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        基于虛擬篩選的酸性磷酸酶抑制劑及其抑制機理

        2022-10-24 07:13:04李穎暢李園園杜鳳霞儀淑敏勵建榮
        中國食品學(xué)報 2022年9期
        關(guān)鍵詞:內(nèi)源殘基槲皮素

        李穎暢,李園園,趙 楠,杜鳳霞,2,儀淑敏,勵建榮*

        (1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連 116034)

        酸性磷酸酶(ACP)屬于水解酶類,在酸性介質(zhì)(pH 5~6)中催化各種磷脂水解釋放磷酸單酯和無機磷酸鹽[1]。ACP 也是參與鮮味物質(zhì)IMP 的降解途徑中的關(guān)鍵酶[2],尋找ACP 抑制劑是保持水產(chǎn)品鮮味的主要措施。然而,利用傳統(tǒng)方法尋找ACP 抑制劑不僅低效、目標(biāo)范圍大,且試驗成本高,而采用虛擬篩選可以避免這一問題。虛擬篩選技術(shù)是利用計算機的高性能計算,對大型小分子數(shù)據(jù)庫進行分析,從中選可能的化合物[3]。虛擬篩選針對特定的靶標(biāo)或多個靶標(biāo),其具有很強的靶向性,且篩選得到的活性化合物具有針對性強、特異性高、毒副作用小和活性高等特點[4]。

        目前,通過虛擬篩選尋找抑制劑已取得許多成就。Lin 等[5]從中藥數(shù)據(jù)庫中篩選出HMG-COA還原酶的抑制劑,以期找到副作用更少、毒性更小的降血脂候選藥物。張倩等[6]從天然產(chǎn)物庫進行虛擬篩選,利用分子對接方法尋找蛋白酪氨酸磷酸酶1B 抑制劑,用于治療Ⅱ型糖尿病。Reithmeier等[7]從小分子數(shù)據(jù)庫中篩選出6 種化合物,作為抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP/ACP5)酶活抑制劑。上述研究說明通過分子對接和虛擬篩選的方法來尋找潛在的ACP 抑制劑是可行的。鑒于此,通過同源建模構(gòu)建ACP 蛋白結(jié)構(gòu),并以此為靶點,利用虛擬篩選,從中藥數(shù)據(jù)庫中尋找更加實用、安全和有效的ACP 抑制劑,然后,結(jié)合紫外吸收光譜、內(nèi)源熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜技術(shù)研究ACP 與抑制劑的作用機理,探究篩選出小分子與ACP 作用過程中的構(gòu)象變化。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料及試劑

        ACP 從海鱸魚肝中分離純化得到。十六烷二酸、苯甲酸、二氫白藜蘆醇和苯甲酸 (HPLC≥98%),四川省維克奇生物科技有限公司;酸性磷酸酶和總蛋白定量測試盒,南京建成生物工程研究所;醋酸鈉、冰醋酸,上海源葉生物科技有限公司。

        970CRT 熒光分光光度儀,上海精密儀器儀表有限公司;UV-2550 紫外-可見分光光度儀,島津儀器(蘇州)有限公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 同源建模及模型驗證 NCBI 數(shù)據(jù)庫(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)中下載三色魚的ACP 的氨基酸序列 (登錄號:AEV45926.1),將ACP 氨基酸序列提交到SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org) 網(wǎng)站進行ACP 蛋白酶的同源建模,構(gòu)建海鱸魚ACP 的晶體結(jié)構(gòu)[8],并將構(gòu)建好的ACP 的模型用拉氏構(gòu)象圖(Ramachandran plots)和SAVES v6.0(https://saves.mbi.ucla.edu)對模型進行質(zhì)量評估。SWISS-MODEL 是常用的同源建模的一種方法,它是利用已知蛋白的一段氨基酸序列預(yù)測未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)[9]。

        1.2.2 虛擬篩選 以同源建模得到的1nd6.1.A 蛋白為靶點虛擬海鱸魚ACP 的抑制劑。將建好的蛋白模型用Discovery Studio (DS)4.5 進行預(yù)處理,包括加氫、去雜原子、刪除水分子和修補非完整的氨基酸殘基等,最后用CHARMM(哈佛大學(xué)高分子力學(xué)化學(xué))固定對蛋白進行能量最小化,使該結(jié)構(gòu)能正確用于分子對接過程。利用DS4.5 的Define and Edit Binding Site 工具,通過PDB 位點記錄估算受體空腔或活性位點,預(yù)測配體結(jié)合位點[10]。中藥小分子取自TCSMP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform) 庫(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/index.php)。選取分子質(zhì)量小于500 的小分子進行添加氫原子和能量最小化(Minimize Ligand)操作,并用DS4.5 的LibDock 和CDOCKER 程序?qū)ζ溥M行篩選。篩選過程如下:

        首先采用LibDock 快速篩選方法 (LibDockfast)進行對接,選取對接得分(LibDockScore)前20%的小分子,再用LibDock 高質(zhì)量篩選方法(LibDock-high quality searching method) 與ACP蛋白進行對接,然后選取對接得分大于100 的小分子,最后采用CDOCKER 程序與所建的ACP 蛋白模型進行對接,選取得分大于50 的小分子進行購買及酶抑制活性測試。

        1.2.3 所篩選物質(zhì)對ACP 活性的抑制 ACP 酶活性為700 U/mL,蛋白質(zhì)含量為1.4 mg/mL(海鱸魚肝中分離純化得到,已達到電泳純)。取一定量的所篩選的小分子物質(zhì)溶液,加入ACP 酶液1 mL,用20 mmol/L NaAc-HAc 緩沖液[pH 5.0,含5 mmol/L β-巰基乙醇(ME)]稀釋。將小分子物質(zhì)與ACP 混合物混勻,4 ℃黑暗中反應(yīng)15 min。采用酸性磷酸酶(ACP)測試盒和總蛋白定量測試盒測定ACP 酶活和蛋白質(zhì)濃度。

        1.2.4 十六烷二酸對ACP 的內(nèi)源熒光光譜分析 十六烷二酸對ACP 的內(nèi)源熒光光譜分析根據(jù)Zhou 等[11]方法。十六烷二酸對ACP 的同步熒光光譜分析參考王曉霞等[12]方法。十六烷二酸對ACP的三維熒光光譜分析: 三維熒光光譜測定溶液配制過程同內(nèi)源熒光光譜。參數(shù)設(shè)置為狹縫寬度均為2.5 nm,掃描速度為60 000 nm/min,在激發(fā)波長為200~360,發(fā)射波長200~500 nm 范圍內(nèi)進行三維熒光掃描。

        1.2.5 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation,SD)表示,每組樣品最少重復(fù)3 次。用Origin 8.0 進行作圖。采用SPSS16.0 進行方差分析,當(dāng)P<0.05 認為數(shù)據(jù)差異顯著。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 同源建模結(jié)果及模型評價

        將查到的已知三色魚的ACP 蛋白的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL 網(wǎng)站進行同源建模,結(jié)果如表1所示。對于ACP,1nd6.1.A 的序列相似性最高為46%,GMQE 得分為0.71。序列相似性可以反映兩條序列的相似程度。GMQE 得分可以初步評價所建模型的質(zhì)量,GMQE 得分越高,表明模型的質(zhì)量越好。

        表1 ACP 蛋白的三維結(jié)構(gòu)及描述Table 1 Descriptions and structures of ACP protein models

        局部質(zhì)量圖1a,所建模型的大部分氨基酸得分都高于0.6,表明這個ACP 模型具有較好的質(zhì)量。QMEAN 的Z-score 得分可以反映蛋白結(jié)構(gòu)與所建模型結(jié)構(gòu)的一致性程度,以此評估模型的質(zhì)量[13]。通過QMEAN 得分可知,同源建模方法所建的ACP 蛋白模型的Z-score 得分大于-4.0,這表明所建的模型結(jié)構(gòu)是合理的。此外,在拉氏構(gòu)象圖(圖1b)顯示了ACP 所有氨基酸在處于最適區(qū)、允許區(qū)域、一般允許區(qū)域以及不允許區(qū)域的氨基酸數(shù)量占總量的百分比分別為90.0%,9.1%,0.7%和0.2%。由此也表明1nd6.1.A 模型具有很好的質(zhì)量,可作為進行虛擬篩選ACP 抑制劑的靶點。Hollingsworth 等[14]用同源建模的方法建立了HIV-1 的gp 120 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)并利用拉氏構(gòu)象圖以及ANOLEA 得分評價了所建模型質(zhì)量。史艷麗等[15]利用同源建模得到柞蠶小吐白水軟化病毒(Ap IV)3C 蛋白酶的三維模型并進行優(yōu)化,選用Profile-3D 和Ramanchandran Plot 進行評估。

        圖1 酸性磷酸酶(ACP)蛋白模型質(zhì)量評價結(jié)果Fig.1 Evaluation results of ACP protein models

        2.2 虛擬篩選結(jié)果

        虛擬篩選結(jié)果如表2所示。對于ACP 蛋白,篩選到7 個物質(zhì)。在評估了7 種化合物的對接分數(shù)、實用性和已知功能之后,選擇苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氫白藜蘆醇進行酶活抑制驗證,這4 種化合物來自草藥或者植物。苯甲酸是一種芳香酸類有機化合物[16],在某些植物的葉和莖中以游離酸的形式存在,低毒無味常用作食品添加劑,具有抑制細菌繁殖生長的作用。槲皮素是一種常見的黃酮類化合物,存在于多種蔬菜、水果和茶葉中,在生物學(xué)和藥理學(xué)方面發(fā)揮重要作用,如抗癌、抗氧化、抗病毒、抗動脈粥樣硬化和抗炎等活性[17]。十六烷二酸是用于人類血壓調(diào)節(jié)研究的一種中藥中間體,來源于白附子、椿皮、苦陳皮等。二氫白藜蘆醇具有較強的抗氧化性,它是一種典型的非黃酮類多酚,來源于珍貴中藥材石斛蘭,可用于治療急性胰腺炎和相關(guān)肺損傷[18]。因此,可以預(yù)見,它們應(yīng)用于食品上的潛力很大。

        表2 TCSMP 數(shù)據(jù)庫虛擬篩選ACP 抑制劑的結(jié)果Table 2 Virtual screening results for ACP of weever from the TCSMP database

        2.3 篩選物質(zhì)對ACP 活性的影響

        苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氫白藜蘆醇與ACP 的分子對接圖和對ACP 的抑制作用如圖2所示,由圖2可知苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氫白藜蘆醇對接在ACP 活性位點中心,它們與ACP 蛋白結(jié)合良好。苯甲酸對ACP 活性的抑制具有濃度依賴關(guān)系。隨著苯甲酸濃度的增加,ACP 的剩余酶活性持續(xù)降低。當(dāng)苯甲酸濃度處于0.3~1.2 mmol/L 范圍時,ACP 的酶活下降較慢,之后下降速度加快,當(dāng)苯甲酸濃度達到2.1 mmol/L 時,ACP的剩余酶活性僅為13.76%。在圖2B 中,當(dāng)槲皮素濃度范圍為2~12 mmol/L 時,ACP 剩余酶活隨著槲皮素濃度上升而下降,但當(dāng)槲皮素濃度為14 mmol/L 時,槲皮素對ACP 活性的抑制效果趨于穩(wěn)定,故而認為槲皮素對ACP 活性的最佳抑制濃度約為12 mmol/L。十六烷二酸對ACP 活性有很強的抑制作用,濃度越大,抑制效果越好,酶活性下降50%(IC50) 的十六烷二酸抑制濃度約為0.38 mmol/L。當(dāng)濃度達到0.7 mmol/L 時,ACP 的活性僅剩余3.16%。在二氫白藜蘆醇濃度為0.2~1.4 mmol/L 時,ACP 的剩余酶活性下降較慢。當(dāng)二氫白藜蘆醇濃度達到1.4 mmol/L 時,ACP 的剩余酶活性為40.29%。苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氫白藜蘆醇的IC50分別為1.42,6.03,0.38 和1.18 mmol/L,故而十六烷二酸對ACP 活性抑制效果最好,因此可以將其作為新的抑制劑進一步探究十六烷二酸與ACP 蛋白的相互作用。

        圖2 苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸和二氫白藜蘆醇對ACP 活性的影響及對接圖Fig.2 Effects of benzoic acid,quercetin,hexadecanoic acid and dihydroresveratrol on ACP activity and docking diagram

        2.4 十六烷二酸與ACP 相互作用的機制

        2.4.1 十六烷二酸對ACP 內(nèi)源熒光光譜的影響 在280 nm 左右的激發(fā)波長下,蛋白質(zhì)中的內(nèi)源熒光基團包括酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基,對蛋白的微環(huán)境非常敏感[19],通過熒光分子中熒光基團的信息可以反映蛋白的結(jié)構(gòu)變化。如果酪氨酸和色氨酸殘基接近羰基或離子化,使蛋白熒光強度降低[20]。

        十六烷二酸對ACP 內(nèi)源熒光光譜的影響如圖3a 所示。隨著十六烷二酸濃度的增加,ACP 的內(nèi)源熒光強度不斷降低,但當(dāng)十六烷二酸濃度大于0.6 mmol/L 后,內(nèi)源熒光強度的降低幅度趨于緩慢。0.8 mmol/L 十六烷二酸處理后,ACP 蛋白殘基的熒光強度為原酶熒光強度的42.3%。熒光猝滅可能是由于酪氨酸和色氨酸氧化的影響[21]。最大熒光發(fā)射峰可以反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的程度[22]。ACP 蛋白熒光紅移越大,在變性過程中的三級構(gòu)象變化越大。在圖3b,ACP 蛋白的最大發(fā)射波長發(fā)生紅移,最大熒光發(fā)射峰從333.6 nm 移動到336.6 nm。這是因為十六烷二酸與ACP 相互作用,導(dǎo)致ACP 的色氨酸和酪氨酸殘基折疊而向極性環(huán)境偏移,致使熒光基團周圍的微環(huán)境改變,酶蛋白的三級結(jié)構(gòu)改變,最大發(fā)射波長多數(shù)發(fā)生紅移。

        圖3 十六烷二酸對ACP 內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.3 Effect of various concentrations hexadecanedioic acid on intrinsic fluorescence emission spectrum of ACP

        2.4.2 十六烷二酸對ACP 同步熒光光譜的影響 同步熒光光譜可以提供熒光基團構(gòu)象的變化,具有窄化譜帶、簡化光譜和較少光譜重疊等優(yōu)勢[23]。通常情況,Δλ 設(shè)為15 nm 時,顯示ACP 中酪氨酸(Tyr) 殘基的熒光光譜特性;Δλ 設(shè)為60 nm時,反映ACP 中色氨酸(Trp)殘基的特征熒光光譜特性[24]。十六烷二酸與ACP 相互作用的同步熒光光譜如圖4所示,加入十六烷二酸后,ACP 的酪氨酸和色氨酸代表的發(fā)射峰強度均降低。隨著十六烷二酸濃度的提高,ACP 的兩個熒光吸收峰均不斷猝滅。表明十六烷二酸改變了ACP 蛋白質(zhì)熒光基團殘基微環(huán)境,蛋白二級結(jié)構(gòu)變得疏松,極性增加,疏水性減小[25]。這與內(nèi)源熒光光譜所測結(jié)果一致。

        圖4 十六烷二酸與ACP 的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous flourescence spectra of hexadecanedioic acid and ACP

        2.4.3 十六烷二酸與ACP 三維熒光 三維熒光的光譜數(shù)據(jù)相比二維熒光光譜,具有更多的坐標(biāo)點,故而三維熒光顯示的信息更精準(zhǔn),選擇性更高。圖5為ACP 和十六烷二酸與ACP 體系的三維熒光圖及剖面圖,“山脊” 狀的Peak a 和Peak b是典型的瑞利散射峰 (λex=λem)?!榜劮濉?狀的Peak1 和Peak2 是常見的熒光峰(2λex=λem)分別代表酪氨酸和色氨酸殘基的光譜特征[26]。當(dāng)十六烷二酸與ACP 相互作用后,Peak1 和Peak2 的熒光強度明顯降低,同時峰位發(fā)生紅移,表明十六烷二酸的加入使ACP 的酪氨酸和色氨酸殘基周圍的微環(huán)境極性發(fā)生變化,親水性增強,疏水性減小。十六烷二酸對ACP 的肽鏈骨架結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響,Peak a 的熒光強度在加入十六烷二酸后略有下降,說明十六烷二酸與ACP 結(jié)合后使ACP 蛋白發(fā)生解聚作用,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分散、粒徑變小,造成ACP 熒光強度降低。這與熒光光譜和同步熒光光譜的結(jié)果相對應(yīng)。

        圖5 十六烷二酸與ACP 相互作用前(a 和b)后(c 和d)的三維熒光光譜Fig.5 The three-dimensional fluorescence spectra of ACP and hexadecanedioic acid before (a and b)and after (c and d) reaction

        2.5 十六烷二酸對ACP 分子對接模擬

        配體-蛋白質(zhì)相互作用可通過DS4.5 進一步分析。十六烷二酸與ACP 的相互作用如圖6所示,發(fā)現(xiàn)其與ACP 蛋白酶的活性區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸形成了多種相互作用,如傳統(tǒng)氫鍵、電荷相互作用和范德華力等。由圖6的十六烷二酸與ACP 相互作用的分子對接模擬圖及氨基酸殘基的2D 和3D 示意圖可知,十六烷二酸的小分子對接在ACP蛋白的活性中心位置,同時2D 圖顯示了十六烷二酸與ACP 結(jié)合作用貢獻較大的氨基酸殘基,其中十六烷二酸與ARG99 和LYS223 氨基酸殘基之間存在氫鍵作用力 (Conventional hydrogen bond)。十六烷二酸與HIS 278、ILF 38、TRP 194、ASP 79、LYS 226、TYR 299、ARG 35 等氨基酸殘基之間存在范德華作用力(Van der Waals),這說明十六烷二酸與ACP 通過多種作用力穩(wěn)定結(jié)合且氫鍵和范德華力是結(jié)合反應(yīng)的主要作用力。通過分子對接和熒光技術(shù),十六烷二酸與ACP 基于氫鍵和范德華相互作用的酸性磷酸酶結(jié)合,從而導(dǎo)致酸性磷酸酶的靜態(tài)猝滅[27]。因此推測,在這個氫鍵復(fù)合體中,力占主導(dǎo)地位。

        圖6 分子對接分析配體-蛋白相互作用Fig.6 Analysis of ligand-protein interactions by molecular docking

        3 結(jié)論

        1) 通過將ACP 蛋白的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL 中進行同源建模,并用QMEAN 方法以及拉氏構(gòu)象圖對所建蛋白模型進行質(zhì)量評價,發(fā)現(xiàn)所建的1nd6.1.A 模型的質(zhì)量較好,打分高,作為進行虛擬篩選抑制劑的靶點。

        2) 進行ACP 的虛擬篩選后,選取LibDock Score 和-CDOCKER ENERGY 打分較高的小分子,篩選了7 個小分子物質(zhì)。選取實用性強的4 種物質(zhì)進行ACP 活性抑制驗證發(fā)現(xiàn),苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氫白藜蘆醇對ACP 酶活都具有很強的抑制作用,其半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.42,6.03,0.38 和1.18 mmol/L。

        3) 選取抑制酶活性最強的十六烷二酸檢驗其對ACP 結(jié)構(gòu)的影響。十六烷二酸與ACP 結(jié)合后,導(dǎo)致酶的內(nèi)源熒光強度下降,最大發(fā)射波長發(fā)生紅移。同步熒光光譜表明,十六烷二酸使ACP的色氨酸(Try)殘基附近微環(huán)境極性增大,親水性增強,導(dǎo)致ACP 的構(gòu)象改變。三維熒光光譜法分析可知,十六烷二酸對ACP 的熒光強度產(chǎn)生猝滅,證明了十六烷二酸改變熒光分子的周圍微環(huán)境極性,進一步證實了ACP 二級結(jié)構(gòu)的變化。

        4) 分子對接模擬表明,十六烷二酸分子對接在ACP 的活性中心,結(jié)合作用力有氫鍵、電荷相互作用和范德華力,闡明了十六烷二酸對ACP 的作用機理。

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