倪興剛，鄧澤元，李 靜，揭琴豐，李露敏，王 杉*

（1 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330047 2 江西省疾病預(yù)防控制中心 南昌 330029）

葉酸是一類(lèi)人體必需的B 族維生素，在碳代謝、氨基酸代謝和細(xì)胞增殖生長(zhǎng)中起著重要作用[1-2]。葉酸缺乏會(huì)導(dǎo)致一些健康問(wèn)題，例如衰老過(guò)程中出現(xiàn)的認(rèn)知障礙可能與體內(nèi)低葉酸水平有關(guān)[3]，孕婦攝入的葉酸不足會(huì)導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)神經(jīng)管缺陷[4-5]和腭裂[6]，葉酸缺乏甚至還會(huì)導(dǎo)致一些癌癥的發(fā)生[7]。可見(jiàn)，補(bǔ)充葉酸對(duì)于人體健康是十分重要的，然而，天然食品中葉酸種類(lèi)多，含量低且不穩(wěn)定[8]，人體通過(guò)攝食天然食品獲取葉酸很有限。

L-5-甲基四氫葉酸鈣（calcium L-5-methyltetrahydrofolate，L-5-MTHF-Ca） 是一種可以代替葉酸的新型營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，與葉酸相比，L-5-MTHF-Ca 具有更穩(wěn)定且成本更低的優(yōu)勢(shì)[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，這兩種化合物在等摩爾劑量下具有相當(dāng)?shù)纳砘钚?、生物利用度和吸收率[10-12]，甚至在某些方面攝取L-5-MTHFCa 比攝取葉酸的效果可能會(huì)更好[13-14]。目前生產(chǎn)L-5-MTHF-Ca 的方法多為人工合成，也有人通過(guò)基因工程的方法生產(chǎn)L-5-甲基四氫葉酸[15-16]，然而，無(wú)論哪種方法，最終得到的產(chǎn)品中都會(huì)含有少量的D-5-甲基四氫葉酸鈣 （calcium D-5-methyltetrahydrofolate，D-5-MTHF-Ca），而對(duì)于D 型異構(gòu)體的安全性目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。建立一種可以對(duì)L-5-MTHF-Ca 進(jìn)行分離、定量的檢測(cè)方法意義重大。目前的檢測(cè)方法多為高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[17-19]，這類(lèi)檢測(cè)方法雖可以測(cè)定5-甲基四氫葉酸的含量，但無(wú)法檢測(cè)其中L-5-MTHF-Ca 的含量。針對(duì)這類(lèi)問(wèn)題，Gill 等[20]利用手性色譜法成功分離出RRR-α-生育酚。江鋒等[21]采用手性高效液相色譜法成功測(cè)出白酒中D-乳酸和L-乳酸的含量。黃曉婉等[22]應(yīng)用配位交換手性柱對(duì)L-硒-甲基硒代半胱氨酸進(jìn)行分離與測(cè)定。

本文應(yīng)用手性色譜法對(duì)L-5-MTHF-Ca 與其D 型異構(gòu)體進(jìn)行分離，并研究L-5-MTHF-Ca 的定量方法，同時(shí)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證的相關(guān)指標(biāo)測(cè)定，旨在為L(zhǎng)-5-MTHF-Ca 含量的測(cè)定提供一個(gè)高效、可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品（純度≥98.6%），Merck公司；D，L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品 （純度≥98.8%，L 型=49.8%），美國(guó)USP；乙腈 （純度≤100%），Merck 公司；磷酸二氫鈉（純度≥99.5%），天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉 （純度≥96.0%），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 Infinity II 型高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Agilent 公司；FA224 型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；CHIRALPAK HSA 手性色譜柱（4 mm×150 mm，5 μm），上海大賽璐藥物手性技術(shù)有限公司；PHS-3C 酸度計(jì)，鄭州寶晶電子科技有限公司；MV-100 型渦旋混勻儀，武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：CHIRALPAK HSA 手性色譜柱（4 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：按照磷酸二氫鈉緩沖溶液（稱(chēng)取4.54 g 磷酸二氫鈉，用水溶解定容至1 000 mL）：乙腈=90∶10（V/V）的比例混合，用32%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.8 后過(guò)濾脫氣；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)器：VWD 紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

1.3.2 L-5-MTHF-Ca 含量計(jì)算 根據(jù)試樣溶液的色譜峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到的L-5-MTHF-Ca 質(zhì)量分?jǐn)?shù)W，數(shù)值以%表示，計(jì)算公式如下：

式中：f （A）——通過(guò)將試樣溶液的色譜峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到的L-5-MTHF-Ca 的質(zhì)量，mg；m——樣品的質(zhì)量，mg。

1.3.3 專(zhuān)屬性檢測(cè) 準(zhǔn)確稱(chēng)取D，L-5-MTHF-Ca對(duì)照品5 mg 于25 mL 容量瓶中，用水定容后超聲溶解得到混標(biāo)溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)取L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品2.5 mg 于25 mL 容量瓶中，用水定容后超聲溶解得到單標(biāo)溶液。對(duì)這兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，確定各物質(zhì)保留時(shí)間與分離度。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg 的D，L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品，置于50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度后超聲溶解。準(zhǔn)確吸取0.6，1.2，1.8，3.0，5.0 mL 的上述溶液至5 mL 容量瓶中，用水定容至刻度后超聲溶解。色譜進(jìn)樣前用0.45 μm 孔徑的水相濾膜對(duì)樣液進(jìn)行過(guò)濾處理，進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖。以L-5-MTHF-Ca 的峰面積為縱坐標(biāo)Y，每次所進(jìn)樣液中L-5-MTHF-Ca 的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)X，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 定量限與檢出限的檢測(cè) 準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的D，L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品溶液，用水成比例依次稀釋得到一系列濃度梯度的待測(cè)溶液，將這些待測(cè)溶液依次進(jìn)樣，根據(jù)色譜圖中L型峰的信噪比S/N≥10 和S/N≥3 為依據(jù)，得到該色譜條件下L-5-MTHF-Ca 的定量限與檢出限。

1.3.6 精密度檢測(cè) 配制線性關(guān)系下質(zhì)量濃度為0.16 mg/mL 的D，L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，以L-5-MTHF-Ca 的百分含量計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.7 穩(wěn)定性檢測(cè) 配制線性關(guān)系下質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品溶液，分別在0，2，4，6，8，10 和12 min 時(shí)進(jìn)樣，以各時(shí)刻得到的色譜圖中L-5-MTHF-Ca 的峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.8 回收率檢測(cè) 配制加標(biāo)回收率檢測(cè)溶液，將1 mg 的D，L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品與0.75 mg 的L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品混合置于5 mL 容量瓶，用水溶解定容至刻度得到檢測(cè)溶液（1）；將1 mg 的D，L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品與1 mg 的L-5-MTHFCa 對(duì)照品混合置于5 mL 容量瓶，用水溶解定容至刻度得到檢測(cè)溶液 （2）；將1 mg 的D，L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品與1.25 mg 的L-5-MTHF-Ca 對(duì)照品混合后置于5 mL 容量瓶，用水溶解定容至刻度得到檢測(cè)溶液（3）；將1 mg 的D，L-5-MTHF-Ca對(duì)照品置于5 mL 容量瓶，用水溶解定容至刻度得到標(biāo)準(zhǔn)溶液。將檢測(cè)溶液的L 型峰面積減去標(biāo)準(zhǔn)

溶液的L 型峰面積后再代入線性回歸方程求得各檢測(cè)溶液的L 型物測(cè)定加入量，從而計(jì)算得到加標(biāo)回收率。

1.3.9 系統(tǒng)適用性檢測(cè) 配制0.2 mg/mL 的D，L-5-MTHF-Ca 混標(biāo)溶液與0.1 mg/mL 的L-5-MTHF-Ca 單標(biāo)溶液，取1 mL 混標(biāo)溶液，用單標(biāo)溶液稀釋到50 mL，進(jìn)樣記錄色譜圖得到D-5-MTHF-Ca 與L-5-MTHF-Ca 的分離度。

1.3.10 統(tǒng)計(jì)分析 本文中重復(fù)測(cè)定的結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 專(zhuān)屬性檢測(cè)

由圖1（A）L-5-MTHF-Ca 單標(biāo)色譜圖可知，L-5-MTHF-Ca 的保留時(shí)間為15.026 min，由圖1（B） 可得，D-5-MTHF-Ca 的保留時(shí)間為10.052 min。D，L-5-MTHF-Ca 的分離度為3.24，不小于1.5，說(shuō)明在此色譜條件下這兩種手性物質(zhì)可以得到較好的分離。

圖1 L-5-MTHF-Ca 專(zhuān)屬性檢測(cè)圖譜Fig.1 Chromatograms to determine the specificity for L-5-MTHF-Ca

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.3.4 節(jié)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)溶液，依次進(jìn)樣后記錄色譜圖，以L-5-MTHF-Ca 的峰面積為縱坐標(biāo)Y，每次所進(jìn)溶液中L-5-MTHF-Ca 的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)X，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），得到的曲線方程為Y=4 289.28X-100.81，R2=0.9997，線性質(zhì)量濃度范圍為0.016～0.100 mg/mL，在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 L-5-MTHF-Ca 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of L-5-MTHF-Ca

2.3 定量限與檢出限的檢測(cè)

按照1.3.5 節(jié)配制定量限與檢出限待測(cè)溶液，依次稀釋后進(jìn)樣，以信噪比S/N≥3 為檢出限，信噪比S/N≥10 為定量限，測(cè)得在此色譜條件下L-5-MTHF-Ca 的檢出限和定量限分別為3.11 μg/mL 和4.98 μg/mL。

2.4 精密度檢測(cè)

按照1.3.6 節(jié)配制精密度檢測(cè)溶液，取6 份檢測(cè)溶液依次進(jìn)樣并記錄色譜，以L-5-MTHF-Ca的百分含量進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1，可知相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.36%，不大于2%，說(shuō)明在此色譜條件下測(cè)定的精密度良好。

表1 L-5-MTHF-Ca 精密度檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果表Table 1 Experimental results of L-5-MTHF-Ca precision detection

2.5 穩(wěn)定性檢測(cè)

由圖3可知，L-5-MTHF-Ca 的峰面積 （含量）隨著時(shí)間的推移不斷減少，雜質(zhì)的峰面積（含量） 則隨著時(shí)間的推移不斷增加，說(shuō)明L-5-MTHF-Ca 在放置過(guò)程會(huì)緩慢降解從而轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌s質(zhì)物質(zhì)。相較于0 min 時(shí)L-5-MTHF-Ca 的峰面積，由12 min 時(shí)的峰面積計(jì)算得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.66%，小于2%，而由2 min時(shí)的峰面積計(jì)算得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）為0.13%，遠(yuǎn)小于2%，這也說(shuō)明了雖然L-5-MTHF-Ca 會(huì)隨時(shí)間緩慢降解，但只要在制樣完成后盡快進(jìn)樣分析，那么由于物質(zhì)降解造成的誤差就可以忽略不計(jì)。

圖3 L-5-MTHF-Ca 穩(wěn)定性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果圖Fig.3 Experimental results of L-5-MTHF-Ca stability test

2.6 回收率檢測(cè)

按照1.3.8 節(jié)配制3 組回收率檢測(cè)溶液，分別進(jìn)樣后記錄色譜圖?；厥章蕼y(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，計(jì)算得到的加標(biāo)平均回收率為103.71%，在80%～120%之間，說(shuō)明在此色譜條件下測(cè)定的回收率良好。

表2 L-5-MTHF-Ca 回收率檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Experimental results of L-5-MTHF-Ca recovery detection

2.7 系統(tǒng)適用性檢測(cè)

按照1.3.9 節(jié)配制系統(tǒng)適用性溶液，進(jìn)樣后記錄色譜圖。由測(cè)定得到的譜圖（圖4）可知，D，L-5-MTHF-Ca 的分離度為3.0，不小于1.5，說(shuō)明溶液中D-5-MTHF-Ca 在約0.002 mg/mL 的低質(zhì)量濃度下也能與L-5-MTHF-Ca 很好地分離開(kāi)來(lái)。

圖4 L-5-MTHF-Ca 系統(tǒng)適用性檢測(cè)譜圖Fig.4 Chromatogram for testing the applicability of L-5-MTHF-Ca system

3 結(jié)論

研究應(yīng)用手性色譜法分離測(cè)定L-5-MTHFCa 的含量，測(cè)定方法使用高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為CHIRALPAK HSA 手性色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流動(dòng)相為磷酸二氫鈉緩沖溶液∶乙腈=90∶10 的混合溶液，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫30 ℃。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，應(yīng)用手性色譜法可以很好地分離D，L-5-MTHF-Ca 這一對(duì)手性物質(zhì)，分離度達(dá)到3.24，并且在D 型物微量的情況下分離度也能達(dá)到3.0，L-5-MTHF-Ca 在0.016～0.100 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9997，測(cè)得的檢出限與定量限分別為3.11 μg/mL 和4.98 μg/mL，精密度測(cè)定的RSD 為0.38%，穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表明L-5-MTHF-Ca 會(huì)隨時(shí)間緩慢降解需盡快進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得的加標(biāo)平均回收率為103.71%。試驗(yàn)結(jié)果表明手性色譜法測(cè)定L-5-MTHF-Ca 含量的方法具有分離度高、精密度高、回收率高的優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于各種食品與保健品中L-5-MTHF-Ca 的含量測(cè)定，也可以為其它手性物質(zhì)的分離測(cè)定提供參考。