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        靈武長棗貯藏過程中細胞壁降解及多糖結(jié)構(gòu)的變化

        2022-10-24 07:13:28郝慧慧張海紅楊靜慧
        中國食品學(xué)報 2022年9期

        郝慧慧,邱 雪,張海紅,楊靜慧

        (寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院 銀川 750021)

        靈武長棗,別名馬牙棗,為寧夏特色鮮食長棗,中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品,具有色澤誘人、質(zhì)脆肉豐、營養(yǎng)豐富、酸甜適口等特點,其最大單果質(zhì)量可達40 g,含可溶性固形物≥25.0%,有“百果之王”的美稱[1]。其在采后貯藏過程中極易發(fā)生失水、軟化、皺縮等情況,造成脆性降低、品質(zhì)下降、口感柴化、營養(yǎng)成分流失等現(xiàn)象,嚴(yán)重影響靈武長棗的貨架期及商品價值。

        果實在采后貯藏過程中隨著質(zhì)地不斷軟化,生理、生化指標(biāo)會發(fā)生變化。植物細胞壁主要由胞間層、初生壁和次生壁構(gòu)成,其主要成分是果膠和纖維素,對細胞具有支持、保護作用。研究表明,諸多果實,如杏[2]、藍莓[3]、蘋果[4]、梨[5]、草莓[6]等在貯藏過程中,伴隨著細胞壁修飾酶的作用,細胞壁多糖結(jié)構(gòu)不斷改變、降解、溶解,使果實硬度不斷下降,最終導(dǎo)致果實軟化。Wang 等[7]研究發(fā)現(xiàn)蔗糖分解代謝會促進果實軟化,且蔗糖含量、蔗糖磷酸合成酶活性與果實硬度下降呈正相關(guān)。Jain 等[8]發(fā)現(xiàn)在儲存過程中,纖維素、半纖維素和果膠含量持續(xù)下降的同時,伴隨著細胞壁酶活性的上升,果膠的降解與聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶的表達密切相關(guān),且細胞壁酶活性與果實硬度的降低呈正相關(guān),表明細胞壁軟化與多糖代謝具有一定的關(guān)聯(lián)性。

        植物細胞壁中果膠主要由同型半乳糖醛酸聚糖(Homogalacturonan,HG)和鼠李半乳糖醛酸聚糖(Rhamnogalacturonan,RG)組成,一般根據(jù)半乳糖醛酸與鼠李糖殘基的比例來判別果膠主鏈的變化,再根據(jù)半乳糖基與鼠李糖殘基的比例及阿拉伯糖基與鼠李糖殘基的比例判別果膠側(cè)鏈的變化[9]。Fan 等[10]以杏為研究對象,發(fā)現(xiàn)其貯藏過程中,水溶性果膠側(cè)鏈的缺失會改變細胞壁的剛性和強度,影響果膠的溶解度,進而改變果實的質(zhì)地。Liu 等[11]利用原子力顯微鏡研究鈣處理結(jié)合低溫貯藏的杏細胞納米結(jié)構(gòu),通過測量果膠組分的鏈長及鏈寬變化,發(fā)現(xiàn)杏的軟化過程遵循多糖在貯藏過程中降解的變化趨勢。

        目前關(guān)于貯藏過程中果蔬二級結(jié)構(gòu)的變化鮮有研究報道。本文擬以靈武長棗為研究對象,研究貯藏過程中,伴隨著果實軟化,細胞壁組分含量及細胞壁結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)合傅里葉紅外光譜技術(shù),分析細胞壁果膠多糖中官能團變化對果膠組分及細胞壁結(jié)構(gòu)的影響,為靈武長棗采后貯藏保鮮提供試驗參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料與試劑

        本試驗所用的靈武長棗采摘于寧夏靈武市大泉林場長棗生產(chǎn)基地,采摘后裝于紙板箱常溫下24 h 內(nèi)送至實驗室。挑選出無機械損傷、無病蟲害、果形大小相似的果實作為實驗試材,分裝于7個聚乙烯塑料保鮮袋內(nèi),對應(yīng)于7 次不同的取樣測定時間,每袋內(nèi)棗果數(shù)量不低于50 個。室溫下散失呼吸熱12 h 后將果實置于4 ℃冰箱內(nèi)貯藏待測。

        咔唑、溴化鉀(光譜純)、無水乙醇,天津市瑞金特化學(xué)試劑有限公司;蒽酮,天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;二甲基亞砜、1,2-環(huán)己二胺四乙酸,天津市津科化工研究所;氯仿,中國宿遷化學(xué)試劑有限公司;碳酸鈉,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉、硼氫化鈉,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 試驗設(shè)備與儀器

        GL-20C 高速冷凍離心機,北京哈納科儀科技有限公司;HH-4 電熱恒溫水浴鍋,上海比朗儀器有限公司;LGJ-18 小型烘箱,上海力辰科技有限公司;TA-XT2i 質(zhì)構(gòu)儀,英國Stable Micro Systems公司;WYT-J 手持糖度折光儀,成都興晨光光學(xué)儀器有限公司;MC10000 離子濺射儀、SU8100 掃描電子顯微鏡,hitachi;WQF-520 傅里葉紅外變換光譜儀,北京瑞利分析儀器有限公司。

        1.3 靈武長棗果實品質(zhì)變化的測定

        1.3.1 硬度 從每組樣品中隨機選取10 個果實,削去果皮,沿長棗赤道部相對的兩個位置,通過TA-XT2i 質(zhì)構(gòu)儀,選用P2n 針狀探頭,以穿刺模式進行棗果硬度的測試。設(shè)置測試速度1 mm/s,返回速度5 mm/s,觸發(fā)點負載5 g,穿刺深度5 mm。

        1.3.2 可溶性固形物含量 用手持糖度折光儀測定可溶性固形物(soluble solids content,SSC)含量,取5.0 g 棗果果肉部分放入研缽中磨碎后,4 000 r/min 離心10 min,取上清液重復(fù)測定3 次。

        1.4 細胞壁成分的分離及測定

        參考Marwa 等[12]與曹建康等[13]的方法并稍作修改,分別提取靈武長棗細胞壁物質(zhì)中的水溶性果膠 (Water-soluble pectin,WSP)、螯合性果膠(CDTA-soluble pectin,CSP)、堿溶性果膠(sodium carbonate-soluble pectin,SSP)、纖維素(Cellulose,CE)和半纖維素(Hemicellulose,HC),詳細步驟如圖1。果膠含量采用咔唑法測定,半纖維素和纖維素含量采用蒽酮法測定[14]。

        圖1 細胞壁成分的分離提取步驟圖Fig.1 Step diagram of separation and extraction of cell wall components

        1.5 掃描電鏡觀察

        取貯藏初期與貯藏末期的靈武長棗果肉組織塊,組織塊面積不超過3 mm2,用PBS 輕輕漂洗樣本后迅速放入電鏡固定液中,室溫固定2 h。固定好的樣品經(jīng)0.1 mol/L 磷酸緩沖液PB(pH 7.4)漂洗6 次,每次15 min。然后將組織依次放入30%,50%,70%,90%,95%,100%,100%酒精溶液中進行脫水處理,每次15 min,再用乙酸異戊酯溶液處理15 min。然后將樣本放入臨界點干燥儀內(nèi)進行干燥,干燥后將樣本緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上,放入離子濺射儀樣品臺上進行30 s 噴金導(dǎo)電處理,最后在SU8100 掃描電子顯微鏡觀察采圖。

        1.6 傅里葉紅外(FT-IR)光譜

        采用KBr 壓片法,將200 mg 干燥好的KBr 與2 mg 樣品在紅外燈照射下于瑪瑙研缽中研磨至無明顯顆粒狀,取100 mg 研磨好的混合樣品,用HY-12 型油壓機壓制成薄膜,在傅里葉紅外光譜儀 (Fourier transform infrared spectroscopy,F(xiàn)TIR)上進行透射掃描,掃描波長范圍為4 000~400 cm-1,分辨率為4 cm-1。

        1.7 數(shù)據(jù)分析

        數(shù)據(jù)采用Origin 2019 軟件進行作圖和統(tǒng)計分析,用SPSS 進行差異顯著性分析(P<0.05 差異顯著,P<0.01 差異極顯著)和相關(guān)性分析,用Unscrambler 對光譜數(shù)據(jù)進行多變量統(tǒng)計分析。結(jié)果用3 次重復(fù)的平均值表示。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 硬度及可溶性固形物含量的變化

        硬度是反映果實品質(zhì)的重要參數(shù)之一,鮮食靈武長棗的硬度能反映其脆度的變化,是判定貯藏過程中質(zhì)地變化的重要指標(biāo)[15]。如圖2所示,靈武長棗在貯藏過程中,硬度呈現(xiàn)穩(wěn)定下降趨勢。在第4 天至第18 天貯藏時間內(nèi),各測量時間段硬度下降有顯著差異性(P<0.05),且在第10 天至第14天內(nèi)硬度下降趨勢最明顯,期間硬度下降了5.13 N,在貯藏后期下降緩慢,在貯藏25 d 后硬度為貯藏初期的84.77%。

        圖2 貯藏過程中靈武長棗硬度的變化Fig.2 Changes of hardness of Lingwu long jujube during storage

        可溶性固形物是反映果實成熟及生理變化的重要指標(biāo)。由圖3可知,隨貯藏時間的延長,靈武長棗果實內(nèi)SSC 含量有波動,呈現(xiàn)上升-下降-上升趨勢。從貯藏開始至第10 天,SSC 含量變化不顯著,貯藏后第7 天SSC 含量達到最高為27.07%,在第10 天至第14 天內(nèi)該含量下降趨勢最明顯(P<0.05)。這是由于在貯藏過程中,靈武長棗自身的新陳代謝活動不斷進行,伴隨著果實后熟與軟化的發(fā)生,前期果實呼吸消耗基質(zhì),后期淀粉水解為可溶性糖導(dǎo)致SSC 含量上升[16]。

        圖3 貯藏過程中靈武長棗可溶性固形物的變化Fig.3 Changes of soluble solids in Lingwu long jujube during storage

        2.2 細胞壁物質(zhì)含量變化

        果膠物質(zhì)、纖維素和半纖維素是構(gòu)成細胞壁骨架的重要物質(zhì),水溶性果膠WSP、螯合性果膠CSP 與堿溶性果膠SSP 主要存在于細胞壁中膠層中,保持細胞間內(nèi)聚力,在細胞間有粘連作用,CE被認為是果蔬細胞中最穩(wěn)定的聚合物,是形成細胞壁的機械基礎(chǔ)[17-18]。在靈武長棗貯藏期間內(nèi),細胞壁物質(zhì)含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在貯藏0~18 d,WSP 含量變化差異性顯著(P<0.05),在貯藏第18 天達到峰值598.96 mg/100 g FW。CSP、SSP、HC 及CE 含量在第14 天均出現(xiàn)拐點,之后開始不斷下降,其中CE 含量下降速度最快,第25天含量相比第14 天下降了28.40%。在酶的作用下,細胞壁果膠層不斷降解,原果膠轉(zhuǎn)化成為果膠多糖,HC、CE 降解使含量降低,WSP 含量不斷上升,破壞了細胞壁的結(jié)構(gòu)使果實不斷軟化。

        2.3 細胞壁物質(zhì)與硬度、可溶性固形物相關(guān)性分析

        由表1可知,靈武長棗果實硬度與SSC、WSP呈極顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.9638,-0.8862;SSC 與WSP 呈顯著負相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.8738;CSP 與SSP、HC 呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.8902,0.9172;SSP 與HC 呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.8500;HC 與CE 呈顯著正相關(guān),相關(guān)性系數(shù)為0.8027。說明棗果在采后貯藏過程中,硬度、SSC 與細胞壁組分之間有密切相關(guān)性,細胞壁組分的降解轉(zhuǎn)化使得棗果硬度下降,最終導(dǎo)致果實軟化。

        圖4 貯藏過程中靈武長棗細胞壁物質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of cell wall substance content of Lingwu long jujube during storage

        表1 靈武長棗貯藏期間細胞壁物質(zhì)與硬度、可溶性固形物相關(guān)性Table 1 Correlation between cell wall substances and hardness and soluble solids of Lingwu long jujube during storage

        2.4 微觀圖像分析

        對貯藏初期與貯藏末期的棗果組織塊分別進行電鏡掃描分析。結(jié)果顯示,貯藏初期(圖5a,5b)細胞分布呈現(xiàn)規(guī)則的蜂窩狀結(jié)構(gòu),此時細胞排列緊密,細胞結(jié)構(gòu)完整。貯藏末期(圖5c,5d)部分細胞發(fā)生腫脹彎曲變形,細胞分布呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀,細胞間出現(xiàn)空隙,變得松散。說明在貯藏過程中細胞壁成分結(jié)構(gòu)的改變使CE 降解,木葡聚糖發(fā)生斷裂,打破了纖維素-木葡聚糖的結(jié)構(gòu)及細胞壁整體結(jié)構(gòu),使細胞壁空隙增大。WSP 含量的上升,導(dǎo)致細胞壁發(fā)生膨脹作用,降低了細胞壁的剛度,使其結(jié)構(gòu)變得疏松多孔,進而降低了細胞間黏附,促進了細胞壁的解體[19]。這與前人在蘋果[20]、杏[21]、番茄[22]等中發(fā)現(xiàn)的規(guī)律一致。

        圖5 貯藏初期(a,b)與貯藏末期(c,d)電鏡掃描圖Fig.5 Scanning electron microscope images of early storage (a,b) and late storage (c,d)

        2.5 分子結(jié)構(gòu)特征分析

        傅里葉紅外光譜可以區(qū)分多糖的特征吸收峰以表征多糖分子結(jié)構(gòu)特征,在所測得的光譜數(shù)據(jù)中,1 800~800 cm-1包含有最有價值的光譜信息[23]。根據(jù)Kyomugasho 等[24]的研究發(fā)現(xiàn),可根據(jù)酯化與非酯化羧基的紅外波段特征之間的變化關(guān)系來判斷果實成熟過程中果膠酯化度的變化,甲基酯化度可根據(jù)果膠紅外光譜1 740 cm-1處的峰強度與1 740 cm-1和1 630 cm-1處的峰強度之和的比率來計算。圖6顯示了靈武長棗在貯藏初期與貯藏末期不同果膠組分的傅里葉紅外光譜。

        圖6 靈武長棗在貯藏初期與貯藏末期果膠物質(zhì)的傅里葉紅外光譜圖Fig.6 Fourier infrared spectra of pectin in Lingwu long jujube at the beginning and end of storage

        WSP 在貯藏前后酯化度從37.39%降到21.27%;在1 576 cm-1處有強吸收峰,表明有CO-O 鍵的存在;在1 414 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是C=O 雙鍵伸縮振動引起的;貯藏初期的1 043 cm-1處與貯藏末期的1 016 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為吡喃糖苷吸收峰,波峰的遷移說明WSP 中吡喃糖苷鍵在貯藏過程中發(fā)生了改變,也表明棗果的軟化與吡喃糖苷鍵有關(guān);貯藏初期的923 cm-1處與貯藏末期954 cm-1處的吸收峰主要是由吡喃環(huán)引起的非對稱環(huán)伸縮振動,波峰的遷移可能是由脫氧的鼠李糖末端次甲基的搖擺振動引起的。

        CSP 在貯藏前后酯化度從31.27%降到25.77%;貯藏初期在1 433 cm-1處有吸收峰,而貯藏末期卻沒有,說明在貯藏過程中CSP 鏈發(fā)生了改變,而這種變化可能與果膠組分之間的相互轉(zhuǎn)換有關(guān);1 300~1 400 cm-1處的吸收峰可能由C-O伸縮振動引起,在1 347 cm-1處的吸收峰表明CSP中存在烷烴;在1 297 cm-1處的吸收峰表明存在非對稱C-O-C 拉伸振動;在1 130 cm-1處的吸收峰表明CSP 中存在酯或內(nèi)酯;貯藏末期與貯藏初期相比,在1 200~1 010 cm-1之間的吸收峰減少,表明隨貯藏時間的延長,CSP 中吡喃基減少,推測該基團與棗果的軟化有關(guān)。

        SSP 果膠酯化度較低,在貯藏前后1 740~1 630 cm-1處的吸收峰沒有明顯變化;在1 604 cm-1處有強吸收峰,表明該果膠中存在C-O-O鍵;在1 433,1 414 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為C=O雙鍵伸縮振動吸收峰;在1 200~1 400 cm-1區(qū)間出現(xiàn)的吸收峰是由C-H 的變角振動所引起的;1 010~1 100 cm-1之間出現(xiàn)的吸收峰為吡喃糖苷吸收峰;909 cm-1處的吸收峰是由吡喃環(huán)的非對稱環(huán)伸縮振動引起的。

        總體來說,靈武長棗在25 d 貯藏期內(nèi),果膠組分結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生巨大變化,但貯藏末期果膠中的某些基團與貯藏初期相比,明顯減少。例如在貯藏末期,WSP 在1 576 cm-1附近C-O-O 特征峰、1 414 cm-1附近C=O 雙鍵伸縮振動峰均消失,據(jù)此推測貯藏后單糖組分與含量發(fā)生變化。這與前人的研究結(jié)果一致[25-26],表明貯藏過程中果實的軟化與果膠結(jié)構(gòu)和基團的破壞有密切關(guān)系。

        2.6 光譜降維分析

        利用PCA 方法對棗果樣本的傅里葉紅外光譜1 800~800 cm-1的數(shù)據(jù)進行降維分析,以突出多糖光譜之間的差異,樣品在坐標(biāo)軸間距離越大,則差異性越大[27]。如圖7所示,每個數(shù)據(jù)點代表1個光譜,在圖中分別顯示了PC1(貢獻率為73%)與PC2(貢獻率為17%)和PC3(貢獻率為9%)與PC2(貢獻率為17%)的得分圖,PC1、PC2、PC3 的累計貢獻率為99%,表明3 個PC 能夠反映原始數(shù)據(jù)信息[28]。SSP 的分數(shù)位于PC1 的負半軸,CSP的分數(shù)位于PC1 的正半軸,同時在PC1 上SSP(2)的分數(shù)幾乎為零。隨貯藏時間的變化,WSP 在PC1上得到了分離,WSP(1)在PC1 的負半軸,而WSP(2)在PC1 的正半軸。在兩幅圖中都可以沿著PC2線看到WSP 與CSP 的區(qū)別,WSP(1)、WSP(2)與PC2 呈明顯正相關(guān),CSP(1)、CSP(2)與PC2 呈明顯負相關(guān)。

        PC1 的載荷圖譜(圖7c)僅顯示負值,在1 604,1 393,1 132,1 064,987,808 cm-1附近有強烈的峰出現(xiàn),這些均符合果膠多糖光譜的特征,在1 064 cm-1處有最小負值,這主要是由多聚半乳糖醛酸中C-C、C=O 的伸縮振動和環(huán)振動引起的。PC2 在1 575 cm-1處出現(xiàn)了最大負值,這與果膠組分中WSP 的光譜最大特征相符。果膠組分在1 433與1 414 cm-1處均有特征吸收峰,但在PC 中得分均為負。

        圖7 貯藏初期(1)與貯藏末期(2)果膠物質(zhì)傅里葉紅外光譜的PCA 分析的得分圖(a、b)及載荷圖(c)Fig.7 Scores plots (a,b) and loadings plot (c) of PCA analysis of pectin in early storage (1) and late storage (2)

        3 討論與結(jié)論

        本文研究了冷藏(4 ℃)過程中靈武長棗硬度、可溶性固形物與細胞壁組分的變化規(guī)律,分析了長棗軟化機理。結(jié)果表明:隨著貯藏期的延長,細胞壁硬度不斷下降,在貯藏中期下降速率最快,貯藏末期硬度共下降了15.23%??扇苄怨绦挝锖吭谫A藏期內(nèi)不斷波動變化,但波動范圍不大,在貯藏后第7 天含量達到最高值為27.07%,在貯藏后第14 天含量達到最低值為25.95%。WSP 含量不斷上升,在貯藏期內(nèi)變化差異性顯著(P<0.05),在貯藏第18 天達到峰值598.96 mg/100 g FW。CSP、SSP、HC 及CE 含量先上升后下降,在第14 天均出現(xiàn)拐點,之后開始不斷下降。這主要與果實的自身代謝活動有關(guān),一方面果實呼吸消耗基質(zhì),使含量降低;另一方面在酶的作用下果膠間不斷轉(zhuǎn)化改變,使WSP 含量上升。根據(jù)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):果實硬度與SSC、WSP 呈極顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.9638,-0.8862,表明果實硬度與細胞壁WSP之間密切相關(guān)。

        貯藏過程中果肉細胞從排列緊密的蜂窩狀結(jié)構(gòu),發(fā)展到松散的有空隙結(jié)構(gòu),且膨脹彎曲。推斷主要是由細胞壁果膠間的降解轉(zhuǎn)化使WSP 含量升高所引起的。傅里葉紅外光譜分析表明,由于脫氧的鼠李糖末端次甲基的搖擺振動,貯藏初期923 cm-1處由吡喃環(huán)引起的波峰在貯藏末期發(fā)生遷移,導(dǎo)致WSP 中吡喃糖苷鍵在貯藏過程中發(fā)生了改變,分析得吡喃糖苷鍵是引起棗果軟化的主要因素。CSP 貯藏初期在1 433 cm-1處的吸收峰在貯藏末期消失,表明CSP 結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,這可能與細胞壁果膠的相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。

        綜上所述,在靈武長棗貯藏熟軟化過程中,果膠甲酯化程度降低,不溶性的果膠被降解為水溶性的果膠,導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,細胞壁硬度下降,進而導(dǎo)致果實軟化。

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