楊紅梅，鄒 昕#，虞 茜，許 飛，徐 立△

1.江蘇省常州市中心血站,江蘇常州 213000,2.江蘇省常州市臨床輸血重點?？茖嶒炇?江蘇常州 213000

ABO血型系統(tǒng)是最早被發(fā)現(xiàn)的人類血型系統(tǒng)，其基因位于第9號染色體，同時也是最重要的一個血型系統(tǒng)，在臨床輸血、移植醫(yī)學和產(chǎn)前診斷中具有重要意義。在日常ABO血型鑒定工作中，常常會碰到正反定型不一致，在排除人為操作因素外，不規(guī)則抗體和亞型往往是研究者考慮的方向[1-3]。本實驗室在ABO血型鑒定過程中發(fā)現(xiàn)1例正反定型不符標本，該標本血型血清學無法判斷其血型，借助不規(guī)則抗體篩查、吸收放散試驗、凝集抑制試驗、酶處理試驗、不同溫度效價試驗、溶血率監(jiān)測等檢測手段，并結合聚合酶鏈反應-序列特異性引物(PCR-SSP)基因分型和ABO基因第6、7外顯子擴增產(chǎn)物基因測序，最后確定其血型為A101型。該病例為A型罕見的產(chǎn)生了類抗-A1抗體，目前國內(nèi)少見其相關報道。

1 資料與方法

1.1一般資料 常某某，男，74歲，江蘇常州人，漢族，2021年3月3日因肩骨疼痛入住常州市中醫(yī)醫(yī)院，術前常規(guī)備血過程中發(fā)現(xiàn)其鑒定正定型為A型，反定型為O型，正反定型不符，于當天送常州市中心血站輸血研究室進行血型鑒定。

1.2儀器與試劑 抗-A/B單克隆抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，批號：20200609)、抗-D(IgM)單克隆抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，批號：20200301101)、抗-H抗體(德國CE公司，批號：OHM142)、抗-AB抗體(德國CE公司，批號：OABM083)、抗-A1抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，批號：20200522)、ABO血型反定型紅細胞(北京金豪制藥股份有限公司，批號：2021101001)、人源抗-A/B單克隆抗體(自制)、血型分析液(上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，批號：20216201)、血型試劑質(zhì)控試劑盒(上海申型醫(yī)學科技有限公司，批號：20227202)、抗-Lea和抗-Leb抗體(德國CE公司，批號：OLeaM121-1和OLebM110-1)、抗體篩選細胞(匈牙利REAGENS公司,批號：702013)、微量游離血紅蛋白(FHb)檢測試劑盒(QuantiChrom公司，批號：210114)、ABO-PCR-SSP基因分型試劑盒(天津市秀鵬生物技術開發(fā)有限公司，批號：K202008006)、DNA提取試劑(美國Invitrogen公司，批號：15101)、瓊脂糖(北京沃森生物科技有限公司，批號：181650)、溴化乙錠(10 mg/mL，青島捷世康生物科技有限公司)。美國AB公司9700型PCR擴增儀、DNA濃度測定儀、凝膠成像系統(tǒng)、美國貝克曼庫爾特的高速離心機、日本久保田的KA-2200型血清學專用離心機。37 ℃恒溫水浴箱、湖南盧湘儀的TD4低速自動平衡離心機、北京瑞爾達生物科技有限公司的F4040半自動生化分析儀。

1.3血清學檢測 采用試管法進行ABO正反定型試驗。取B型獻血者、O型獻血者和患者紅細胞少許，生理鹽水洗滌3次，配制成2%紅細胞懸液進行抗-H、抗-A1和抗-AB試驗，離心判讀凝集強度；同時對該標本進行抗體篩查。所有試驗均嚴格按照《AABB技術手冊(第18版)》[4]和文獻[5]的方法及試劑操作說明書進行。

1.4PCR-SSP基因組DNA提取及ABO基因擴增、圖譜比對分析 采用Invitrogen公司DNA提取試劑盒提取患者外周血基因組DNA，調(diào)整DNA模板濃度為30～35 ng/μL，A260/A280為1.60～1.80，根據(jù)人類ABO血型基因檢測試劑盒說明書設置參數(shù)進行PCR擴增；取擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)進行分析，并與天津市秀鵬生物技術開發(fā)有限公司提供的圖譜比對分析結果。

1.5ABO基因測序分析和序列比對 ABO基因第6、7外顯子擴增片段大小約為2 019 bp，擴增反應體系根據(jù)天津市秀鵬生物技術開發(fā)有限公司試劑盒說明書進行，采用引物：上游5′-CCTGCCAGCTCCATGTGAC-3′；下游：5′-CAGGACGGACAAAGGA-3′。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后并測序，該試驗部分在天津市秀鵬生物技術開發(fā)有限公司完成。第6外顯子測序引物為上游：5′-CATGTGGGTGGCACCCTGCC-3′；下游：5′-ATGTCCACAGTCACTCGCCA-3′。第7外顯子測序引物為上游：5′-GCTCCCCCAGCCCCCGTCCG-3′；下游：5′-GTTTACCCGTTCTGCTAA-3′。

2 結 果

2.1血型血清學檢測結果 采用試管法對標本進行ABO血型血清學檢測，正定型與抗-A凝集強度可達4+，與抗-B不反應。反定型患者血漿與A細胞(Ac)、B細胞(Bc)呈強凝集，與O細胞(Oc)和自身細胞(自身c)均不反應。進一步試驗發(fā)現(xiàn)，H抗原表達強度很弱，與正常Bc幾乎一致(正常O型抗-H凝集強度3+，正常B型抗-H凝集強度1+w/±)，與抗-A1、抗-AB呈4+凝集，排除A2亞型。為排除冷性不規(guī)則抗-A抗體，將反定型試管離心于37 ℃孵育15 min后再看結果，與Ac和Bc仍有凝集。為進一步鑒定是否存在同種抗體干擾血型，進行了抗篩試驗，結果在鹽水、凝聚胺、抗人球蛋白3種介質(zhì)中均無凝聚、無溶血。以上試驗排除了亞型、冷抗體及同種抗體等多因素干擾。

2.2試劑抗體或抗保養(yǎng)液抗體判斷 將反定型試劑細胞經(jīng)生理鹽水洗滌3次后配成2%左右紅細胞懸液(此時無保養(yǎng)液)進行血型血清學檢測發(fā)現(xiàn)反定型Ac呈陰性，但換成血型稀釋液即保養(yǎng)液后反定型Ac呈陽性(有無添加保養(yǎng)液對Oc和自身c均無影響)，見表1。

表1 患者血型血清學檢測結果

2.3多細胞凝集判斷 多凝集紅細胞抗原是由于各種原因產(chǎn)生膜抗原暴露，從而導致多細胞凝集現(xiàn)象，這與臨床疾病、人體免疫機制及紅細胞免疫有關。為驗證是否為多細胞凝集，整個試驗過程參考《AABB技術手冊(第18版)》進行，結果見表2。如果為多細胞凝集，則用酶處理患者細胞A抗原強度大大減弱，而正常A型紅細胞A抗原強度不會減弱，患者紅細胞經(jīng)木瓜酶處理后A抗原強度并沒有減弱，排除Tn多細胞凝集現(xiàn)象，說明正定型為A型。根據(jù)試驗結果，排除多細胞凝集干擾。

表2 Tn多細胞凝集試驗結果

2.4吸收放散試驗 第1組取0.3 mL患者壓積紅細胞(Pc)與0.3 mL等量生理鹽水56 ℃放散10 min；第2組取0.3 mL A型混合Pc加0.3 mL患者血清4 ℃吸收1 h即刻離心，冷鹽水洗滌6次，加等量生理鹽水56 ℃放散10 min；第3組取0.3 mL A型混合Pc加0.3 mL患者血清及2滴血型稀釋液(保養(yǎng)液)4 ℃吸收1 h即刻離心，冷鹽水洗滌6次，加等量生理鹽水56 ℃放散10 min。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，第2組吸收后血漿呈溶血狀態(tài)，即促發(fā)溶血反應并且A型紅細胞在無保養(yǎng)液的情況下未能吸收抗-A抗體，所以吸收后血漿抗-A呈陽性而放散試驗呈陰性。而第3組加血型稀釋液(保養(yǎng)液)后抗-A能很好地被A細胞吸附，經(jīng)56 ℃也能很好地放散下來，見表3。

表3 吸收放散試驗結果

2.5不同抗凝劑的溶血率監(jiān)測分析 在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，不同顏色的標本管溶血程度完全不同，紫管第2天出現(xiàn)了肉眼可見的溶血現(xiàn)象。連續(xù)10 d監(jiān)測3種試管中血漿或血清FHb水平，結果見表4、圖1。其中紫管抗凝劑為乙二胺四乙酸，綠管抗凝劑為枸櫞酸鈉，紅管無抗凝劑。紫管與紅管、綠管FHb水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 3種試管連續(xù)監(jiān)測10 d FHb水平比較

注：與紫管比較，*P<0.05。

表4 3種試管中FHb水平比較(g/L)

2.6不同介質(zhì)中Ac重懸液的抗體效價測定 取380 μL血清加20 μL質(zhì)控液，加400 μL 2-Me混合于37 ℃水浴箱中破壞30 min，離心后取4滴破壞液和1滴Ac混合離心結果為陰性，說明破壞完全且該抗體為IgM型抗體。采用倍比稀釋測定IgM抗體效價，結果見表5。結果顯示，未加保養(yǎng)液的Ac和該抗體無凝集反應，加保養(yǎng)液后效價達到16，至少增強4管。

表5 不同介質(zhì)中Ac重懸液的抗體效價測定

2.7唾液試驗 收集患者唾液離心后用玻璃管煮沸10 min再次離心，取上清液備用。同時將抗-A、抗-B、抗-H稀釋調(diào)整到2+的凝集強度，標好試管，先加抗-A、抗-B、抗-H 100 μL到試管中，陰性對照管加100 μL生理鹽水，測試管加100 μL唾液，離心混勻置4 ℃ 1 h后加0.8%Ac、Bc和Oc，置4 ℃ 30 min，結果唾液中檢測到A物質(zhì)和H物質(zhì)。進一步對患者紅細胞Lewis系統(tǒng)抗原進行測定，表現(xiàn)型為Le(a-b+)，結合結果該患者為A型分泌型，說明該患者反定型抗體并非抗-ALeb抗體。

2.8ABO-PCR-SSP及基因測序 經(jīng)ABO-PCR-SSP及第6、7外顯子測序，以A101作為測序標準序列，患者第6、7外顯子未見堿基替換和氨基酸替換，表現(xiàn)型為A1，基因測序為ABO*A1.01，見表6。

表6 患者ABO血型第6、7外顯子核苷酸序列結果

3 討 論

類同種抗體指類似于同種抗體性質(zhì)的自身抗體，但不同于自身抗體。比如RhD(+)患者血漿中有類同種抗-D，該患者血漿中抗-D與其他所有人的RhD(+)紅細胞均反應，但與自身紅細胞不反應，這應該是同種抗體，但又和同種抗體不一樣，所以將這樣的抗體定義為“類同種抗體”。抗-A1有類同種抗-A1抗體，這種抗體除了不與自身紅細胞反應外，能凝集所有A1細胞，與疾病、免疫應答和抗體三維結構改變有關[6]?？?A1還可能受Rh相關糖蛋白的影響，有文獻報道了1例很獨特的抗-A1，它只凝集A型RhD+細胞，而且這例抗-A1與A1D+細胞反應強于A2D+細胞，同時這例抗-A1不與A1D-細胞反應，也不與O型D+細胞反應[6-7]。被認為是Rh相關蛋白影響了A1細胞在不同RhD(+/-)時與抗-A1的反應情況，可能是因為膜外抗原三維構象改變所致[8]。而抗-A1有類同種抗體，類同種抗-A1抗體可存在于A1型人血漿中，但與自身A1型紅細胞不反應，可與其他人A1型紅細胞反應，這種類同種抗-A1抗體在理論上屬于自身抗體，但其分子生物學結構目前還缺少研究報道。

本病例在鑒定其血型過程中，排除了亞型、冷抗體及同種抗體等多因素的干擾，進一步考慮是否為試劑抗體或者抗保養(yǎng)液抗體導致血型不一致，或存在Tn多細胞凝集或異體抗-A抗體還是抗-ALeb抗體或抗-HA抗體或類抗-A1抗體等多因素，并通過相關血型血清學技術手段一一驗證。在試劑抗體或者抗保養(yǎng)液抗體試驗過程中發(fā)現(xiàn)，患者血漿中存在一種和A抗原特異性反應的抗-A抗體，該抗體可以被紅細胞保養(yǎng)液增強，但也很容易被生理鹽水洗脫，且親和力不強。而抗保養(yǎng)液抗體一般反定型Ac、Bc、Oc都凝集(室溫鹽水弱凝集)、與自身c不反應、直接抗人球蛋白試驗陰性、無冷抗體特性及能排除類同種抗體等特點，排除了并非為抗保養(yǎng)液抗體引起的正反定型血型不一致。同時，隨機挑取3位健康A型獻血者和3位健康O型獻血者與本研究的患者進行交叉配血試驗，本研究的患者血清與3位健康A型獻血者用生理鹽水配置的2%紅細胞懸液在鹽水和抗人球蛋白卡中均為陰性，而凝聚胺為陽性，這種情況通常發(fā)生在弱冷抗體情況下，但弱冷抗體被保養(yǎng)液明顯增強的案例少見報道。本研究的患者血清與3位健康O型獻血者用生理鹽水配置的2%紅細胞懸液配血在3種介質(zhì)中均無凝集、無溶血。

總之，ABO血型鑒定極其重要，若存在正反定型不一致時，非常有必要采用血型血清學和分子生物學相結合的方法進行檢測，以確保臨床輸血安全。