包曉瑋，魏晨業(yè)，劉曉祿，江峻峰，孫嘉莉，徐 均

（1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 烏魯木齊 830052 2 新疆沙棘精深加工工程技術(shù)研究中心 新疆克孜勒蘇柯?tīng)柨俗巫灾沃?845350）

近年來(lái)，惡性腫瘤發(fā)病率顯著增高，據(jù)了解，全球范圍內(nèi)約20%的男性和17%的女性具有一定的患癌風(fēng)險(xiǎn)[1]。在亞洲地區(qū)，癌癥死亡的人數(shù)占全球癌癥死亡總?cè)藬?shù)的50%，其中肝癌是現(xiàn)今較為多見(jiàn)的惡性腫瘤之一，患者自身的生命安全始終得不到有效保障。據(jù)2021年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，肝癌是全球第六大常見(jiàn)高發(fā)癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，僅次于肺癌和結(jié)直腸癌[2]，且惡性腫瘤具有早期診斷率低、臨床治愈率低的特點(diǎn)，尚無(wú)有效的治療方法。目前主要采用手術(shù)及放化療等手段進(jìn)行癌癥治療。此外，使用放療、化療等治療手段對(duì)人體產(chǎn)生的毒副作用較大，在治療過(guò)程中，藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別作用不強(qiáng)，在消除腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也損害了正常細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)病患后期的身心健康及生活質(zhì)量都造成重大的影響。探尋毒副作用小的有效抗腫瘤藥物，降低病患的惡性腫瘤死亡率，改善其生存質(zhì)量，已成為廣大醫(yī)學(xué)工作者亟待解決的問(wèn)題。多糖作為常見(jiàn)的天然活性物質(zhì)，成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。目前已報(bào)道香菇多糖[3]、槐角多糖[4]、板栗種仁多糖[5]等具有一定抗腫瘤作用，而有關(guān)沙棘多糖的相關(guān)研究并不多見(jiàn)。本文以人肝癌細(xì)胞（Hep-G2）為研究對(duì)象，探討沙棘多糖SBP-3 組分對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Hep-G2 人肝癌細(xì)胞，武漢普諾賽生命科技有限公司；CCK-8 試劑盒、DMEM 高糖培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone 公司；Annexin V-FITC 凋亡試劑盒，碧云天生物試劑公司；BCA 試劑盒，上海易色醫(yī)療科技有限公司；p-p38 抗體、MMP-2 抗體、MMP-9抗體，上海戶實(shí)醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IFD 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰有限公司；SC3614 高速離心機(jī)，中佳有限公司；UCTR30-2 倒置光學(xué)顯微鏡，上海普赫有限公司；HERACELL1150i 細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific 公司；Multiscan MK3 酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Scientific 公司；BG-Power 600i 電泳儀，北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘多糖SBP-3 的制備、分組及細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)魏晨業(yè)等[6]的研究方法，采用DEAE-52 纖維素柱分離純化，得到酸性多糖SBP-3。將沙棘多糖SBP-3 組分用不含血清的DEAE 培養(yǎng)基配成質(zhì)量濃度為0.625，1.25，2.5，5 mg/mL 和10 mg/mL的多糖組，以不加多糖的組作為空白對(duì)照組。

將凍存Hep-G2 細(xì)胞復(fù)蘇后，置于5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 CCK-8 法檢測(cè)Hep-G2 細(xì)胞增殖率 將Hep-G2 細(xì)胞按2×104個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，每孔90 μL，設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔。分別加入不同濃度的沙棘多糖溶液10 μL，使其終質(zhì)量濃度分別為62.5，125，250，500，1 000 μg/mL，培養(yǎng)24 h 和48 h 后，每孔加10 μL CCK-8，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培育4 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度OD 值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。計(jì)算公式[7]：

式中：OD1——含多糖樣品吸光度；OD2——不含多糖樣品吸光度。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Hep-G2 細(xì)胞的凋亡率按1.3.2 節(jié)方法處理Hep-G2 細(xì)胞，通過(guò)CCK-8試驗(yàn)選擇不同濃度沙棘多糖溶液作為凋亡試驗(yàn)的劑量，即用125，250，500 μg/mL 作用細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 和48 h 后，用PBS 溶液反復(fù)洗滌細(xì)胞，使其混合均勻，加入胰蛋白酶（不含EDTA）消化，觀察細(xì)胞是否從培養(yǎng)板壁上脫落。將0.5 mL 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，加入1.25 μL Annexin V-FITC混勻后加入10 μL PI，室溫避光反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)[8]。

1.3.4 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)Hep-G2 細(xì)胞遷移能力 將Hep-G2 細(xì)胞接種于6 孔板中，用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%后，用移液器吸頭將細(xì)胞垂直劃傷，用PBS 貼壁緩慢加入潤(rùn)洗，分別加入不同質(zhì)量濃度的沙棘多糖溶液（125，250，500 μg/mL）培養(yǎng)48 h 后，置于顯微鏡下觀察并拍照[9]。

1.3.5 Transwell 小室檢測(cè)Hep-G2 細(xì)胞侵襲能力 將Hep-G2 細(xì)胞接種于Transwell 板[10]，上室中加入含1%血清的細(xì)胞懸液100 μL，下室中加入500 μL 含15% FBS 的各濃度組培養(yǎng)液，放入37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h 后取出小室，用PBS 反復(fù)潤(rùn)洗后加入結(jié)晶紫染色5 min，清洗后用棉簽擦去內(nèi)側(cè)壞死細(xì)胞，隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)穿越小室的侵襲性細(xì)胞數(shù)目。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)p-p38、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平 按1.3.3 節(jié)方法處理Hep-G2 細(xì)胞，分別加入不同質(zhì)量濃度的沙棘多糖溶液（125，250，500 μg/mL）培養(yǎng)48 h，經(jīng)胰蛋白酶消化后，提取蛋白，用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量。通過(guò)SDS-PAGE 垂直板電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，放入5%脫脂奶粉封閉液中，封閉1 h，一抗孵育，將PVDF 膜放入稀釋好的 p-p38、MMP-2、MMP-9抗體中，4 ℃過(guò)夜。第2 天將PVDF 膜放入對(duì)應(yīng)的二抗中，室溫培養(yǎng)2 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，ECL 顯色，用凝膠成像分析儀系統(tǒng)拍照[11]，計(jì)算機(jī)掃描并分析處理結(jié)果。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用SPSS 20.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，圖、表采用origin 8.5 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 SBP-3 對(duì)Hep-G2 細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 法是一種準(zhǔn)確度和靈敏度較高且常用于測(cè)定細(xì)胞增殖的比色法[12]。由圖1可知，與空白組相比，Hep-G2 細(xì)胞經(jīng)SBP-3 各劑量組作用24 h，對(duì)其抑制率逐漸升高（P＜0.05）。當(dāng)SBP-3 質(zhì)量濃度升至1 000 μg/mL 時(shí)抑制效果最佳，達(dá)28.83%；經(jīng)SBP-3 各劑量組作用48 h，各組細(xì)胞抑制率也顯著升高（P＜0.01），其中SBP-3 質(zhì)量濃度為125，500 μg/mL 和1 000 μg/mL 時(shí)的抑制率分別為26.62%，27.3%和60.43%。以上結(jié)果說(shuō)明沙棘多糖SBP-3 組分在62.5～1 000 μg/mL 濃度范圍，能夠抑制Hep-G2 細(xì)胞的增殖，且抑制率隨其濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)。

2.2 SBP-3 對(duì)Hep-G2 細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)SBP-3 對(duì)Hep-G2 細(xì)胞增殖的作用結(jié)果，選擇125，250 μg/mL 和500 μg/mL 3 個(gè)質(zhì)量濃度梯度，作用24 h 和48 h 為Hep-G2 細(xì)胞的培養(yǎng)條件，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。與空白組相比，各SBP-3 濃度組均能誘導(dǎo)Hep-G2 細(xì)胞產(chǎn)生凋亡作用，且細(xì)胞凋亡率隨SBP-3 濃度的增加而逐漸升高。125 μg/mL SBP-3 作用24 h，細(xì)胞凋亡率為5.23%；500 μg/mL SBP-3 時(shí)細(xì)胞凋亡率最高為6.41%。當(dāng)作用時(shí)間48 h 時(shí)，細(xì)胞凋亡率極顯著上升（P＜0.01），當(dāng)SBP-3 多糖質(zhì)量濃度分別為125，250 μg/mL 和500 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別為31.68%，36.59%和37.32%。SBP-3 作用48 h 的效果明顯優(yōu)于24 h，最終選擇SBP-3 作用48 h 為后續(xù)試驗(yàn)條件。圖3中，Q1 表示壞死細(xì)胞；Q2 表示晚期凋亡細(xì)胞；Q3 表示早期凋亡細(xì)胞；Q4 表示正常細(xì)胞，Q2+Q3 表示凋亡細(xì)胞[13]。通過(guò)測(cè)定Hep-G2 細(xì)胞凋亡信號(hào)，發(fā)現(xiàn)48 h 內(nèi)沙棘多糖SBP-3 組分各劑量組凋亡細(xì)胞比例顯著增加，說(shuō)明SBP-3 能夠誘導(dǎo)Hep-G2 細(xì)胞的凋亡。

2.3 SBP-3 對(duì)Hep-G2 細(xì)胞遷移的影響

腫瘤細(xì)胞在不斷發(fā)育生長(zhǎng)的階段，當(dāng)其分化速度及遷移能力在短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)異常性變化時(shí)，轉(zhuǎn)化為惡性腫瘤的可能性急劇增加，將對(duì)人體的生命安全及治療產(chǎn)生巨大的危害，沙棘多糖SBP-3 對(duì)Hep-G2 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響可通過(guò)傷口愈合試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估[14]。單層Hep-G2 細(xì)胞覆蓋在6 孔板上，在匯合細(xì)胞層的中心形成具有尖端的傷口，中央傷口的恢復(fù)率表明Hep-G2 細(xì)胞的遷移能力。當(dāng)給予不同濃度的沙棘多糖SBP-3作用Hep-G2 細(xì)胞48 h，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。與未添加多糖的空白對(duì)照組相比，沙棘多糖SBP-3作用的各組Hep-G2 細(xì)胞的遷移能力隨其劑量的增加，得到不同程度地抑制，劃痕閉合范圍明顯減小。當(dāng)SBP-3 質(zhì)量濃度增到500 μg/mL 時(shí)，對(duì)Hep-G2 細(xì)胞的抑制效果最佳，細(xì)胞遷移率僅5.59%，即SBP-3 的刺激可以顯著減少遷移到聚碳酸酯膜下側(cè)的Hep-G2 細(xì)胞數(shù)量 （P＜0.01），這表明沙棘多糖SBP-3 組分呈劑量依賴性抑制Hep-G2 細(xì)胞的遷移。

2.4 SBP-3 對(duì)Hep-G2 細(xì)胞侵襲的影響

Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞侵襲的狀況，結(jié)果顯示：空白對(duì)照組HepG2 細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力[15]。培養(yǎng)48 h 后，可觀察到大量顏色深淺不一的HepG2 細(xì)胞，形狀為長(zhǎng)梭形，且分布十分密集（圖5a）。隨著SBP-3 藥物濃度的增加，細(xì)胞穿越小室基底膜的數(shù)量明顯減少，HepG2 細(xì)胞聚集的密度顯著降低，呈零星分散狀態(tài)，由此可判斷SBP-3 使HepG2 細(xì)胞侵襲穿透能力減弱（圖5b、5c、5d）。與空白對(duì)照組相比，經(jīng)SBP-3 作用的各劑量組侵襲細(xì)胞數(shù)量在48 h 內(nèi)顯著減少（P＜0.01，圖6），且呈劑量依賴性抑制Hep-G2 細(xì)胞侵襲，即SBP-3 濃度越大，侵襲細(xì)胞數(shù)越少，其中SBP-3 質(zhì)量濃度500 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞侵襲率僅為16.42%，抑制Hep-G2 轉(zhuǎn)移能力最佳。

2.5 SBP-3 對(duì)Hep-G2 細(xì)胞p-p38、MMP-2 及MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)Western blot 法測(cè)定SBP-3 對(duì)Hep-G2細(xì)胞p38MAPK 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白p-p38、MMP-2 及MMP-9 的表達(dá)[16]，結(jié)果表明，與空白對(duì)照Hep-G2 組相比，沙棘多糖SBP-3 各劑量組pp38、MMP-2 及MMP-9 表達(dá)水平隨SBP-3 濃度的增加而逐漸降低（P＜0.01），當(dāng)SBP-3 質(zhì)量濃度達(dá)500 μg/mL 時(shí)，下調(diào)蛋白表達(dá)的能力最強(qiáng)，說(shuō)明沙棘多糖SBP-3 能夠抑制p38 通路中p-p38、MMP-2 及MMP-9 的表達(dá)，初步推測(cè)SBP-3 呈劑量依賴性抑制p38 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而降低細(xì)胞的侵襲和遷移能力并誘導(dǎo)Hep-G2細(xì)胞凋亡。

3 討論

正常條件下，細(xì)胞增殖和凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，若此過(guò)程中出現(xiàn)平衡失調(diào)的狀態(tài)，則可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生和擴(kuò)散。腫瘤細(xì)胞的發(fā)展與多通道信號(hào)的傳遞密不可分[17]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated potein kinase，MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)連接并產(chǎn)生信號(hào)的常見(jiàn)通路之一[18]。p38 是MAPK 信號(hào)通路中重要的子系統(tǒng)，通常參與細(xì)胞整體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[19]，當(dāng)p38 蛋白在磷酸化后才能發(fā)揮其活性，即通過(guò)磷酸化形成pp38 對(duì)Hep-G2 細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲的調(diào)節(jié)。腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中由于未受到正常細(xì)胞的接觸抑制，進(jìn)而不斷地侵襲和排擠正常組織并突破底部基膜，當(dāng)其增殖到一定體積后，通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprot-einase，MMP），如IV 型膠原酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，促使轉(zhuǎn)移通路形成，最終形成繼發(fā)性腫瘤。通過(guò)提高基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprot-einase，MMP）表達(dá)水平，促使轉(zhuǎn)移通路形成，最終形成繼發(fā)性腫瘤。

p38MAPK 通路通過(guò)調(diào)節(jié)MMPs 的蛋白表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)的遷移和侵襲。首先激活p38 信號(hào)通路中相關(guān)磷酸化蛋白，其次增強(qiáng)下游如MMP-2 和MMP-9 等多個(gè)結(jié)合靶點(diǎn)的表達(dá)與活化。唐治蓉等[20]等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸多糖對(duì)Hela細(xì)胞中的p38 通路產(chǎn)生抑制作用，從而降低Hela細(xì)胞的遷移率。Zheng 等[21]發(fā)現(xiàn)紅豆杉多糖能夠下調(diào)MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)，改善黑色素瘤細(xì)胞的遷移及侵襲速率，即MMP-2 和MMP-9 主要參與腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程，提示抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)或抑制其活性可以預(yù)防腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[22]。本結(jié)果表明SBP-3 對(duì)Hep-G2 細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、轉(zhuǎn)移及侵襲具有一定的調(diào)節(jié)作用，推測(cè)可能通過(guò)下調(diào)p38 MAPK 通路的活性，降低MMP-2 和MMP-9 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)Hep-G2細(xì)胞遷移及侵襲能力產(chǎn)生抑制作用，具有一定的抗腫瘤作用。多糖對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)，即治療機(jī)制并非直接產(chǎn)生抗腫瘤作用，而是通過(guò)間接增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)，抑制腫瘤生長(zhǎng)、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移來(lái)實(shí)現(xiàn)的[23]。多糖的結(jié)構(gòu)在一定程度上能夠影響其生物活性，后續(xù)可從分子水平研究其作用機(jī)制，闡明多糖的構(gòu)效關(guān)系，用分子修飾等方法改善其活性，更深層次探討其作用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究表明沙棘多糖SBP-3 能夠抑制肝癌細(xì)胞Hep-G2 的增殖、凋亡、遷移和侵襲，初步推測(cè)是通過(guò)下調(diào)p38MAPK 信號(hào)通路活性，抑制MMP-2 和MMP-9 表達(dá)，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用。