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        茶渣堿提取物中的蛋白質(zhì)性質(zhì)分析

        2022-10-24 07:13:36黃貞勝
        中國食品學(xué)報 2022年9期

        魏 漢,劉 派,黃貞勝,張 晨*

        (1 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 福州 350108 2 福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心 福州 350108 3 福建大昌生物科技實業(yè)有限公司 福州 350108)

        隨著社會節(jié)奏的加快,人們對快消茶飲料的需求也越來越旺盛,茶葉的消費模式從家庭式消費逐漸向大型茶飲料企業(yè)的采買轉(zhuǎn)變[1]。僅兩家福建省速溶茶加工企業(yè),每年茶葉消費量就達15 萬t,需要處理的茶渣量近10 萬t。這些茶渣大多直接用于堆肥或焚燒,而茶渣中含有20%~30%的蛋白質(zhì)[2],易產(chǎn)生富營養(yǎng)污染或形成NO2等有害氣體[3]。深入研究茶渣蛋白質(zhì)的應(yīng)用價值,可減少副產(chǎn)物的污染,實現(xiàn)現(xiàn)代食品工業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。

        蛋白質(zhì)產(chǎn)品在食品工業(yè)中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在其具有溶解性、起泡性、乳化性等理化性質(zhì),以及抑菌性、抗氧化性等生理活性。茶蛋白質(zhì)主要包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶、膜蛋白、多酚氧化酶等[4],由于其有較好的理化性質(zhì)與生理活性[5-6],可作為食品蛋白質(zhì)原料。本課題組前期研究表明:采用堿法獲得的茶渣蛋白質(zhì)性價比最高,提取率高達95%,且每噸蛋白質(zhì)生產(chǎn)成本較低[2]。然而,茶渣蛋白質(zhì)在堿性條件下可能會與多酚、糖類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),生成褐色復(fù)合物,改變其物質(zhì)組成。分析堿法獲得的茶渣蛋白質(zhì)的組成、分子質(zhì)量分布和理化性質(zhì),可揭示其理化性質(zhì)變化及生理活性形成的原因。

        為提高茶渣蛋白質(zhì)的起泡性、乳化性或抗氧化性,可采用酶(如胃蛋白酶或碳水化合物復(fù)合酶) 對堿法獲得的茶渣蛋白質(zhì)提取物的組成和結(jié)構(gòu)進行修飾。胃蛋白酶主要通過斷裂茶渣蛋白質(zhì)上芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵,將茶渣蛋白質(zhì)分解為多肽或氨基酸,從而可能釋放與多肽或氨基酸相連的糖類物質(zhì)或多酚,增加茶渣蛋白質(zhì)的起泡性與乳化性[7]。碳水化合物復(fù)合酶,如ViscozymeRL,可通過斷裂糖苷鍵,將茶渣蛋白質(zhì)中的糖類物質(zhì)分解為游離態(tài)的小分子寡糖或單糖,同時可能釋放部分與寡糖或單糖結(jié)合的多酚,促進蛋白質(zhì)的分離,提高茶渣蛋白質(zhì)的抗氧化性[8]。

        本文以綠茶渣為原料,通過堿提獲得茶渣蛋白質(zhì)提取物,測定其組分、分子質(zhì)量分布及各組分中主要成分,以及在不同pH 值下的溶解性、分散穩(wěn)定性、起泡性、乳化性。分析茶渣蛋白質(zhì)提取物的理化性質(zhì)、抑菌性以及與多酚含量的相關(guān)性。采用碳水化合物復(fù)合酶和胃蛋白酶水解茶渣蛋白質(zhì)提取物,以改進其產(chǎn)品的起泡性、乳化性和抗氧化性,為茶渣蛋白質(zhì)的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        茶渣,由福建大閩食品有限公司提供。綠茶葉經(jīng)85 ℃的熱水抽提45 min 后,過濾獲得的茶渣于60 ℃烘干制成綠茶渣樣品。

        Viscozyme?L,美國Sigma 公司;胃蛋白酶、茶多酚,上海源葉生物科技有限公司;其它分析純試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        CF16RXII 高速離心機,日本HITACHI 公司;LXJ-IIB 低速離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠;TE601-L 分析天平,德國賽多利斯公司;HH-6 恒溫水浴鍋,金壇市新航儀器廠;TNG-T98 真空干燥儀,太倉市華美生化儀器廠;BR415 紫外可見分光光度計,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;WKB-100-4 恒溫振蕩器,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司;MS-H280-Pro 加熱磁力攪拌器,中國大龍公司;OMNI Zeta 電位和粒徑分析儀,美國Brookhaven儀器公司;HR-6B 均質(zhì)機,上海滬析實業(yè)有限公司;6890 N 氣相色譜,美國Agilent 科技有限公司。

        1.3 樣品處理

        1.3.1 茶渣蛋白質(zhì)的提取 參考Zhang 等[2]的方法,將10 g 茶渣與200 mL 氫氧化鈉溶液(0.4 mol/L)混合,于加熱磁力攪拌器(95 ℃,4 h)攪拌反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后離心(13 952×g,10 min),分離獲得上清液和沉淀。使用100 mL 去離子水清洗沉淀,充分混合10 min 后離心(13 952×g,10 min),分離獲得沉淀和上清液。重復(fù)清洗沉淀3 次,離心獲得上清液,并將所有的上清液混合。使用鹽酸溶液(1 mol/L)調(diào)上清液至pH 3.5,靜置10 min 后,離心(13 952×g,10 min)獲得蛋白質(zhì)沉淀。加入20 mL去離子水于蛋白質(zhì)沉淀中不斷攪拌,然后緩慢加入氫氧化鈉溶液(0.1 mol/L)將酸沉后的蛋白質(zhì)復(fù)溶至溶液pH 值為7,冷凍干燥后得到茶渣蛋白質(zhì)干燥樣品。

        1.3.2 茶渣蛋白質(zhì)的水解 水解條件分別如下:

        1) 胃蛋白酶水解 以磷酸調(diào)PBS 緩沖液(0.05 mol/L,pH 7.0)至pH 3.5,使用其配置質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的茶渣蛋白質(zhì)溶液,并加入20 U 胃蛋白酶。

        2) 碳水化合物復(fù)合酶水解 以磷酸調(diào)PBS緩沖液(0.05 mol/L,pH 7.0)至pH 4.0,使用其配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的茶渣蛋白質(zhì)溶液,并加入10 U 的碳水化合物復(fù)合酶(Viscozyme?L)。

        分別取兩種混合液于恒溫振蕩儀 (1 000 r/min,35 ℃,20 h)上水解。水解結(jié)束后,水浴滅活(100 ℃,10 min)。反應(yīng)后將樣品冷卻至室溫,使用氫氧化鈉溶液(0.1 mol/L)調(diào)各酶解液至pH 7,并將蛋白質(zhì)溶液濃度稀釋至5 mg/mL。冷凍干燥后得到茶渣蛋白質(zhì)干燥樣品。

        1.3.3 透析去除游離多酚 配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的茶渣蛋白質(zhì)溶液,將該茶渣蛋白質(zhì)溶液放入3 ku 透析袋中,在密閉條件下透析24 h(中間換水3 次),透析結(jié)束將袋內(nèi)溶液冷凍干燥。

        1.4 組分測定

        1.4.1 蛋白質(zhì)測定 采用考馬斯亮藍法[9]于波長595 nm 處測定樣品吸光度,并以牛血清白蛋白溶液(100 μg/mL)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品計算樣品的蛋白質(zhì)含量。

        1.4.2 多酚測定 采用酒石酸亞鐵法[10]于波長540 nm 處測定樣品吸光度,并以茶多酚溶液(1 mg/mL)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品計算樣品的蛋白質(zhì)含量。

        1.4.3 灰分測定 采用《食品中灰分的測定方法》GB 5009.4-2016[11],以W(灰分)/W(蛋白質(zhì)干重)計算蛋白質(zhì)灰分含量。

        1.4.4 糖測定 參考劉路[12]的方法,稱取30.0 mg茶渣蛋白質(zhì)提取物于干凈的具塞試管中,加入2.0 mL 三氟乙酸溶液(2 mol/L),密封振蕩均勻后水解(120 ℃,5 h)。反應(yīng)結(jié)束后,利用氮吹儀吹干(水浴溫度:70 ℃),重復(fù)3~4 次。樣品用色譜級三氯甲烷溶解,經(jīng)0.22 μm 有機微孔濾膜,注入色譜進樣瓶,進行氣相色譜分析。

        氣相色譜操作條件的設(shè)置參照Yu 等[13]的研究。檢測器:氫火焰離子化檢測器;色譜柱:RTX-1701 石英毛細(xì)管,0.25 μm×30.0 m;程序升溫:180~220 ℃(5 ℃/min),220 ℃(5 min),220~280 ℃(10 ℃/min);載氣:氮氣;進樣量:1.0 μL。

        1.5 理化指標(biāo)測定

        1.5.1 茶渣蛋白質(zhì)不同pH 值下的溶解性 參考田元勇等[14]的方法,配置pH 值為7.0 的PBS 緩沖液(0.05 mol/L),分別用磷酸調(diào)至不同pH 值(2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0)。稱取10 mg 茶渣蛋白質(zhì),分別加入不同pH 值的緩沖液2 mL,混勻后離心(13 952×g,10 min),取上清測定蛋白含量。以V(上清液總體積)×C(上清液蛋白含量)/V(總?cè)芤后w積)計算蛋白質(zhì)溶解度。

        1.5.2 Zeta 電位測定 通過Zeta 電位儀的測定分析茶渣蛋白質(zhì)的分散穩(wěn)定性: 配置質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的茶渣蛋白質(zhì)溶液于Zeta 電位測定儀中測定電位。

        1.5.3 粒徑 配置pH 值為7.0 的PBS 緩沖液(0.05 mol/L),并以磷酸調(diào)PBS 緩沖液至pH 5.0。分別使用pH 5.0 和pH 7.0 的PBS 緩沖液配置質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的茶渣蛋白質(zhì)溶液,通過粒徑分析儀測定樣品的粒度分布和平均流體動力學(xué)直徑。

        1.5.4 起泡性及乳化性 參考李永富[15]的方法。

        1) 起泡性 取2 mL 茶渣蛋白質(zhì)溶液(10 mg/mL)于均質(zhì)機(10 000 r/min,2 min)攪打后,測定泡沫總體積。以V(起泡體積)/W(蛋白質(zhì))計算蛋白質(zhì)起泡能力。

        2) 乳化性 取2 mL 茶渣蛋白質(zhì)溶液(10 mg/mL)與2 mL 大豆油混合,于均質(zhì)機(10 000 r/min,2 min)攪打后,離心(3 240×g,10 min),測定乳化層的體積。以V(乳化層體積)/W(蛋白質(zhì))計算蛋白質(zhì)乳化能力。

        1.5.5 抑菌性 參考程慧青[16]的方法,選用在7℃以下時生長優(yōu)勢明顯的嗜冷菌及在常溫時生長優(yōu)勢明顯的假單胞菌測定茶渣蛋白質(zhì)的抑菌性。

        1) 抑菌圈試驗 菌液的制備:分別挑嗜單胞菌菌落和嗜冷菌菌落接種至100 mL 液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.8),搖床培養(yǎng)(假單胞菌25 ℃,嗜冷菌5 ℃,200 r/min)過夜。

        取20 mL 培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,瓊脂粉20 g/L,pH 7.8)于已滅菌平板,水平靜置凝固,接種0.1 mL 菌液均勻涂布。使用打孔器在培養(yǎng)基上打孔后,取0.1 mL 茶渣蛋白質(zhì)溶液(10 mg/mL)注入孔中,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(假單胞菌25 ℃,嗜冷菌5 ℃,200 r/min,12 h)。以1.0 mL 蒸餾水代替樣品作為空白對照。

        2) 比濁法測定抑菌率 菌液的制備:分別取100 mL 假單胞菌及嗜冷菌培養(yǎng)基(牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,瓊脂粉20 g/L,pH 7.8),于培養(yǎng)箱培養(yǎng)(假單胞菌25 ℃,嗜冷菌5 ℃,220 r/min,7 h)。培養(yǎng)結(jié)束后,取1 mL 培養(yǎng)液稀釋至OD600為0.5,再將1 mL 稀釋液用無菌水稀釋至10 mL。

        取0.1 mL 茶渣蛋白質(zhì)溶液(10 mg/mL),加入1 mL 菌液,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(假單胞菌25 ℃,嗜冷菌5 ℃,200 r/min,7 h),于波長600 nm 處測定混合液吸光度。以1.0 mL 蒸餾水代替樣品作為空白對照。

        1.5.6 抗氧化性 參考黃夢姣[17]的方法,選用DPPH·清除能力、ABTS·+清除能力和鐵離子還原力測定茶渣蛋白質(zhì)抗氧化性。

        1) 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·) 清除能力 取不同體積(100,200,300,400,500 μL)樣品溶液(1 mg/mL)與無水乙醇配制成總體積為500 μL 的溶液,再向溶液中加入1 mL DPPH·乙醇溶液(0.1 mmol/L)并混合均勻,避光靜置20 min 后,于517 nm 處測定其吸光值(Ai);在相同條件下,取不同濃度的樣品溶液與無水乙醇配制成總體積為1.5 mL 的溶液作為空白,測定其吸光值 (Aj);以0.5 mL 乙醇與1 mL DPPH·乙醇溶液(0.1 mmol/L)混合作為對照,測定其吸光值 (Ac)。以不同體積(200,400,600,800 μL,1 mL) 丁基羥基茴香醚 (Butylated hydroxy anisol,BHA)溶液(0.05 mg/mL)代替樣品作為陽性對照。

        式中:Ai——測定樣的吸光值;Aj——標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光值;Ac——對照樣的吸光值。

        2) 2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基(ABTS·+)清除能力 ABTS·+自由基工作液:取ABTS 二銨鹽儲備液(7.4 mmol/L)與等體積無水乙醇混合,避光室溫靜置12 h,以PBS 緩沖液(pH 7.4)將混合液稀釋至吸光度為0.70±0.02。取不同體積(40,80,120,160,200 μL)的樣品溶液(1 mg/mL)與無水乙醇配制成總體積為200 μL 的溶液,再向溶液中加入800 μL ABTS·+自由基溶液并混合均勻,靜置10 min 后,于734 nm 處測定其吸光值(Ai),以0.2 mL 乙醇與0.8 mL DPPH·乙醇溶液(0.1 mmol/L)混合作為空白,于734 nm 處測定其吸光值 (Ac)。以不同體積(200,400,600,800 μL,1 mL)BHA 溶液(0.1 mg/mL)代替樣品作為陽性對照。

        式中:Ai——測定樣的吸光值;Ac——空白樣的吸光值。

        3) 鐵離子還原力(FRAP 抗氧化能力) 取不同體積 (0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mL) 的樣品溶液(1 mg/mL),加入2.5 mL PBS 緩沖液(0.2 mol/L,pH 6.6)和2.5 mL 鐵氰化鉀溶液(10 mg/mL),混合均勻后水?。?0 0,20 min)。取出快速冷卻后,再加入2.5 mL 三氯乙酸溶液(0.1 mL/mL),離心(3 600×g,10 min)。取上清液加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 三氯化鐵溶液(1 mg/mL)并混合均勻,靜置10 min 后,于700 nm 處測定其吸光值。以不同體積(200,400,600,800 μL,1 mL)BHA 溶液 (0.5 mg/mL)代替樣品作為陽性對照。

        1.6 數(shù)據(jù)處理

        以3 次重復(fù)試驗每次同時做平行試驗所得的數(shù)據(jù)為結(jié)果,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Microsoft excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 茶渣蛋白質(zhì)提取物的組分與分子質(zhì)量分布

        對堿法提取的茶渣蛋白質(zhì)提取物中的蛋白質(zhì)、總糖、多酚、灰分進行測定,結(jié)果如圖1a 所示。在茶渣蛋白質(zhì)提取物中,蛋白質(zhì)含量最高,達到了52%。提取物中總糖含量占18%,其中半乳糖醛酸含量最高,達9.0%。這些半乳糖醛酸主要是來源于茶渣細(xì)胞壁中果膠[18]。提取物中未測定的成分占16%,這些成分可能主要來源于茶渣中多酚氧化形成的醌類化合物、脂質(zhì)(蠟、有機酸)和木質(zhì)素[19]及木質(zhì)素被降解后的產(chǎn)物[20]。

        采用SEC 色譜檢測茶渣蛋白質(zhì)提取物的分子質(zhì)量分布,結(jié)果如圖1b。茶渣蛋白質(zhì)依據(jù)分子質(zhì)量分布主要分為3 個組分(F1、F2、F3),其分子質(zhì)量范圍分別為F1>100 ku,100 ku>F2>3 ku,F(xiàn)3<3 ku。根據(jù)圖1b 中虛線劃分的3 個區(qū)域進行樣品收集,并測定各組分的蛋白質(zhì)含量,其中,F(xiàn)1 樣的蛋白質(zhì)含量最高,達到了83.2%,F(xiàn)2 樣蛋白質(zhì)含量為56.3%,F(xiàn)3 樣蛋白質(zhì)含量僅為32.3%。經(jīng)推測,提取物中的F1 樣蛋白質(zhì)主要來源于細(xì)胞膜內(nèi)的大分子二磷酸核酮糖羧化酶 (RuBisCO)[21],F(xiàn)2樣蛋白質(zhì)主要來源于細(xì)胞壁表面的膜蛋白、細(xì)胞膜內(nèi)的大分子糖蛋白以及各種生物酶[22],F(xiàn)3 樣蛋白質(zhì)主要來源于細(xì)胞膜內(nèi)小分子質(zhì)量的多肽、氨基酸等物質(zhì)[23]。

        圖1 茶渣蛋白質(zhì)提取物Fig.1 Tea residue protein product

        2.2 茶渣蛋白質(zhì)提取物的理化性質(zhì)和抑菌性

        2.2.1 茶渣蛋白質(zhì)提取物的溶解度與分散穩(wěn)定性 通過測定茶渣蛋白質(zhì)提取物在不同pH 值下的溶解度、Zeta 電位和粒徑分布,探究了其溶解度與分散穩(wěn)定性,結(jié)果如圖2所示。在pH 值為7 時,茶渣蛋白質(zhì)提取物具有較好的溶解度與分散穩(wěn)定性。由圖2a 可知,隨著pH 值升高,茶渣蛋白質(zhì)的Zeta 電位由正電位變?yōu)樨?fù)電位,且負(fù)電位時的絕對值不斷升高。當(dāng)pH=7 時,Zeta 電位值為-31.89 mV,此時溶液應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性,蛋白質(zhì)不易發(fā)生沉淀。在Zeta 電位為0 mV 時,茶渣蛋白質(zhì)pH 值為3.6,即為等電點pI。同時,隨著溶液pH值升高,茶渣蛋白質(zhì)的溶解度呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,在pH 值為7 時,茶渣蛋白質(zhì)完全溶解,溶解度大于5 mg/mL。由圖2b 可知,隨著pH 值升高,茶渣蛋白質(zhì)粒徑逐漸減小,且在pH 7 時茶渣蛋白質(zhì)溶液均勻分布。在pH 值為7 時,茶渣蛋白質(zhì)粒徑的4 個峰分別出現(xiàn)在4,9,40 和180 nm處,而當(dāng)pH 值為5 時,粒徑的4 nm 和9 nm 兩處峰消失,40 nm 處的峰增大,并右移至55 nm 附近。當(dāng)pH 值繼續(xù)降低后,由于溶液中蛋白顆粒過大而沉淀。這是因為蛋白分子以兩性離子形式存在,當(dāng)pH 值靠近pI 時,分子表面所帶同性電荷減少,靜電排斥作用減小,導(dǎo)致體系中蛋白分子傾向于相互聚集,使溶液溶解度和穩(wěn)定性降低[24]。

        圖2 茶渣蛋白質(zhì)提取物不同pH 值下的溶解度和分散穩(wěn)定性Fig.2 Solubility and dispersion stability of tea residue protein product at different pH

        2.2.2 茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性和乳化性 通過測定茶渣蛋白質(zhì)提取物在不同pH 值下的起泡性與乳化性,結(jié)果如圖3所示。隨著pH 值增大,茶渣蛋白質(zhì)的起泡性與乳化性均呈現(xiàn)升高的趨勢,其中起泡性快速升高,而乳化性升高緩慢。茶渣蛋白質(zhì)在pH 4 時,起泡性較低,為13.0 mL/g,當(dāng)在pH 12 時,起泡性為75.0 mL/g。這可能是因為在等電點附近時,蛋白分子所帶同性電荷最少,由于靜電排斥作用減少,蛋白粒子易發(fā)生聚集和絮凝,使得蛋白顆粒表面無法形成水化層,從而導(dǎo)致起泡性最弱;在偏離等電點時,蛋白顆粒間靜電斥力作用增強,分子向界面擴散能力增強,保持其形成蛋白膜性狀的能力增強[25]。茶渣蛋白質(zhì)在pH 4 時,乳化性為33.5 mL/g,當(dāng)在pH 12 時,乳化性為45.7 mL/g。這是因為,pH 值的升高,導(dǎo)致蛋白質(zhì)顆粒尺寸變小,蛋白質(zhì)基團的親水能力增強,同時,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開,原本包裹在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團暴露出來,增強了其表面親油活性[26]。然而,可能因為蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水基團較少,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)乳化性未顯著提高。

        圖3 不同pH 值下茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性和乳化性Fig.3 Foamability and emulsification capacity of tea residue protein product at different pH

        2.2.3 茶渣蛋白質(zhì)提取物的抑菌性與其多酚含量的相關(guān)性 通過測定茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚處理產(chǎn)物對嗜冷菌和假單胞菌的抑菌圈及抑菌率,其抑菌效果如圖4所示。結(jié)果表明,茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚處理產(chǎn)物對假單胞菌的抑菌效果強于嗜冷菌。隨著物質(zhì)濃度的增加,茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚處理產(chǎn)物抑菌效果不斷增強,且茶渣蛋白質(zhì)提取物的抑菌效果均較其脫酚處理產(chǎn)物更佳,該抑菌效果多為提取物中的多酚提供。由圖4a 可知,在接種假單胞菌的培養(yǎng)基中,與空白對照相比,茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚處理產(chǎn)物均呈現(xiàn)出明顯的抑菌圈,且茶渣蛋白質(zhì)提取物的抑菌圈范圍較其脫酚處理產(chǎn)物大。在接種嗜冷菌的培養(yǎng)基中,與空白對照相比,茶渣蛋白質(zhì)提取物的抑菌圈范圍較小,其脫酚處理產(chǎn)物則沒有出現(xiàn)明顯的抑菌圈(見圖4a)。這可能是因為茶渣蛋白質(zhì)提取物中的多酚具有較強的抑制假單胞菌活性[27]。由圖4b、4c 可知,隨著茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚處理產(chǎn)物濃度的增大,抑菌率均呈現(xiàn)上升趨勢。在質(zhì)量濃度為80 mg/mL 時,茶渣蛋白質(zhì)提取物對嗜冷菌和假單胞菌的抑菌率分別可達98%和93%,具有較好的抑菌活性,而茶渣蛋白質(zhì)脫酚處理產(chǎn)物則分別只有39%和50%,這表明茶渣蛋白質(zhì)的多酚物質(zhì)含量的增大可更為有效地抑制腐敗菌活性,且茶渣蛋白質(zhì)提取物的抑菌率較其脫酚處理產(chǎn)物抑菌率高。

        圖4 茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚產(chǎn)物對兩株腐敗菌的抑菌圈試驗及抑菌率Fig.4 Inhibition zone experiment and inhibition rate of tea residue protein product and its dialysis products to two putrefactive bacteria

        2.3 酶解對茶渣蛋白質(zhì)提取物性質(zhì)的影響

        2.3.1 茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的起泡性和乳化性

        在不同體系的工業(yè)應(yīng)用中,蛋白質(zhì)溶液常以中性形式存在,因此測定pH 7 下茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的起泡性和乳化性,結(jié)果如圖5所示。經(jīng)胃蛋白酶水解后,茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性與乳化性均有較大幅度的提升,而經(jīng)碳水化合物復(fù)合酶水解后,其起泡性略微升高,乳化性下降,經(jīng)脫酚處理后,其乳化性與起泡性基本無變化。

        圖5 pH 7 下茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的起泡性和乳化性Fig.5 Foamability and emulsification capacity of tea residue protein extract and its enzymatic hydrolysis products at pH 7

        與茶渣蛋白質(zhì)提取物起泡性 (40.2 mL/g)相比,經(jīng)胃蛋白酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性(66.7 mL/g)提升了近2 倍,這可能是因為胃蛋白酶斷裂蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸或酸性氨基酸上的肽鍵,從而增加蛋白質(zhì)的表面疏水性,使蛋白質(zhì)分子在界面大量聚集,提高了蛋白的起泡能力[28]。經(jīng)碳水化合物復(fù)合酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性(52.4 mL/g)略高于茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性,原因可能是碳水化合物復(fù)合酶通過水解糖類物質(zhì)打破蛋白復(fù)合物的交聯(lián)狀態(tài),降低蛋白復(fù)合物的親水基團,從而增加形成的泡沫數(shù)量,提高了蛋白質(zhì)的起泡性[29]。經(jīng)脫酚處理后,茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性基本無影響。

        與茶渣蛋白質(zhì)提取物乳化性 (35.8 mL/g)相比,胃蛋白酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的乳化性(100.0 mL/g)有顯著的提高,這可能是因為胃蛋白酶通過斷裂大分子復(fù)合物中蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵為小分子蛋白-多酚復(fù)合物、蛋白-多糖復(fù)合物、多肽和氨基酸等[30],使得多酚的親水性酚羥基通過增加體系的溶解度來幫助提高乳化性[31]。碳水化合物復(fù)合酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的乳化性(12.0 mL/g)低于茶渣蛋白質(zhì)提取物的乳化性,原因可能是碳水化合物復(fù)合酶在水解蛋白復(fù)合物時,其中大量游離態(tài)多酚、單糖等小分子親水性物質(zhì)被透析釋放,導(dǎo)致乳化性降低[29]。茶渣蛋白質(zhì)提取物經(jīng)脫酚處理后,其乳化性基本無變化。經(jīng)脫酚處理后,茶渣蛋白質(zhì)提取物的乳化性基本無影響。

        2.3.2 茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的抗氧化性 通過測定DPPH 清除率、ABTS 的清除率和鐵離子還原能力,分析幾種酶解方法對茶渣蛋白質(zhì)提取物抗氧化性的影響,結(jié)果如圖6所示。茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的抗氧化性均與樣品濃度呈正相關(guān)。經(jīng)碳水化合物復(fù)合酶水解后,茶渣蛋白質(zhì)提取物抗氧化性顯著提高,而經(jīng)胃蛋白酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的抗氧化性變化較小,但均低于陽性對照BHA 的抗氧化性(Butylated hydroxy anisol,丁基羥基茴香醚)。由圖6a、6b、6c 可知,經(jīng)碳水化合物復(fù)合酶水解后的茶渣蛋白質(zhì)提取物顯示出較強的DPPH 清除能力、ABTS 的清除能力及鐵原子還原力,僅低于陽性對照BHA。計算可得,碳水化合物復(fù)合酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物清除DPPH 的IC50為0.18 mg/mL,清除ABTS的IC50為0.07 mg/mL,在樣品質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時,其FRAP 值為2.1 mmol/L Fe2+。經(jīng)胃蛋白酶水解后,茶渣蛋白質(zhì)提取物的DPPH 清除能力、ABTS 清除能力及鐵原子還原力的變化較小。計算可得,胃蛋白酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物清除DPPH 的IC50為0.21 mg/mL,清除ABTS 的IC50為0.09 mg/mL,在樣品質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時,其FRAP 值為2.0 mmol/L Fe2+。這可能是因為,茶渣蛋白質(zhì)提取物對DPPH 清除率、ABTS 的清除率和鐵離子還原能力與多酚的酚羥基及蛋白質(zhì)上的羥基等相關(guān)。碳水化合物復(fù)合酶水解了復(fù)合物中呈交聯(lián)狀態(tài)的碳水化合物,釋放了大量連接碳水化合物的多酚[29],而胃蛋白酶通過水解蛋白質(zhì)為具有暴露羥基的多肽或氨基酸在一定程度上提高了茶渣蛋白質(zhì)的抗氧化性[32]。

        圖6 茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的抗氧化性Fig.6 Antioxidant activity of protein extract from tea residue and its hydrolysates

        3 結(jié)論

        茶渣堿提取物中蛋白質(zhì)含量為52%,可主要分為3 個組分(F1>100 ku,100 ku>F2>3 ku,F(xiàn)3<3 ku)。其中,F(xiàn)1 樣的蛋白質(zhì)含量達83.2%,具有較高的商業(yè)價值。茶渣蛋白質(zhì)等電點 (pI) 為3.6,當(dāng)pH>7 時,蛋白質(zhì)具有良好的溶解度和分散穩(wěn)定性,可較好地應(yīng)用于食品工業(yè)。在茶渣蛋白質(zhì)提取物質(zhì)量濃度為80 mg/mL 時,茶渣蛋白質(zhì)提取物對嗜冷菌和假單胞菌的抑菌率分別可達98%和93%,該抑菌效果多為提取物中的多酚提供。采用碳水化合物復(fù)合酶ViscozymeRL 和胃蛋白酶對茶渣蛋白質(zhì)提取物進行水解,較茶渣蛋白質(zhì)提取物相比,經(jīng)胃蛋白酶水解的起泡性(58.3 mL/g)提升了近1 倍,乳化性(100.0 mL/g)提升了近3 倍。經(jīng)碳水化合物復(fù)合酶ViscozymeRL 水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的抗氧化性提升了約0.5 倍,其清除DPPH 的IC50為0.18 mg/mL,清除ABTS 的IC50為0.07 mg/mL,其在提取物質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時的FRAP 值為2.1 mmol/L Fe2+。茶渣蛋白質(zhì)提取物的性質(zhì)分析與進一步優(yōu)化改性,為茶渣資源的合理利用和深度開發(fā)提供必要的理論保障。

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