張明輝，賈 舸，喬為倉，趙軍英，王亞玲，陳歷俊

（北京三元食品股份有限公司，國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心，北京市乳品工程技術(shù)研究中心，母嬰研究技術(shù)創(chuàng)新中心 北京 100163）

氯酸鹽和高氯酸鹽是一種持續(xù)性的環(huán)境污染物。氯酸鹽是使用液氯、二氧化氯和次氯酸鹽消毒時產(chǎn)生的副產(chǎn)物[1-3]。嬰幼兒配方奶粉中的氯酸鹽殘留主要來源于含有氯酸鹽的生產(chǎn)用水和加工設(shè)備消毒[4-6]。高氯酸鹽是國際上廣泛關(guān)注的環(huán)境污染物[7-8]。乳品中高氯酸鹽可能來源于飼料和飲水的源頭污染[9-10]，包括肥料的施用、氯類消毒劑的降解、氯類殺菌劑、除草劑的施用等[11-12]。氯酸鹽可影響人體的血液系統(tǒng)和甲狀腺系統(tǒng)，從而影響人體健康；高氯酸鹽可以競爭性結(jié)合鈉／碘轉(zhuǎn)運體（NIS），從而干擾人體正常代謝，尤其對孕婦及嬰兒健康有較大威脅[13-15]。2020年5月25日，歐盟委員會發(fā)布（EU） 2020/685 號條例，修訂高氯酸鹽在嬰兒配方奶粉、后續(xù)配方奶粉、嬰幼兒專用醫(yī)療食品和幼兒配方奶粉最大殘留限量0.01 mg/kg，嬰兒食品最大殘留限量0.02 mg/kg[16-18]。研究牛奶和嬰幼兒配方乳粉中氯酸鹽和高氯酸鹽的定量分析方法具有重要意義。

目前，關(guān)于氯酸鹽和高氯酸鹽的檢測方法主要有分光光度計法、拉曼光譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、離子色譜法及離子色譜-質(zhì)譜法[19]。分光光度計法前處理步驟繁瑣且靈敏度底，僅適用于高含量物質(zhì)的測定。拉曼光譜法本身信號強度較弱，導(dǎo)致其檢測的靈敏度較低，檢出限無法滿足大部分食品中高氯酸鹽含量的測定。液相色譜-質(zhì)譜法靈敏度高、選擇性好，具有靈敏、準(zhǔn)確、線性范圍廣，可同時測定多種組分等優(yōu)點，可用于食品中多種離子的同時檢測[20-22]，然而，由于其流動相多為無機鹽類，長期檢測對離子源有一定污染，從而影響長期分析穩(wěn)定性。離子色譜法的電導(dǎo)檢測器的選擇性較差，檢測液體乳等基質(zhì)復(fù)雜的樣品時容易造成假陽性。由于嬰幼兒配方奶粉的基質(zhì)比較復(fù)雜，因此使得常規(guī)的離子色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法不再適用于奶粉中高氯酸鹽含量的檢測[23]。而離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的流動相在經(jīng)過色譜柱后，通過抑制器去除其中的堿，再進入質(zhì)譜檢測器，提高了檢測靈敏度，也避免了非揮發(fā)性堿對質(zhì)譜檢測器造成的傷害[24]。該方法靈敏度高，前處理方法簡便。本文擬優(yōu)化前處理方法，采用離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立牛奶和嬰幼兒配方奶粉中氯酸鹽和高氯酸鹽含量的檢測方法，為氯酸鹽和高氯酸鹽的食品安全風(fēng)險評估提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

嬰兒配方奶粉（Ⅰ段、Ⅱ段、Ⅲ段），市售；氯酸鈉、高氯酸鈉（分析純），美國sigma 公司；甲醇、乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex ICS-6000 離子色譜，美國Thermo Scientific 公司，配有四元梯度泵、抑制型電導(dǎo)檢測器、EGC 500 KOH 淋洗液自動發(fā)生器、ADRS 600 2 mm 陰離子抑制器、XCalibur 色譜工作站；色譜柱，美國Thermo Scientific 公司：IonPac AS19，7.5 μm，250 mm×2 mm （P/N：062886）；IonPac AG19，11 μm，250 mm×2 mm（P/N：062888）；TSQ Quantiva 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（MS/MS），美國Thermo Scientific 公司，配有電噴霧離子化源（ESI）和TSQ Quantiva3.0 Tune 工作軟件；OnGuard II RP前處理小柱，美國Dionex 公司；Milli-Q.A10 超純水凈化器，美國MILLIPORE 公司；0.22 μm 濾膜，Agela 公司；電子天平AL104，梅特勒-托利多儀器有限公司高速冷凍離心機3K-15，美國Sigma 公司；恒溫水浴鍋Polystat K6，德國Huber 公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取一定質(zhì)量的標(biāo)品，將高氯酸鹽、氯酸鹽分別溶于超純水中，并按表1中的質(zhì)量濃度配制混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中高氯酸鹽和氯酸鹽的質(zhì)量濃度Table 1 Mass concentrations of perchlorate and chlorate in standard series working solutions

1.4 樣品前處理

1.4.1 牛乳 吸取1 mL 牛乳于10 mL 離心管中，加入4 mL 乙腈沉淀蛋白，渦旋振搖2 min 后，在4℃，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液1 mL 加入9 mL 去離子水稀釋后，過0.22 μm 的尼龍濾膜，取5 mL 濾液備用。

RP 小柱活化方法： 用10 mL 甲醇和5 mL 去離子水將RP 小柱淋洗活化。將上述濾液以1 mL/min 的速率通過RP 小柱凈化，棄去初濾液，流出液經(jīng)0.22 μm 膜過濾，上機分析。

1.4.2 嬰幼兒配方乳粉 精確稱量1 g 奶粉于4 mL 超純水中，加熱至50 ℃，使奶粉充分溶解。按1.4.1 節(jié)的方法對復(fù)溶嬰幼兒配方乳粉進行處理。

1.5 色譜條件

采用IonPac AS19，7.5 μm，250 mm×2 mm 分析柱；IonPac AG19，11 μm，250 mm×2 mm 保護柱；抑制器溫度：35 ℃；Legacy 模式，61 mA 電流。流速：0.35 mL/min；進樣量：50 μL；AXP 泵外接水模式，流速：0.8 mL/min；流動相A：超純水。采用EGC 淋洗液自動發(fā)生器產(chǎn)生的高純KOH 溶液，濃度梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序表Table 2 Gradient elution procedure

1.6 質(zhì)譜條件

TSQ Quantiva 串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀；ESI 負(fù)離子模式；Negative Ion（V）：3 000（V）；Sheath gas（Arb）：45；Aux Gas （Arb）：10；Sweep Gas （Arb）：2；離子傳輸管溫度 （℃）：320；Vaporizer Temp（℃）：400；多反應(yīng)監(jiān)測（SRM）模式。

1.7 精密度和回收率測定

精密度：取1 μg/L 的高氯酸鹽和1 μg/L 的氯酸鹽標(biāo)品溶液按1.5 節(jié)色譜條件連續(xù)進樣6 次，進行重復(fù)測定。

回收率：取牛乳和嬰兒配方粉樣品，分別按表8加入低、中、高濃度的標(biāo)品，取牛奶樣品，第1 組加入高氯酸鹽0.06 μg/L，加標(biāo)量分別為1，5，10 μg/L；第2 組加入氯酸鹽4.43 μg/L，加標(biāo)量分別為10，15，20 μg/L。取嬰幼兒配方奶粉樣品，第1 組加入高氯酸鹽8.53 μg/L，加標(biāo)量分別為5，10，20 μg/L；第2 組加入氯酸鹽98.87 μg/L，加標(biāo)量分別為50，100，200 μg/L。然后按1.4 節(jié)樣品前處理和1.5節(jié)色譜方法檢測高氯酸鹽、氯酸鹽含量，平行測定3 次，取其平均值，計算方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱優(yōu)化 試驗分別考察了Dionex IonPac AS19 色譜柱與Dionex IonPac AS11 色譜柱的分離效果，見圖1。由于AS11 色譜柱疏水性較強，高氯酸鹽在AS11 色譜柱上具有較強的保留性，當(dāng)淋洗液氫氧化鉀溶液的濃度為100 mmol/L（淋洗液自動發(fā)生器在線產(chǎn)生的最高濃度） 時，高氯酸鹽的保留時間超過30 min，且色譜峰形較差。與AS11 色譜柱相比，AS19 色譜柱具有更強的親水性，當(dāng)淋洗液發(fā)生器產(chǎn)生100 mmol/L 氫氧化鉀溶液進行洗脫時，高氯酸鹽保留時間為15 min。同時IonPac AS19 分析柱的柱容量大、背景低。所以選擇以IonPac AS19 為分析柱，IonPac AG19 為保護柱。

圖1 高氯酸鹽在AS11、AS19 色譜柱的保留時間Fig.1 Retention time of perchlorate in AS11 column and AS19 column

2.1.2 洗脫程序優(yōu)化 以EGC 在線產(chǎn)生KOH 為淋洗液，優(yōu)化了KOH 淋洗液濃度，對比了50，70，100 mmol/L 等濃度，隨著淋洗液濃度升高，保留時間縮短，但背景基線也會更高，見圖2。最終選擇梯度洗脫方式，氫氧化鉀濃度從15 mmol/L 到70 mmol/L 梯度洗脫，該模式下兩組分可以得到很好的分離，并避免了一直選擇高濃度堿液對儀器的影響。淋洗液經(jīng)抑制器61 mA 電抑制后，進入質(zhì)譜檢測器，從而消除無機酸和堿對質(zhì)譜檢測器的影響。

圖2 不同洗脫濃度下高氯酸鹽的保留時間Fig.2 Retention time of perchlorate at different elution concentrations

2.1.3 檢測器選擇優(yōu)化 食品中高氯酸鹽、氯酸鹽等的測定主要采用離子色譜法，檢測器主要有電導(dǎo)檢測器和質(zhì)譜檢測器。分別取10 μg/L 混標(biāo)通過兩種檢測器上機對比分析，由圖3可知氯酸鹽（A）的保留時間為8.8 min，高氯酸鹽（C）保留時間為21.9 min，電導(dǎo)檢測器在相同時間未出峰。對比結(jié)果表明：質(zhì)譜檢測器測定高氯酸鹽、氯酸鹽的靈敏度高于電導(dǎo)檢測器約1 000 倍。

圖3 高氯酸鹽、氯酸鹽混標(biāo)電導(dǎo)檢測色譜圖與質(zhì)譜圖Fig.3 Chromatogram of IC-CD and MRM spectrometry of perchlorate and chlorate

2.2 質(zhì)譜分析條件優(yōu)化

首先針泵連續(xù)直接進樣，吸取500 μL 質(zhì)量濃度為10 μg/L 的氯酸鈉和高氯酸鈉混標(biāo)溶液，針泵流速為20 μL/min。ESI 負(fù)離子模式，掃描方式為Q1 全掃模式，通過優(yōu)化電壓和載氣流量，分別確定了高氯酸根（m/z 99）和氯酸根（m/z 83.8）的母離子信息。在電噴霧負(fù)離子掃描模式下，高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)質(zhì)譜掃描后會產(chǎn)生 （m/z）99 和（m/z）101 兩種母離子。由于自然界中35Cl 含量為37Cl 的3 倍，35Cl16O4-的含量較高，試驗選擇（m/z）99 作為高氯酸鹽定性及定量的母離子。母離子經(jīng)質(zhì)譜碰撞后分別丟失一個氧原子和兩個氧原子產(chǎn)生35Cl16O3-和35Cl16O2-兩種碎片離子，其對應(yīng)的子離子分別為（m/z）83.2、（m/z）67.3，選擇響應(yīng)強度較大的碎片（m/z）99／83 作為高氯酸鹽定量離子對，選擇（m/z）101/85 作為定性離子[25]。同樣，氯酸鹽溶液經(jīng)電噴霧負(fù)離子掃描后，產(chǎn)生（m/z）83.8、（m/z）85 兩種母離子；以（m/z）83.8 為母離子進行二級質(zhì)譜掃描，選擇響應(yīng)強度較大的碎片離子（m/z）83.8／67 作為氯酸鹽定量碎片離子（m/z），85／69 作為定性離子[26-27]。進而分別對兩對離子對進行其它條件優(yōu)化。分別優(yōu)化碰撞能量（v）、RF lens（V）等參數(shù)（見表3），選擇最優(yōu)參數(shù)使得信號穩(wěn)定、靈敏度達到最佳。經(jīng)過條件優(yōu)化，高氯酸鹽和氯酸鹽能達到很好的分離和檢測。為減少對質(zhì)譜的污染，進樣程序采用切換溶液進質(zhì)譜方式，見表4。

表3 高氯酸鹽和氯酸鹽質(zhì)譜參數(shù)Table 3 MS parameters of perchlorate and chlorate

表4 質(zhì)譜進樣切換程序Table 4 MS or WASTE

2.3 樣品前處理優(yōu)化

2.3.1 樣品沉淀蛋白試劑優(yōu)化 檢測牛奶和嬰幼兒配方奶粉樣品中的氯酸鹽和高氯酸鹽含量，需要用有機試劑進行沉淀蛋白，在比較了甲醇和乙腈的沉蛋白效果后發(fā)現(xiàn)使用甲醇和乙腈都可以很好的將蛋白沉淀，但是處理樣本在4 ℃冰箱過夜后，甲醇沉淀樣本溶液中會有肉眼可見的絮狀沉淀，乙腈沉淀樣本可保持澄清，沒有出現(xiàn)該狀況。所以本試驗選擇乙腈沉淀蛋白。

有機溶劑用量不足，會影響蛋白沉淀效果，過高的有機試劑對離子色譜的基線有嚴(yán)重影響，試驗對乙腈用量進行了優(yōu)化。首先將乙腈直接加入嬰幼兒配方奶粉中，取2 g 樣品直接加入20 mL 乙腈，奶粉樣品中蛋白質(zhì)與乙腈接觸后發(fā)生變質(zhì)，在奶粉樣品的外層形成包裹，阻止了奶粉樣品的分散，無法達到提取效果。因此，選擇先將嬰幼兒配方奶粉樣品制成復(fù)原乳，再用乙腈提取的模式。試驗對比了還原乳與乙腈的體積比分別為1∶1、1∶4和1∶9 時，高氯酸鹽和氯酸鹽的提取效果。結(jié)果表明：加大乙腈用量，可以得到更清澈的上清液，但是也增加了目標(biāo)物的稀釋倍數(shù)，加大了檢測難度。由于高氯酸鹽、氯酸鹽在很多樣品中的含量很低，稀釋倍數(shù)過高會導(dǎo)致上機濃度低于檢出限，造成假陰性。因此，選擇1 mL 嬰幼兒配方奶粉樣品加入4 mL 乙腈提取時，不僅保證了提取效果，而且高氯酸鹽、氯酸鹽上機濃度均在檢測范圍內(nèi)，且基線平穩(wěn)。

2.3.2 凈化柱的選擇 分別選擇不同凈化柱HLB柱、C18 柱、RP 柱對樣品提取液進行凈化。HLB、C18、RP 柱都能得到澄清的待測液。因此，選用HLB、C18、RP 柱做回收率試驗，結(jié)果表明RP 柱凈化后的回收率最高，見表5。因此，本研究采用RP固相萃取柱作為前處理凈化柱。

表5 不同固相萃取柱對回收率的影響Table 5 Effects of different SPE columns on recovery rates

2.3.3 RP 柱凈化效率試驗優(yōu)化 取5 mL 質(zhì)量濃度為10 μg/L 混標(biāo)過RP 小柱，分段截取溜出液，每管收集1 mL，共5 管，上機檢測。RP 凈化柱洗脫效率，見表6。結(jié)果表明由于前段流出液中會摻雜洗脫液，影響目標(biāo)物濃度，所以應(yīng)收集后2 min的流出液上機。

表6 RP 凈化柱洗脫效率Table 6 Elution efficiency of RP purification column

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在優(yōu)化的最佳試驗條件下，將配制好的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進樣檢測，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果見表7。

表7 高氯酸鹽和氯酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍Table 7 Linear range and standard curve of perchlorate and chlorate

2.4.2 精密度試驗 取1 μg/L 的高氯酸鹽和1 μg/L 的氯酸鹽標(biāo)品溶液按1.5 節(jié)色譜條件連續(xù)進樣6 次，離子峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.06%和0.96%，表明此方法精密度良好。

2.4.3 檢出限和定量限 取0.1 μg/L 的高氯酸鹽和0.5 μg/L 的氯酸鹽標(biāo)品溶液上機分析。根據(jù)儀器信噪比和檢出限的計算，該方法高氯酸鹽檢出限為7 ng/L，定量限為20 ng/L；氯酸鹽檢出限為1.7 ng/L，定量限為5 ng/L，與許小茜等[12]建立的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法相比，具有更低的檢出限。

2.4.4 重復(fù)性 按1.4 節(jié)試驗條件對牛奶和嬰幼兒配方奶粉樣品進行前處理，并按1.5 節(jié)色譜條件對其高氯酸鹽、氯酸鹽含量進行檢測，每組試驗6 個平行。結(jié)果顯示，牛奶樣品中高氯酸鹽和氯酸鹽的RSD 分別為2.31%和3.45%，均小于5%（n=6）；嬰幼兒配方奶粉樣品中高氯酸鹽和氯酸鹽的RSD 分別為2.1%和3.22%，均小于5%（n=6），表明該檢測方法具有良好的重復(fù)性。

2.4.5 穩(wěn)定性 分別取1 份嬰幼兒配方奶粉樣品，按1.4 節(jié)前處理條件處理后，分別在0，2，4，6，8，24，48，72，96 h 上機檢測，平行測定3 次，取其平均值。測得的樣品含量如圖4所示，樣品各組分含量隨時間增長無明顯變化，其中樣品8 h 的RSD 均＜0.4%，檢測了4 d 的日間穩(wěn)定性，其RSD均＜2.21%，結(jié)果表明樣品可以在較長時間保持穩(wěn)定。

圖4 嬰幼兒配方奶粉樣品中高氯酸鹽和氯酸鹽穩(wěn)定性Fig.4 Intraday and inter-day stability of perchlorate and chlorate in the samples of infant formula

2.4.6 加標(biāo)回收率 取牛奶和嬰幼兒配方奶粉樣品，分別按表8加入低、中、高濃度的標(biāo)品，按1.4節(jié)前處理方法和1.5 節(jié)色譜方法檢測高氯酸鹽、氯酸鹽含量，平行測定3 次，取其平均值，計算回收率。結(jié)果見表8，顯示各組分RSD 均＜0.68%，回收率在82.00%～97.85%，表明該方法具有良好的回收率，能夠準(zhǔn)確地同時檢測牛奶和嬰幼兒配方奶粉樣品中的高氯酸鹽、氯酸鹽含量。

表8 牛奶和嬰兒配方粉樣品加標(biāo)回收率Table 8 Spiked recoveries of milk and infant formula samples

2.4.7 樣品分析 分別取牛奶樣品20 個、市售段嬰幼兒配方奶粉（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）樣品6 個，采用本研究建立的IC-MS/MS 方法進行高氯酸鹽、氯酸鹽檢測，每個樣品平行測定3 次，外標(biāo)法定量。20 個牛乳樣品中，高氯酸鹽檢出5 個，含量范圍在0.06～4.35 μg/kg 之間，氯酸鹽檢出4 個，含量范圍在2.43～13.49 μg/kg 之間，其余均未檢出。嬰幼兒配方奶粉樣品中，高氯酸鹽均有不同程度的檢出，含量范圍在1.02～14.95 μg/kg 之間。

3 結(jié)論

本研究通過對樣品前處理條件和離子色譜及串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，建立了利用離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，同時測定牛奶和嬰幼兒配方奶粉樣品中高氯酸鹽、氯酸鹽含量的方法，該方法的回收率為82.00%～97.85%，RSD＜0.68%，高氯酸鹽、氯酸鹽的檢出限分別為7 ng/L 和1.7 ng/L，定量限分別為20 ng/L 和5 ng/L，表明該方法具有較好的重復(fù)性及穩(wěn)定性，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。與傳統(tǒng)的液相質(zhì)譜法相比，該方法前處理簡便，試驗成本低，分析時間短，定性準(zhǔn)確，回收率高，檢出限低，靈敏度高，能夠廣泛應(yīng)用于不同種類乳制品及嬰幼兒配方奶粉中高氯酸鹽、氯酸鹽的定量與分析，為食品安全提供了技術(shù)保障。

圖6 10 μg/L 高氯酸鹽、氯酸鹽標(biāo)品譜圖Fig.6 Spectrum of perchlorate and chlorate standard at 10 μg/L