髓瘤工作組制定的療效標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估療效[8]，療效分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定及無(wú)效。總有效率=(完全緩解例數(shù)+部分緩解例數(shù))/總例數(shù)×100%。所有患者隨訪(fǎng)觀察1～36個(gè)月，隨訪(fǎng)時(shí)間2017年1月至2021年9月，隨訪(fǎng)期間無(wú)失訪(fǎng)病例。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清B7H3和c-Cbl表達(dá)水平比較 MM組血清B7H3表達(dá)水平較對(duì)照組升高，而c-Cbl表達(dá)水平較對(duì)照組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清B7H3和c-Cbl表達(dá)水平比較

2.2MM患者血清B7H3與c-Cbl表達(dá)水平的相關(guān)性 MM患者血清B7H3表達(dá)水平與c-Cbl表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.818，P<0.05)。

2.3不同特征MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較 不同分化程度和ISS分期MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同年齡、性別MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有貧血、有高鈣血癥與無(wú)貧血、無(wú)高鈣血癥MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同特征MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較

續(xù)表2 不同特征MM患者血清B7H3、c-Cbl表達(dá)水平比較

2.4B7H3、c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者一般資料比較 以MM患者血清B7H3表達(dá)水平的中位數(shù)3.53為臨界值，大于該值為B7H3高表達(dá)組，反之則為B7H3低表達(dá)組。以c-Cbl表達(dá)水平的中位數(shù)0.72為臨界值，大于該值為c-Cbl高表達(dá)組，反之則為c-Cbl低表達(dá)組。B7H3、c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3、表4。

表3 B7H3高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者一般資料比較或n(%)]

表4 c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者一般資料比較或n(%)]

2.5B7H3、c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者治療有效率比較 B7H3高表達(dá)組治療有效率較B7H3低表達(dá)組降低，而c-Cbl高表達(dá)組治療有效率較c-Cbl低表達(dá)組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.464，P=0.035；χ2=4.234，P=0.040)。見(jiàn)表5、表6。

表5 B7H3高表達(dá)組和低表達(dá)組治療有效率比較[n(%)]

表6 c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組治療有效率比較[n(%)]

2.6B7H3、c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者生存情況比較 B7H3高表達(dá)組3年總生存率為37.78%(17/45)， B7H3低表達(dá)組3年總生存率為61.70%(29/47)，B7H3高表達(dá)組3年總生存率較B7H3低表達(dá)組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.778，P=0.029)。c-Cbl高表達(dá)組3年總生存率為60.42%(29/48)，c-Cbl低表達(dá)組3年總生存率為36.36%(16/44)，c-Cbl高表達(dá)組3年總生存率較c-Cbl低表達(dá)組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.757，P=0.016)。見(jiàn)圖1。

注：A為B7H3高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者生存曲線(xiàn)；B為c-Cbl高表達(dá)組和低表達(dá)組MM患者生存曲線(xiàn)。

2.7Cox回歸模型分析MM患者預(yù)后的影響因素 Cox回歸分析結(jié)果顯示，ISS分期為Ⅱ、Ⅲ期，分化程度為中、高分化，B7H3≥3.52及c-Cbl≤0.73是影響MM患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表7。

表7 Cox回歸模型分析MM患者預(yù)后的影響因素

3 討 論

據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)MM發(fā)病率為3/100 000，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中位居第二位[1]。盡管烷基化劑、腸溶酶制劑及蛋白酶體抑制劑等新型治療方案在一定程度上延長(zhǎng)了患者的生存時(shí)間，但MM仍無(wú)法完全治愈[1]。因此，尋找合適的指標(biāo)早期評(píng)估MM患者的預(yù)后情況，對(duì)臨床進(jìn)行針對(duì)性治療至關(guān)重要。

B7H3基因編碼的B7H3蛋白屬于Ⅰ型跨膜蛋白，主要位于抗原遞呈細(xì)胞、T細(xì)胞及靶細(xì)胞內(nèi)，包含兩種同分異構(gòu)體，在輔助免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。B7H3通過(guò)共刺激信號(hào)，輔助免疫細(xì)胞識(shí)別抗原，同時(shí)增強(qiáng)T細(xì)胞的黏附能力，加強(qiáng)抗原遞呈作用[2]?；A(chǔ)研究表明，在B7H3基因表達(dá)沉默的癌細(xì)胞內(nèi)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9和轉(zhuǎn)錄激活因子3等轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄合成水平明顯下降，使癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力降低[9]。AHMED等[10]研究證實(shí)，小分子抑制劑通過(guò)結(jié)合B7H3中的FG 環(huán)結(jié)構(gòu)域，使免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的配體-受體相互作用減弱，從而恢復(fù)免疫細(xì)胞原有的效應(yīng)器功能。本研究結(jié)果表明，MM組血清B7H3表達(dá)水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示B7H3可能在MM發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮一定作用。其原因可能為MM患者骨髓微環(huán)境的改變誘導(dǎo)B7H3啟動(dòng)子的活化，復(fù)制轉(zhuǎn)錄合成B7H3并釋放入血，使血清B7H3表達(dá)水平升高[9]。本研究結(jié)果表明， 不同分化程度和ISS分期MM患者血清B7H3表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示B7H3可能在MM進(jìn)展過(guò)程中具有促進(jìn)作用。其機(jī)制可能是B7H3能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1和核因子κB，抑制T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)錄，從而抑制T細(xì)胞啟動(dòng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，使癌細(xì)胞在血液中快速克隆增殖[11]。此外，B7H3過(guò)表達(dá)能夠抑制E-鈣粘連蛋白的轉(zhuǎn)錄合成，同時(shí)增強(qiáng)癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，有利于癌細(xì)胞侵襲至其他器官[12]。

c-Cbl基因?qū)儆贑BL家族，其全長(zhǎng)約為11 242 bp，僅存在一種剪切方式，主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在造血組織中廣泛表達(dá)[3]。c-Cbl主要包含TKB結(jié)構(gòu)域和RF結(jié)構(gòu)域，具有調(diào)節(jié)泛素連接酶活性和結(jié)合磷酸酪氨酸殘基的功能[13]。RASHID等[4]通過(guò)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，急性髓系白血病(AML)患者c-Cbl基因的RF結(jié)構(gòu)域中的谷氨酸錯(cuò)義突變?yōu)楦拾彼?，c-Cbl外顯子處存在多處突變位點(diǎn)是AML發(fā)病的遺傳易感因素。有研究表明，c-Cbl能夠結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸殘基位點(diǎn)，經(jīng)磷酸化使其形成非對(duì)稱(chēng)聚合物，最終通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)完成泛素化過(guò)程，使癌細(xì)胞的增殖速度降低[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MM組血清c-Cbl表達(dá)水平較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示c-Cbl可能在MM發(fā)病的某個(gè)環(huán)節(jié)具有調(diào)控作用。其原因可能是MM患者血清c-Cbl基因發(fā)生甲基化，使c-Cbl沉默，無(wú)法進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致血清c-Cbl表達(dá)水平下降[13]。本研究結(jié)果表明，不同分化程度和ISS分期MM患者血清c-Cbl表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示c-Cbl可能參與MM進(jìn)展的調(diào)控。其原因可能是c-Cbl表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2與干細(xì)胞因子(SCF)受體結(jié)合，使SCF受體泛素化，誘導(dǎo)干細(xì)胞無(wú)限單克隆分裂增殖，促進(jìn)MM進(jìn)展[14]。此外，c-Cbl沉默能夠誘導(dǎo)FMS樣酪氨酸激酶3磷酸化，激活其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖及分化，并抑制機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，使MM易于免疫逃避，同時(shí)增強(qiáng)其侵襲能力[15]。

本研究結(jié)果顯示，MM患者血清B7H3表達(dá)水平與c-Cbl表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示B7H3和c-Cbl在MM的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能具有一定聯(lián)系。上述結(jié)果的具體機(jī)制目前尚不清楚，但可能與c-Cbl通過(guò)氧化還原反應(yīng)使自身磷酸化，激活蛋白激酶B信號(hào)通路，通過(guò)正反饋?zhàn)饔茫T導(dǎo)B7H3上調(diào)有關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示，B7H3高表達(dá)組治療有效率較B7H3低表達(dá)組降低，而c-Cbl高表達(dá)組治療有效率較c-Cbl低表達(dá)組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示B7H3高表達(dá)和c-Cbl低表達(dá)能夠促進(jìn)MM的演化，降低治療有效率。其原因可能是B7H3高表達(dá)能夠使其受體髓樣細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2 失活，抑制CD8和CD4合成，降低機(jī)體中CD8+和CD4+T細(xì)胞的比例，減弱機(jī)體的免疫能力，促進(jìn)MM的進(jìn)展，降低藥物治療的有效率[16]。磷酸化的c-Cbl通過(guò)其酪氨酸殘基結(jié)合磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的SH2 結(jié)構(gòu)域，激活PI3K信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖分裂，降低治療有效率[8,15]。Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，B7H3水平升高和c-Cbl水平降低時(shí)MM患者生存率更低，提示B7H3和c-Cbl表達(dá)水平可能影響MM患者的預(yù)后生存周期。Cox回歸分析進(jìn)一步證明， B7H3及c-Cbl表達(dá)水平可能是預(yù)測(cè)MM患者預(yù)后生存時(shí)間的潛在標(biāo)志物。

綜上所述，MM患者血清B7H3水平升高，而c-Cbl水平降低，且均與分化程度和ISS分期有關(guān)。血清B7H3表達(dá)水平與c-Cbl表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。B7H3水平升高和c-Cbl水平降低時(shí)，不僅降低了MM患者的治療有效率，更降低了患者的生存率，這對(duì)臨床進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)治療具有重要指導(dǎo)意義。但受本研究條件的限制，血清B7H3和c-Cbl水平變化的具體機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。