周 洋，管軍軍，路新開，冀旭陽

（1 河南工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院 鄭州 450001 2 河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 鄭州450001

大豆蛋白與磷脂是大豆制油后的主要副產(chǎn)品[1]。大豆蛋白按其蛋白含量主要分為大豆分離蛋白（SPI，蛋白＞90%干基）與大豆?jié)饪s蛋白（SPC，蛋白＞70%干基）[2]。SPI 蛋白含量高且基本接近純蛋白，可作為研究大豆蛋白功能特性的主要原料；SPI 由2S、7S、11S、和15S 蛋白組成，其中7S（β-伴球蛋白）和11S（大豆球蛋白）為主要成分，占總蛋白的80%左右[3]。7S 蛋白由α 亞基、α′亞基和β亞基通過疏水鍵形成三聚體，11S 則由酸性亞基A和堿性亞基B 組成，通過雙硫鍵和疏水作用形成六聚體結(jié)構(gòu)的球蛋白[4-5]。大豆中磷脂含量高，總磷脂中主要磷脂組分為磷脂酰膽堿（卵磷脂PC）、磷脂酰乙醇胺（腦磷脂PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酸（PA）、磷脂酰甘油（PG）等[6]。磷脂是大腦和神經(jīng)系統(tǒng)所必需成分，也是脂蛋白的主要成分，在脂類的轉(zhuǎn)運中起重要作用。

大豆蛋白是重要的植物蛋白，具有良好的水中分散性與兩親性（親水/親油），廣泛用于食品加工中[7]。大豆蛋白包含人體全部必需氨基酸，可滿足人體對蛋白質(zhì)的需求，具有保健作用[8]。其酶解產(chǎn)品/大豆肽是一種較好的運動營養(yǎng)食品[9-10]，為體育運動者快速提供營養(yǎng)補充。磷脂是細胞膜的基本成分，有很高的營養(yǎng)與醫(yī)學(xué)價值，可改善運動性疲勞，穩(wěn)定緊張情緒[11-12]。磷脂也是兩性物質(zhì)，可作為天然的表面活性劑，形成乳液，然而，其乳化穩(wěn)定性不如蛋白。研究發(fā)現(xiàn)磷脂與大豆蛋白形成復(fù)合乳液，可改善蛋白的乳化活性，同時增加磷脂的乳化穩(wěn)定性[13]，且磷脂的結(jié)合對改善大豆蛋白功能性有重要作用[14-15]。

關(guān)于磷脂與大豆蛋白形成的復(fù)合乳液中蛋白-磷脂聚集態(tài)及其復(fù)合乳液的液滴特性鮮有報道。本研究以酶解大豆蛋白與磷脂為主要原料，構(gòu)建運動營養(yǎng)食品體系，研究其形成聚集體及其復(fù)合乳液，以及靜態(tài)消化模型中復(fù)合乳液液滴特性與蛋白亞基的變化，為擴大這種復(fù)合乳液在運動營養(yǎng)食品中的應(yīng)用，分析其消化機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆，鄭州丹尼斯超市；大豆油，益海嘉里食品營銷有限公司；粉末磷脂，丙酮不溶物含量≥98%，鄭州四維科技有限公司；胃蛋白酶，10 000 NFU/mg，生工生物工程（上海）股份有限公司；化學(xué)試劑均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司等。

1.2 主要儀器

FA25 高剪切分散乳化機，德國FLUKO 公司；SHA-C 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，金壇華峰儀器有限公司；722N 可見分光光度計，上海精科實業(yè)有限公司；ZS90 型納米粒度及Zeta 電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；FD-1 型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；85-2 型恒溫磁力攪拌器，河南智城科技發(fā)展有限公司；JP-100A-2 高速多功能粉碎機，永康市久品工貿(mào)有限公司；DDS-11D 雷磁電導(dǎo)率儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；BH200 生物顯微鏡，舜宇光學(xué)科技集團有限公司。

1.3 酶解大豆蛋白（ESP）制備

大豆分離蛋白（SPI）的制備：根據(jù)參考文獻[16-17]所述方法，黃豆除雜粉碎過60 目篩后石油醚脫脂，加10 倍蒸餾水，攪拌1 h，2 mol/L NaOH調(diào)pH 值至8.0，50 ℃水浴攪拌1 h，5 000 r/min 離心35 min，取上清液，2 mol/L HCl 調(diào)pH 值至4.8，冰箱4 ℃冷藏8 h，5 000 r/min 離心30 min，取沉淀冷凍干燥后即得到大豆分離蛋白。

ESP 制備：根據(jù)參考文獻[18]適當(dāng)改進，將SPI與蒸餾水按質(zhì)量比1∶50 于錐形瓶中攪拌溶解，2 mol/L HCl 調(diào)pH 值至2，37 ℃水浴30 min，加入胃蛋白酶（酶∶SPI=1∶1 000，質(zhì)量比），進行酶解反應(yīng)，茚三酮比色法（570 nm）監(jiān)測反應(yīng)進度。60 ℃水浴30 min 結(jié)束酶解反應(yīng)，冷凍干燥后即得到ESP樣品。

1.4 酶解大豆蛋白-磷脂聚集體的制備

根據(jù)文獻[19-20]方法加以改進，ESP∶蒸餾水=1∶50 （質(zhì)量比） 于燒杯中溶解，2 mol/L NaOH調(diào)pH 值至7.0，一定質(zhì)量比加入磷脂，高剪切分散乳化機（20 000 r/min）均質(zhì)3 min，形成ESP-磷脂聚集體。

1.5 ESP-磷脂復(fù)合乳液及ESP 乳液的制備

ESP-磷脂復(fù)合乳液：取一定量的ESP 溶于蒸餾水中，2 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至7.0，磷脂加熱溶解于大豆油中，然后將三者混合，高剪切分散乳化機（20 000 r/min）均質(zhì)3 min。

ESP 乳液： 取一定量的ESP 溶于蒸餾水中，2 mol/L NaOH 調(diào)pH 值至7.0，加入大豆油，高剪切分散乳化機（20 000 r/min）均質(zhì)3 min。

1.6 胃消化模型的建立

參考文獻[21-22]建立胃消化模型，取200 mL乳液、0.16 g 胃蛋白酶及400 mL 胃液母液（組成：9.2 mL KCl 89.6 g/L，6.5 mL 質(zhì)量分數(shù)37%的HCl，3.0 mL NaH2PO488.8 g/L，10 mL NH4Cl 30.6 g/L，15.7 mL NaCl 175.3 g/L，18 mL CaCl222.7 g/L，10 mL 葡萄糖65 g/L，pH 1.3±0.2） 于錐形瓶中混勻，水浴（37 ℃）振蕩（60 r/min）模擬胃運動4 h。不同的消化時間點取樣，一部分直接進行相關(guān)測定，一部分冷凍干燥制成干粉備用，試驗重復(fù)3次。

1.7 電導(dǎo)率的測定

用電導(dǎo)儀對樣品進行電導(dǎo)率的測定，溫度設(shè)定為25 ℃。

1.8 粒徑與Zeta 電位的測定

參考Chanamai 等[23]的方法，稍有改動。用蒸餾水稀釋樣品至500 倍，取適量稀釋液于樣品槽中，溫度25 ℃，相對折射率設(shè)置為1.095（大豆油1.456 與水相1.33 的折射率之比），取3 次測量結(jié)果的平均值。

1.9 顯微觀察

吸取20 μL 樣品均勻涂于載玻片上，16×40倍光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.10 SDS-PAGE 單向電泳（1-DE）

稱取一定量的樣品溶于200 μL 蒸餾水中，加入樣品緩沖溶液 （0.25 mol/L Tris-HCl，pH=6.8、10% SDS、50% 甘油、0.5% BPB、5% β-巰基乙醇）200 μL。配制12%分離膠（pH=6.8，Tris-Hcl 溶液，30%丙烯酰胺、10%SDS、10%AP）和5%濃縮膠（pH=8.8，Tris-Hcl 溶液、30%丙烯酰胺、10%SDS、10%AP），待膠凝固后，15 μL 樣品液上樣。電壓300 V，濃縮膠電流10 mA，分離膠電流30 mA。電泳結(jié)束后考馬斯亮藍G250 染色。

1.11 ISO-DALT 雙向電泳（2-DE）

參考文獻[24]，[25]，第1 步等電聚焦在凝膠管（120 mm×1.5 mm） 中進行。凝膠液 （尿素、10%TritonX-100、28.38%丙烯酰胺溶液、2%兩性電解質(zhì)（pH=3～10）、10%AP、雙蒸水，10%TEMED）灌入凝膠管中，覆蓋液A（8 mol/L 尿素溶液）靜置1～2 h 后去除，加入20 μL 裂解液（5% β-疏基乙醇、20%曲拉通、9.5 mol/L 尿素、2%兩性電解液） 和少量雙蒸水靜置1～2 h 后去除，再加入20 μL 裂解液和NaOH 溶液。將凝膠管放在上槽為NaOH 溶液、下槽為H3PO4緩沖溶液的電泳槽中，200 V，30 min；300 V，30 min；400 V，60 min。取出凝膠管并去除裂解液和NaOH 溶液，20 μL 樣品液（同SDSPAGE 電泳制樣） 上樣并加覆蓋液B （9 mol/L 尿素，2%兩性電解液）10 μL 及NaOH 溶液；400 V，3 h；800 V，13 h；1 500 V，2 h。結(jié)束后取出膠條于平衡液中平衡2 h。

第2 步SDS-PAGE 電泳步驟同上述1.10 節(jié)。不同的是將平衡好的膠條平放在濃縮膠上，瓊脂糖凝膠固定，1 500 V，濃縮膠時電流40 mA，分離膠時電流70 mA。結(jié)束后硝酸銀法染色[26]。

1.12 數(shù)據(jù)分析

每組試驗重復(fù)3 次，用SAS9.2 軟件進行單因素和多因素方差分析，P＜0.05 時差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解大豆蛋白的選擇及其蛋白亞基分析

大豆蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解后，其自由氨基將增加，利用氨基與茚三酮顯色反應(yīng)可監(jiān)測酶解反應(yīng)的進度，進而反映蛋白的酶解程度。圖1a 為SPI酶解反應(yīng)過程中茚三酮比色法吸光度的變化。圖中顯示酶解30 min 前蛋白水溶液的吸光度逐漸增加，30 min 之后趨于平穩(wěn)，蛋白水溶液吸光度的變化反映了溶液中自由氨基含量，說明胃蛋白酶在30 min 前對蛋白作用明顯，使其酶解產(chǎn)生的氨基酸逐漸增多，30 min 后蛋白酶作用減弱，變化不明顯。

對不同酶解時間的蛋白進行SDS-PAGE 電泳顯示（圖1b），隨著酶解時間的延長，蛋白中7S和11S 蛋白亞基條帶逐漸變淺，尤其在30 min 前變化最明顯，與酶解0 min 的相比，30 min 之后的酸性和堿性亞基明顯減少。圖1b 顯示酶解4 h 之后，蛋白依然不能完全降解，可能是僅在酸性環(huán)境中，蛋白的酶切位點不能完全暴露。進一步對酶解30 min 的蛋白和SPI 單雙向電泳對比分析，如圖1c 顯示，單向電泳圖譜中酸性亞基的條帶減少，其余亞基條帶變淺，雙向電泳圖譜也顯示11S 亞基部位的蛋白點消失得較多，尤其是B 亞基。而7S 的亞基中pI=4 左右的蛋白點增多[27]。因此，本研究中大豆蛋白酶解時間控制在30 min，從而制取酶解蛋白樣品。

圖1 大豆蛋白酶解過程中茚三酮顯色反應(yīng)（a）、SDS-PAGE 電泳（b）及ISO-DALT 雙向電泳（c）圖譜Fig.1 Ninhydrin color reaction （a），SDS-PAGE electrophoresis （b） and ISO-DALT two-dimensional electrophoresis （c）during soybean proteolysis

一般來說，胃蛋白酶的活性位點芳香族氨基酸或酸性氨基酸形成的肽鍵。大豆蛋白含有人體全部必須氨基酸，其肽鍵中有適合胃酶降解的位點，但是本研究發(fā)現(xiàn)隨著酶解反應(yīng)的進行，亞基并沒有完全降解，尤其是7S 蛋白，根據(jù)酶解反應(yīng)空間位阻機理，這與蛋白活性位點在溶液中的暴露程度有關(guān)。胃酶最適反應(yīng)pH 2 左右，有研究表明，極端pH 值處理可誘導(dǎo)SPI 與11S 亞基部分解離，而對7S 亞基影響較小。在酸性環(huán)境中，大豆蛋白中11S 六聚體會解離成三聚體或單個亞基，多以7S 和3S 亞基存在[28]，因此胃蛋白酶反應(yīng)條件下，可促使大豆11S 蛋白解聚成7S 亞基或降解成更小的肽片斷、氨基酸等，而對于7S 蛋白的降解則影響有限。

2.2 酶解大豆蛋白-磷脂聚集體的液滴特性

圖2顯示的是不同比例的酶解蛋白與磷脂形成的聚集體放置不同時間的液滴變化。圖2a 表示的液滴電導(dǎo)率，即電荷流動難易程度。酶解蛋白與磷脂的比例在10∶1 以內(nèi)時電導(dǎo)率明顯較高 （P＜0.05），且放置4 h 后沒有明顯變化，而比例在10∶1 以上的聚集體溶液的電導(dǎo)率較低，放置4 h 后電導(dǎo)率更低。結(jié)果說明高濃度的蛋白會增加溶液的導(dǎo)電阻力。磷脂與蛋白通過疏水作用相結(jié)合[29]，酶解蛋白親水端暴露在表面，隨著蛋白量增加，理應(yīng)導(dǎo)電性越好，但當(dāng)酶解蛋白磷脂作用飽和后，其含量還持續(xù)增加，疏水基團也會增多，反而會增加導(dǎo)電阻力。

圖2 ESP-磷脂聚集體的電導(dǎo)率（a）、Zeta 電位（b）、粒徑（c）及顯微觀察（d）分析Fig.2 Analysis of conductivity （a），Zeta potential （b），particle size （c） and microscopic observation （d）of ESP-phospholipid aggregates particles

圖2b 顯示酶解蛋白與磷脂比例在5∶1 內(nèi)的溶液電位絕對值更大，與其它比例的差異顯著（P＜0.05），放置時間對溶液電位值無明顯作用。電位絕對值越大說明溶液越穩(wěn)定[30]。對不同比例的酶解蛋白磷脂聚集體溶液進行粒徑測定（圖2c）發(fā)現(xiàn)酶解蛋白與磷脂形成的聚集體的平均粒徑基本在410 nm 以內(nèi)，比例在10∶1 以內(nèi)的平均粒徑明顯要大一些（400 nm 左右，P＜0.05），而且隨放置時間的變化波動不大。再增加酶解蛋白與磷脂比例，測得聚集體的平均粒徑反而偏?。ǎ?90 nm）。

結(jié)合圖2a、2b、2c 發(fā)現(xiàn)，聚集體溶液的電導(dǎo)率、電位及粒徑基本表現(xiàn)一致，且隨著放置時間延長并沒有表現(xiàn)出較大的波動性，如圖中虛線框內(nèi)（10∶1 以內(nèi)）。不過，5∶1 以內(nèi)有更高的電位值（絕對值）?？紤]到酶解大豆蛋白親水性較強，磷脂更偏向親油性，且后續(xù)的工作要探討其作為壁材形成的O/W 型復(fù)合乳液，因此選用5∶1 酶解大豆蛋白-磷脂聚集體制備復(fù)合乳液。

另外，通過顯微觀察（圖2d）可以看出蛋白與磷脂的比例為5∶1 形成的液滴大小均一，排列較為致密。綜上結(jié)果說明酶解蛋白與磷脂的添加量為5∶1 時形成的聚集體溶液較穩(wěn)定。

2.3 酶解大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液的液滴特性

通常，油脂在乳液中暴露的越多，電導(dǎo)率越小。乳液中水相的添加量大于油相時，易形成O/W體系，當(dāng)油相被包埋的越多，體系電導(dǎo)率越大。以ESP-磷脂聚集體為壁材（添加量為5∶1），與大豆油形成復(fù)合乳液，研究油/水比例對于復(fù)合乳液液滴的影響。由圖3a 可知，油/水比例為1∶1 時，乳液電導(dǎo)率最大（P＜0.05），但此體系容易反相變?yōu)閃/O 型，油/水比例為1∶2 和1∶3 的乳液電導(dǎo)率相差不顯著，并結(jié)合O/W 體系穩(wěn)定性，本研究選擇油/水比例為1∶3 的乳液體系較佳。

圖3 ESP-磷脂復(fù)合乳液電導(dǎo)率（a）、復(fù)合乳液與ESP 乳液Zeta 電位（b）、粒徑（c）及顯微觀察（d）分析Fig.3 ESP-phospholipid composite emulsion conductivity （a），composite emulsion and ESP emulsion Zeta potential （b），particle size （d） and microscopic observation （d） analysis

圖3b、3c、3d 顯示的是以油/水比例1∶3 形成的酶解蛋白 （ESP）-磷脂復(fù)合乳液和ESP 乳液的液滴特性。由圖3b 可知復(fù)合乳液的電位絕對值整體偏?。≒＜0.05），說明形成的液滴帶電荷量不如ESP 乳液，其靜電排斥作用較弱；由于磷脂與ESP作用形成聚集體，很多帶電基團參與聚集體靜電力的形成，減少了液滴表面的負電荷。

圖3c 可以看出復(fù)合乳液液滴平均粒徑偏大（1 300 nm 左右，P＜0.05），且放置一定時間內(nèi)，沒有發(fā)生明顯變化。而ESP 乳液液滴平均粒徑偏?。?50 nm 左右），靜置1 h 后粒徑則迅速變大（接近1 200 nm）。結(jié)合乳液形成時的顯微圖（圖d）可知，復(fù)合乳液液滴偏大，且大小不均一，ESP 乳液偏小，且排列緊密。

大豆蛋白為球蛋白有一定的剛性，所以ESP為限制性水解大豆蛋白也具有一定的剛性，ESP與磷脂形成聚集體后仍然存在剛性，從而聚集體與油脂形成復(fù)合乳液時二者之間的位阻（即空間效應(yīng)） 較ESP 與油脂間的位阻大，這也決定了ESP-磷脂復(fù)合乳液的液滴粒徑較大。另一方面，由于ESP-磷脂復(fù)合乳液液滴表面電荷相對ESP乳液較少，液滴之間的靜電斥力也相對較小，形成復(fù)合乳液后的液滴則較ESP 乳液更易于聚集形成較大的液滴（圖3d），因此，復(fù)合乳液形成后液滴可快速聚集（＜10 min，圖3c）形成較穩(wěn)定的乳液體系。

2.4 基于胃消化模型的ESP-磷脂復(fù)合乳液的液滴特性

體外胃消化模型是研究食品在人體消化過程中組分變化及其體系穩(wěn)定性的便捷方法。由圖4a可知，復(fù)合乳液在胃消化過程中的電導(dǎo)率整體要高于ESP 乳液（P＜0.05），說明復(fù)合乳液中水相對油相的包裹性更好。隨著消化時間越長，乳液電導(dǎo)率均呈先增加后減小的趨勢，30 min 前，暴露的油滴與蛋白結(jié)合不緊密，受蛋白酶進一步酶解作用，部分油滴聚集上浮，使乳液中的油相減少，電導(dǎo)率增加。消化后期使油滴暴露的速度大于其聚集上浮的速度，則電導(dǎo)率略降低。

圖4 體外胃消化中乳液的電導(dǎo)率（a）、Zeta 電位（b）、粒徑（c）及顯微觀察（d）分析Fig.4 Analysis of conductivity （a），Zeta potential （b），particle size （c） and microscopic observation （d）of emulsion in vitro gastric digestion

圖4b 顯示了乳液消化4 h 內(nèi)的電位變化，可知乳液電位受胃液影響嚴(yán)重，胃液的添加使乳液的電位從負值短時間內(nèi)迅速變?yōu)檎担敢褐泻写罅康腍+，中和了蛋白的負電荷，前期試驗表明復(fù)合乳液攜帶負電荷較ESP 乳液少，中和胃液中H+的量較少，導(dǎo)致復(fù)合乳液在消化中的電位絕對值要高于ESP 乳液（P＜0.05，圖中虛線框內(nèi)數(shù)據(jù)）。但乳液進一步消化后，其電位值均有降低，說明胃蛋白酶對乳液中的酶解蛋白仍有一定作用。

圖4c 顯示乳液消化中的平均粒徑變化，可知無論復(fù)合乳液還是ESP 乳液，胃消化過程對其粒徑影響不大，但是復(fù)合乳液的平均粒徑明顯高于ESP 乳液（P＜0.05）。但結(jié)合圖4d 的乳液消化過程的顯微觀察，與ESP 乳液相比，復(fù)合乳液液滴的變化主要體現(xiàn)在液滴大小不均一、排列稀疏。說明胃液消化過程加速了復(fù)合乳液液滴的變化，使其聚集形成較大的液滴（如圖4d、方框1、2），或者形成粒徑較小的液滴（如圖4d、方框3）。而對于ESP 乳液，也發(fā)現(xiàn)類似情況。不過，兩種乳液顯微觀察與平均粒徑的數(shù)據(jù)有不一致的情況（圖4c、4d），這是由于粒徑數(shù)據(jù)表現(xiàn)的是乳液液滴整體的狀況，是平均水平，顯微觀察則表現(xiàn)的是局部細節(jié)，從而出現(xiàn)乳液平均粒徑在體外消化過程中變化不大，而在顯微觀察中有變化的情況。不過，二者（粒徑與顯微） 結(jié)合起來則能較好地從不同層面反映乳液液滴的真實狀況。

2.5 酶解大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液體外胃消化中蛋白亞基變化

對復(fù)合乳液和ESP 乳液在胃消化過程中蛋白質(zhì)的變化進一步分析，通過SDS-PAGE 單向電泳（圖5）可知乳液中的酶解蛋白在胃消化中進一步得到降解。與圖1b 顯示的結(jié)果對比可知單獨的蛋白被胃蛋白酶作用后不能完全被降解，但形成乳液后，蛋白的部分亞基能被完全降解。說明大豆蛋白乳化后更易被蛋白酶作用，乳化能促進大豆蛋白被胃酶降解。大豆蛋白發(fā)揮其乳化性能后，改變了其空間結(jié)構(gòu)，使蛋白的酶切位點暴露的更多。單向電泳顯示復(fù)合乳液在胃消化30 min 時，各亞基條帶明顯變淺，而ESP 乳液在消化30 min 時蛋白條帶變化并不明顯。單向電泳圖譜還可以看出，乳液消化前期蛋白的β 亞基沒有降解，反而略有增加，可能是11S 亞基受胃液環(huán)境影響部分降解為7S，而β 亞基不易被蛋白酶作用，故其不降反增。從圖中可知堿性亞基在胃消化過程也不能降解完全。

圖5 乳液SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis pattern of emulsion

雙向電泳圖譜（圖6）可知，復(fù)合乳液在消化30 min 后，能檢測到的蛋白點明顯減少，其中堿性亞基B 基本檢測不到，而ESP 乳液雖然在消化30 min 后仍然能檢測到較復(fù)合乳液較多的蛋白組分，但是也基本檢測不到堿性亞基B 組分；而到240 min 后，兩種乳液基本只能檢測到β 亞基。

圖6 乳液ISO-DALT 雙向電泳圖譜Fig.6 ISO-DALT two-dimensional electrophoresis pattern of emulsion

由單向電泳可知，胃消化過程中復(fù)合乳液中蛋白酶解主要發(fā)生在30 min 前，蛋白酶最先降解的是α、α′和酸性亞基A，然后是堿性亞基B，β 亞基基本不能降解；復(fù)合乳液中由于采用ESP-磷脂聚集體，前面的結(jié)果表明復(fù)合乳液中空間效應(yīng)較ESP 乳液明顯，因此復(fù)合乳液在胃消化過程中蛋白更易于暴露活性位點，從而增加聚集體中蛋白的降解速度。值得注意的是，堿性亞基B 消化30 min 后在單向電泳圖譜中能檢測出，但在雙向電泳中未能檢測到，這說明堿性亞基B 某些組分已降解，其它組分由于含量少，在雙向電泳中不能被檢測到。

2.6 體外胃消化中復(fù)合乳液液滴“自組裝”機理探討

大豆蛋白與磷脂，二者因具有親水/親油性常作為天然表面活性劑而用于食品體系中，由于其營養(yǎng)功能，也常用于運動營養(yǎng)食品中。大豆蛋白由于具有一定的剛性，且分子質(zhì)量較大，常以聚集態(tài)存在于溶液中，作為表面活性劑不利于快速移動至界面處，因此乳化活性較弱，但具有較好的乳化穩(wěn)定性；磷脂剛好與之相反，由于其分子質(zhì)量較小，便于快速移動至界面，具有較好乳化活性[31]；而且大豆蛋白兩親性中親水性較強，磷脂則親水性較弱；因此，大豆蛋白與磷脂作為壁材能較好的優(yōu)勢互補，形成較為穩(wěn)定的大豆蛋白-磷脂聚集體系。

為了降低大豆蛋白的剛性，本研究中采用酶解的方法加以前處理以增加蛋白分子的柔性。之所以采用胃蛋白酶，是因為可減少乳液中大豆蛋白在胃消化中受到胃蛋白酶的作用有可能影響乳液的穩(wěn)定性。而試驗的結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶對于大豆蛋白的前處理不能完全把蛋白中活性位點降解。不論是復(fù)合乳液還是酶解蛋白乳液，在體外胃消化中除β 亞基外，其它亞基基本被降解。但從液滴特性來看，由于復(fù)合乳液中引入了磷脂，其平均粒徑較酶解蛋白乳液（未加磷脂）大，但從粒徑變化分析，復(fù)合乳液的平均粒徑變化較小，因此乳液在重力場中有較好的穩(wěn)定性。

由于分析方法對液滴特性表現(xiàn)側(cè)重點不同，體外胃消化試驗中，受到胃蛋白酶降解的乳液蛋白液滴發(fā)生了一些變化，雖然在數(shù)值上平均粒徑波動不大，但是顯微觀察發(fā)現(xiàn)液滴受到不同程度的影響，尤其對于復(fù)合乳液更為明顯。綜合電導(dǎo)、電位及粒徑隨放置時間或體外胃消化時間的變化，整體來說，體外胃消化中復(fù)合乳液液滴的穩(wěn)定性要高于ESP 乳液。

對于大豆蛋白，胃蛋白酶處理大豆蛋白只能限制性降解蛋白，但酶解蛋白能與磷脂形成較為穩(wěn)定的聚集體，進而形成復(fù)合乳液后有較好的穩(wěn)定性。雖然蛋白在體外胃消化過程中受到了降解，但復(fù)合乳液整體穩(wěn)定性有所提升（電導(dǎo)率增加）。由此，可以推導(dǎo)復(fù)合乳液在體外胃消化中存在一個液滴“自組裝”過程。具體來說：復(fù)合乳液進入胃液后，由于pH 值突然降低，以至于其液滴表面電荷“由負變正”，且?guī)в懈嗟恼姾桑▓D4b），增加了液滴之間的靜電斥力，減少液滴之間的聚集，從而使復(fù)合乳液的穩(wěn)定性提高（圖4a）；隨著消化的進行，液滴壁材（ESP-磷脂聚集體）中蛋白被降解，表面電荷有所減少，靜電斥力相應(yīng)降低，加上胃消化中對乳液一定程度的“蠕動”（本研究中以振蕩代替），液滴“相互靠近”的可能性加大，當(dāng)液滴之間的距離降到一定程度后，由于蛋白的降解導(dǎo)致壁材一定程度的破壞，液滴中油脂會“暴露”出來，根據(jù)“同性相吸”原理，液滴由于“暴露”的油脂而“吸引”在一起，其結(jié)果是壁材“自組裝”形成新的聚集體將油脂重新包埋起來形成一個更大的液滴（如圖4d、方框1、2），或者將液滴“一分為二”形成較小的液滴（如圖4d、方框3）。在體外胃消化的后期，由于蛋白降解程度的提高，壁材的“強度”受到一定程度的影響，導(dǎo)致“包埋能力”下降，會有一部分油脂析出，最直接的表現(xiàn)就是電導(dǎo)率有所降低（圖4a）。當(dāng)然，以上只是根據(jù)試驗的結(jié)果進行的推理，具體情況還需要通過相關(guān)試驗加以驗證。

另一方面，試驗結(jié)果也表明，由于磷脂的加入，也加速了大豆蛋白類食品乳液于胃中蛋白的降解，進而有利于小腸中對于蛋白類營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。這為擴大大豆蛋白類食品乳化體系在運動營養(yǎng)食品中的應(yīng)用并闡明消化吸收機理提供一定的理論支撐。

3 結(jié)論

本研究以酶解大豆蛋白、磷脂為主要原料，對其聚集體及其復(fù)合乳液的液滴進行系統(tǒng)探討，結(jié)果如下：

1） 胃蛋白酶對大豆蛋白只能有限降解，在酶解30 min 后蛋白亞基變化不顯著，酶解4 h 后蛋白各亞基仍不能被完全降解。

2） 酶解蛋白與磷脂的質(zhì)量比為5∶1 時其聚集體具有較好的液滴特性（P＜0.05）；以該比例制備聚集體作為壁材，發(fā)現(xiàn)油相和水相的比例為1∶3 時可形成較為理想的水包油型乳化體系（P＜0.05）。

3） 復(fù)合乳液液滴平均粒徑及電位均高于酶解蛋白乳液（P＜0.05），但是在消化過程中液滴特性變化程度相較于酶解蛋白乳液要小。

4） 體外胃消化過程中，復(fù)合乳液的液滴特性（電導(dǎo)率、電位及平均粒徑）明顯高于酶解蛋白乳液（P＜0.05），但二者變化趨勢基本相同。

5） 體外胃消化過程中，復(fù)合乳液中的蛋白降解速度要大于酶解乳液，且除β 亞基外其余亞基均能被降解。

綜上所述，酶解蛋白-磷脂聚集體作為壁材形成復(fù)合乳液表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，但在體外胃消化過程中蛋白被降解，推導(dǎo)其在體外胃消化中存在液滴“自組裝”過程，這為擴大大豆蛋白類食品乳化體系在運動營養(yǎng)食品中的應(yīng)用如緩解運動性疲勞等，并闡明其消化吸收機理提供一定的理論支撐。