蔡思學(xué)，李月，王 芳，姜澤東，王 力

（1 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院 福建泉州 362000 2 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建廈門 361021）

紅毛藻是一種獨特的可食用經(jīng)濟海藻，主要分布在北大西洋亞熱帶海區(qū)和溫帶海區(qū)以及北太平洋的西部和我國福建省等東南沿海地區(qū)，其味道鮮美，風(fēng)味獨特，含有大量不飽和脂肪酸，18 種氨基酸，豐富的膳食纖維和Ca、Mg、K 等豐富的營養(yǎng)元素[1-2]，并富含多糖、多酚和藻膽蛋白等多種生物活性物質(zhì)。據(jù)報道紅毛藻具有抗病毒[3]，抑制黑色素形成[4]，抑菌[5]，可以降低心血管疾病和慢性代謝疾病的風(fēng)險[6]等作用。

藻紅蛋白（PE）屬于藻膽蛋白的一種，是由藻紅膽素（PEB）的吡咯環(huán)與脫輔基蛋白的半胱氨酸通過硫醚鍵結(jié)合而成的具有熒光特性的蛋白[7]，在紅藻和藍(lán)藻中均存在，具有R-、B-、C-3 種類型，其中R-藻紅蛋白主要由紅毛藻產(chǎn)生，其含量是紫菜中含量的4～5 倍[8]。因R-藻紅蛋白具有光學(xué)和光譜特性，高吸收系數(shù)和高熒光產(chǎn)率等特性而被視為熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析[9]、免疫分析、流式細(xì)胞術(shù)[10]和組織化學(xué)等生物技術(shù)應(yīng)用中不可替代[11]。

隨著工業(yè)的發(fā)展，重金屬污染變得越發(fā)嚴(yán)重，由于重金屬離子是不可生物降解的，即便是痕量也具有高毒性，并且重金屬離子能在生物體內(nèi)富集，威脅生態(tài)系統(tǒng)和人體健康，因此重金屬離子污染已成為全世界矚目的問題[12-13]。Cu2+是人體中含量第三高的過渡金屬[14]，是動植物必需的微量元素，然而，它在高濃度下會對人體產(chǎn)生諸多不良影響，如導(dǎo)致肝硬化、腎損傷和阿爾茨海默病等[15-16]。迫切需要檢測Cu2+含量的方法。目前檢測Cu2+的方法主要有化學(xué)傳感器法[17]、比色法[18-19]、電化學(xué)發(fā)光傳感器法[20]、熒光探針法等，然而R-藻紅蛋白作為熒光探針檢測Cu2+含量鮮見報道。本文從紅毛藻中提取純化藻紅蛋白，以其為熒光探針，Cu2+為猝滅劑，建立一種Cu2+含量的檢測方法。

1 材料與設(shè)備

紅毛藻，福建省莆田市南日鎮(zhèn)人工養(yǎng)殖產(chǎn)品；纖維素酶 （20 000 U/g），諾維信生物有限公司；SDS-PAGE 標(biāo)準(zhǔn)蛋白，立陶宛Fermentas 公司；硫酸銨、五水硫酸銅，國藥化學(xué)試劑有限公司；DEAE Sepharose FF，瑞典GE Healthcare 公司；過硫酸銨（APS）、30%丙烯酰胺，上海Sigma-Aldrich 公司；明蝦、蛤蜊和金鯧魚，均購于當(dāng)?shù)卮鬂櫚l(fā)超市。

Agilent Cary Eclipse 熒光分光光度計，美國Agilent 公司；Nanodrop 1000 微量蛋白核酸測定儀，美國熱電Thermo 賽默飛世爾公司；LAMBDA 265 紫外-可見光分光光度計，上海PerkinElmenr儀器有限公司；Bio.Profile 凝膠成像及分析系統(tǒng)，法國VIbler Lourmant 公司；TS-2 脫色搖床，海門其林貝爾儀器制造有限公司。

2 試驗方法

2.1 紅毛藻R-藻紅蛋白的提取

因R-藻紅蛋白提取物在紫外吸收波長455，565 和592 nm 處有特征吸光值[21]。利用纖維素酶法[22]，稱取1.0 g 紅毛藻藻粉于100 mL 離心管中，加入20 mL 蒸餾水，后加入一定量的纖維素酶，混合均勻，于恒溫水浴鍋中酶解破壁，酶解結(jié)束后取出冷卻，置于高速離心機中8 000 r/min，離心15 min，取上清液，通過紫外-可見分光光度計測定藻紅蛋白濃度。并且利用正交優(yōu)化試驗確定酶解溫度 （20，25，30，35，40 ℃），酶解時間（2，3，4，5，6 h），加酶量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%）作為纖維素酶解破壁的最優(yōu)條件。

2.2 紅毛藻R-藻紅蛋白的純化

為得到純度較高的藻紅蛋白，利用兩步純化法對紅毛藻R-藻紅蛋白進(jìn)行純化。首先利用硫酸銨分級沉降粗紅毛藻R-藻紅蛋白，在攪拌條件下緩慢向酶解后的藻紅蛋白上清液加入經(jīng)研磨后的硫酸銨至其飽和度為20%，4 ℃靜置過夜，然后于高速離心機中 （8 000 r/min，15 min） 離心，保留20%鹽析沉淀。取其分離出的上清液，同樣按照上述方法向溶液中加硫酸銨至溶液的飽和度達(dá)30%，4 ℃靜置過夜，離心分離上清和沉淀。重復(fù)上述操作步驟，使溶液中硫酸銨的飽和度達(dá)20%，30%，40%，50%，60%，70%。將各飽和度硫酸銨的沉降物分別溶解于0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6.8）中，后轉(zhuǎn)移至截留分子質(zhì)量10 ku 的透析袋中，全程避光，4 ℃條件下透析脫鹽，每3 h 換1 次外液，并用電導(dǎo)儀檢驗是否透析完成。

利用DEAE Sepharose FF 二次純化R-藻紅蛋白，用AKTA 蛋白純化系統(tǒng)將透析后的R-藻紅蛋白液泵入已平衡后的DEAE Sepharose FF 層析柱中，用0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6.8）沖柱，洗去未吸附的藻紅蛋白及雜質(zhì)。待基線平衡后，使用含0.1 mol/L NaCl～0.6 mol/L NaCl 的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，線性洗脫并收集流出液，待洗脫平衡時，收集的每管流出液測定其在A565和A280的紫外吸收波長，并繪制洗脫曲線，流出液于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 紅毛藻R-藻紅蛋白的鑒定

通過測定R-藻紅蛋白在波長200～800 nm 范圍內(nèi)的紫外吸收值；測定狹縫寬度為5.0 nm，掃描200～800 nm 范圍內(nèi)R-藻紅蛋白的熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜；根據(jù)參考文獻(xiàn)[23-24]配置SDSPAGE 電泳凝膠所需溶液并測定R-藻紅蛋白分子質(zhì)量以對R-藻紅蛋白進(jìn)行鑒定。

2.4 R-藻紅蛋白對水產(chǎn)品中Cu2+含量的檢測

2.4.1 熒光探針檢測條件的優(yōu)化 分別取不同pH 值（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0）緩沖液配制不同濃度（0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mg/mL）R-藻紅蛋白2 mL 及1 mL 濃度為1.0 μmol/L Cu2+加入10 mL 離心管中，混勻，分別于不同溫度（20，25，30，35，40，45 ℃）下反應(yīng)一定時間，用熒光分光光度計檢測熒光強度的變化，以加1 mL 超純水的R-藻紅蛋白液為對照組，熒光強度記F0，加入1.0 μmol/L Cu2+的R-藻紅蛋白為試驗組，熒光強度記F，計算相對熒光強度（F0/F），研究pH、R-藻紅蛋白濃度和溫度對Cu2+檢測效果的影響。后在R-藻紅蛋白質(zhì)量濃度1.2 mg/mL，Cu2+濃度1.0 μmol/L，50 mmol/L PBS 緩沖液（pH 7.0）的條件下，以不加Cu2+的R-藻紅蛋白熒光探針作為空白對照，用熒光分光光度計檢測體系中每隔1 min 的熒光強度變化，研究檢測時間對Cu2+檢測效果的影響。

2.4.2 金屬干擾離子共存對Cu2+檢測效果的影響在2 mL 1.2 mg/mL R-藻紅蛋白中分別加入不同的干擾離子（K+、Na+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Fe2+、Pb2+、Al3、Ca2+）和Cu2+，按照2.4.1 節(jié)的方法進(jìn)行反應(yīng)，計算相對熒光強度（F0/F）的大小，研究對干擾離子存在的情況下R-藻紅蛋白熒光探針對Cu2+檢測效果的影響。

2.4.3 Cu2+對R-藻紅蛋白的熒光淬滅 在優(yōu)化條件下，測定加入不同濃度（0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，10，15，20，25，30，35，40，45，50 μmol/L）的Cu2+后R-藻紅蛋白熒光探針檢測體系的熒光強度（F），以不加Cu2+的R-藻紅蛋白熒光強度（F0）作為空白對照，計算相對熒光強度（F0/F）。以Cu2+濃度為X 軸，相對熒光強度（F0/F）為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 樣品檢測

首先進(jìn)行樣品的預(yù)處理，取金鯧魚、蛤蜊的可食用部位，明蝦的蝦頭和蝦體，分別用蒸餾水洗凈并瀝干，-40 ℃冰箱預(yù)冷凍，轉(zhuǎn)移至凍干機中冷凍干燥，粉碎過篩。后將樣品粉末按照國標(biāo)[25]進(jìn)行前處理，并將所得樣品消解液稀釋15 倍，置于4 ℃冰箱冷藏備用。按照2.4.1 節(jié)中的方法進(jìn)行樣品中Cu2+含量的檢測。

2.6 數(shù)據(jù)處理

使用正交設(shè)計助手、SPSS Statistics 17.0、Microsoft Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用Origin Pro 8.5 軟件繪制圖形與分析。所有試驗均平行測定3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 纖維素酶解法提取紅毛藻R-藻紅蛋白

通過正交試驗以酶解溫度（℃）、酶解時間（h）、酶添加量（%）為因素，溶解破壁后R-藻紅蛋白濃度為指標(biāo)，優(yōu)化R-藻紅蛋白的提取工藝。影響順序為酶解溫度＞酶解時間＞加酶量，其中酶解溫度的影響最為顯著，但是溫度不可超過40 ℃否則R-藻紅蛋白將不穩(wěn)定分解[26]，酶解時間為5 h最優(yōu)，加酶量不顯著，原因可能是酶活性高，作用性強。因此纖維素酶酶解破壁的最優(yōu)條件為：提取溫度40 ℃，提取時間5 h，加酶量為紅毛藻藻粉的2.5%，此時提取的R-藻紅蛋白質(zhì)量濃度為43.64 mg/mL。

3.2 R-藻紅蛋白的純化

硫酸銨飽和度對R-藻紅蛋白純化效果的影響如圖1所示，硫酸銨的飽和度在10%～70%區(qū)間時，隨硫酸銨飽和度的遞增，R-藻紅蛋白的得率和純度均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)40%～50%時，R-藻紅蛋白的得率達(dá)到最大，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)50%～60%時，R-藻紅蛋白的純度達(dá)到最大。為保證得到較高純度和得率的R-藻紅蛋白，試驗選取飽和度為60%的硫酸銨。

圖1 R-藻紅蛋白鹽析曲線Fig.1 Salting out curve of R-phycoerythrin

對初步純化的R-藻紅蛋白液通過DEAE Sepharose FF 柱層析進(jìn)行進(jìn)一步純化處理，如圖2所示，R-藻紅蛋白的洗脫曲線出現(xiàn)3 個組分，通過測定各個洗脫峰中R-藻紅蛋白在565 nm 與280 nm 處的紫外吸收值并計算其比值，可知a、c位置的R-藻紅蛋白純度低，洗脫過程首先流出的是組分a，其中包含未被吸附的R-藻紅蛋白和雜質(zhì)蛋白，組分c 在650 nm 處出現(xiàn)紫外吸收峰，此處是個別藻藍(lán)蛋白的吸收峰，說明已有雜質(zhì)被洗脫下來。組分b 處液體顏色較深，R-藻紅蛋白純度較高，R-藻紅蛋白較集中，說明通過兩道純化已達(dá)到提高R-藻紅蛋白純度的目的。

圖2 DEAE Sepharose FF 層析柱的洗脫組分的紫外圖譜Fig.2 Spectrum of DEAE Sepharose FF chromatographic eluent

3.3 R-藻紅蛋白的鑒定及表征

R-藻紅蛋白紫外可見-吸收光譜由圖2b 可知，R-藻紅蛋白在498 nm 和565 nm 處有雙峰，并在540 nm 處有一個肩峰，而620 nm 處顯示的吸收峰可能是混有極少量的R-藻藍(lán)蛋白所致。由純度計算公式（純度=A565/A280）可知，純化所得R-藻紅蛋白純度為2.1，而當(dāng)R-藻紅蛋白純度在0.7以下時，R-藻紅蛋白屬于食品級，純度為0.7～3.9屬于藥品級，超過4.0 屬于分析級[27]，因此本試驗得到的R-藻紅蛋白已達(dá)到藥品級，純度較高。

R-藻紅蛋白熒光光譜如圖3a 所示，R-藻紅蛋白的最大發(fā)射波長位于574 nm 處，這是由于PUB 到PEB 發(fā)色團的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）[28]，與文獻(xiàn)[29-30]基本一致。R-藻紅蛋白分子質(zhì)量如圖3b SDS-PAGE 電泳圖所示，標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker作為對照，R-藻紅蛋白條帶在分子質(zhì)量約為17.0，19.0，27.0 ku 左右出現(xiàn)3 條清晰的條帶，分別對應(yīng)R-藻紅蛋白的α、β、γ 3 個亞基。

圖3 R-藻紅蛋白的鑒定及表征Fig.3 Identification and characterization of R-phycoerythrin

3.4 R-藻紅蛋白對水產(chǎn)品中Cu2+含量的檢測

3.4.1 R-藻紅蛋白熒光探針檢測條件的優(yōu)化 pH 值對Cu2+檢測效果的影響如圖4a 所示，溶液pH 值在5.0～11 區(qū)間，隨著pH 值的升高，相對熒光強度逐漸增大，當(dāng)pH 值達(dá)到7.0 時，其相對熒光值最大，之后隨pH 值的升高其相對熒光強度又逐漸減弱。說明Cu2+在pH 值為7.0 時對R-藻紅蛋白的熒光猝滅程度最大，此時對Cu2+的檢測效果最好。這是由于R-藻紅蛋白的穩(wěn)定性是通過其六聚體結(jié)構(gòu)來維持的，當(dāng)溶劑pH 值發(fā)生變化時，可能會導(dǎo)致靜電性質(zhì)和蛋白質(zhì)締合過程中所涉及的氫鍵受到干擾，導(dǎo)致發(fā)色團的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致R-藻紅蛋白的熒光強度降低[31]，在堿性環(huán)境中這種影響更為顯著[32-33]，因此選擇pH=7.0 進(jìn)行接下來的試驗。

R-藻紅蛋白濃度對Cu2+檢測效果的影響如圖4b 所示，在0.4～1.6 mg/mL 的R-藻紅蛋白濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)0/F 隨R-藻紅蛋白濃度的增加而增大，到1.2 mg/mL 時熒光強度達(dá)到最大，之后便逐漸降低，后繼續(xù)增大蛋白濃度F0/F 又有上升趨勢，但仍低于1.2 mg/mL 時的相對熒光強度，這是由于R-藻紅蛋白濃度達(dá)到一定程度時，體系中Cu2+含量不足以較好的猝滅R-藻紅蛋白。因此，選擇1.2 mg/mL 的R-藻紅蛋白作為檢測Cu2+的最佳濃度。

溫度對Cu2+檢測效果的影響如圖4c 所示，水浴溫度在20～35 ℃時，F(xiàn)0/F 增減幅度并不顯著，此時溫度對反應(yīng)體系的影響不大，但在30 ℃時F0/F達(dá)到最大。繼續(xù)提高水浴溫度，可以看到F0/F 迅速持續(xù)上升，但這是由于R-藻紅蛋白活性受溫度影響較大，高溫使R-藻紅蛋白中的α-螺旋數(shù)量減少，自發(fā)解開或失去構(gòu)象而變得無功能，導(dǎo)致色素穩(wěn)定性的喪失，蛋白變性失活，導(dǎo)致熒光逐步減弱甚至消失所致[34]。因此，為保證R-藻紅蛋白具有較高的生物活性與較好的檢測效果，選擇30 ℃作為檢測Cu2+的最佳檢測溫度。

反應(yīng)時間對Cu2+檢測效果的影響如圖4d 所示，隨反應(yīng)時間的延長，相對熒光強度呈線性增加，當(dāng)反應(yīng)超過15 min 后，曲線的變化趨于平緩，此時說明Cu2+與R-藻紅蛋白作用達(dá)到平衡。為了保證R-藻紅蛋白與Cu2+進(jìn)行充分的相互作用，因此，體系的最佳反應(yīng)時間確定為15 min。

圖4 R-藻紅蛋白熒光探針檢測條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of detection conditions for R-phycoerythrin fluorescent probe

3.4.2 干擾離子對Cu2+檢測效果的影響 由表1可知，在相對誤差在低于5%的情況下，考察了9 種與食品成分相關(guān)的干擾離子對Cu2+檢測體系的影響，其中360 倍的Mg2+、270 倍的K+和Na+對R-藻紅蛋白熒光探針檢測Cu2+體系的熒光強度基本沒有影響；6 倍的Ca2+、1.2 倍的Ba2+和Zn2+對檢測體系的熒光強度影響不明顯；而Fe2+、Pb2+、Al3+對檢測體系的熒光強度影響較為明顯。因此，在實際檢測水產(chǎn)品的過程應(yīng)減少這些共存物質(zhì)對檢測體系的干擾和影響。

表1 金屬離子對R-PE 檢測Cu2+效果的影響Table 1 The effect of metal ions on the detection of Cu2+ by R-PE

3.4.3 R-藻紅蛋白熒光探針對Cu2+的檢測 由圖5a 可知，隨Cu2+濃度的增加，該體系在574 nm 處的熒光值不斷降低。圖5b 為相對熒光強度（F0/F） 和Cu2+濃度間建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，0.5～50 μmol/L 范圍內(nèi)，Cu2+濃度與F0/F 呈良好的線性關(guān)系。低濃度范圍（0.5～5 μmol/L），F(xiàn)0/F=0.1855C+0.9575，R2=0.9961；高濃度范圍（5～50 μmol/L），F(xiàn)0/F=0.0765C+1.522，R2=0.9982，檢出限分別為0.06308 μmol/L 和0.1530 μmol/L。

圖5 R-藻紅蛋白熒光探針對Cu2+的檢測Fig.5 Detection of Cu2+ by R-phycoerythrin fluorescent probe

3.5 樣品檢測

為證實R-藻紅蛋白熒光探針在實際樣品中的適用性，將此方法應(yīng)用到實際水產(chǎn)品中Cu2+的檢測。如表2所示，R-藻紅蛋白熒光探針對于實際樣品中Cu2+的加標(biāo)回收率為94.50%～106.03%，且RSD 值均在3%以下。因此，此方法對于實際樣品的檢測具有良好的適用性，可用于檢測水產(chǎn)品中的Cu2+含量。

4 結(jié)論

利用纖維素酶解法提取紅毛藻藻紅蛋白，通過正交優(yōu)化試驗得出酶解溫度、酶解時間對紅毛藻藻紅蛋白提取效果影響較大，提取溫度為40℃，提取時間5 h，加酶量為紅毛藻藻粉的2.5%時提取R-藻紅蛋白質(zhì)量濃度為43.64 mg/mL。通過飽和度為60%硫酸銨、DEAE Sepharose FF 柱層析兩步純化法純化藻紅蛋白，得到純度為2.1（A620/A280） 的藥品級高純度R-藻紅蛋白，此時R-藻紅蛋白含有3 個亞基，α、β 和γ 亞基，分子質(zhì)量分別為17.0，19.0，27.0 ku。在最佳檢測條件R-藻紅蛋白質(zhì)量濃度1.2 mg/mL，水浴溫度30 ℃，反應(yīng)時間15 min，緩沖液pH 值7.0 時R-藻紅蛋白熒光探針對Cu2+檢測效果最好，在0.5～50 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，Cu2+與F0/F 具有良好的線性關(guān)系，低濃度時F0/F =0.1855C +0.9575 （0.5 μmol/L ～5 μmol/L，R2=0.9961）；高濃度Cu2+時F0/F=0.0765C+1.522（5 μmol/L～50 μmol/L，R2=0.9982），檢出限分別為0.06308 μmol/L 和0.1530 μmol/L。且該方法對實際樣品的檢測具有良好的適用性，回收率為94.50%～106.03%。因此R-藻紅蛋白熒光探針對水產(chǎn)品中Cu2+檢測方面具有潛在的應(yīng)用價值，為水產(chǎn)品中重金屬Cu2+檢測提供了一項新的方法。