李穎暢，李園園，趙 楠，杜鳳霞，2，儀淑敏，勵(lì)建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連 116034）

酸性磷酸酶（ACP）屬于水解酶類，在酸性介質(zhì)（pH 5～6）中催化各種磷脂水解釋放磷酸單酯和無機(jī)磷酸鹽[1]。ACP 也是參與鮮味物質(zhì)IMP 的降解途徑中的關(guān)鍵酶[2]，尋找ACP 抑制劑是保持水產(chǎn)品鮮味的主要措施。然而，利用傳統(tǒng)方法尋找ACP 抑制劑不僅低效、目標(biāo)范圍大，且試驗(yàn)成本高，而采用虛擬篩選可以避免這一問題。虛擬篩選技術(shù)是利用計(jì)算機(jī)的高性能計(jì)算，對(duì)大型小分子數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，從中選可能的化合物[3]。虛擬篩選針對(duì)特定的靶標(biāo)或多個(gè)靶標(biāo)，其具有很強(qiáng)的靶向性，且篩選得到的活性化合物具有針對(duì)性強(qiáng)、特異性高、毒副作用小和活性高等特點(diǎn)[4]。

目前，通過虛擬篩選尋找抑制劑已取得許多成就。Lin 等[5]從中藥數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出HMG-COA還原酶的抑制劑，以期找到副作用更少、毒性更小的降血脂候選藥物。張倩等[6]從天然產(chǎn)物庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，利用分子對(duì)接方法尋找蛋白酪氨酸磷酸酶1B 抑制劑，用于治療Ⅱ型糖尿病。Reithmeier等[7]從小分子數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出6 種化合物，作為抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP/ACP5）酶活抑制劑。上述研究說明通過分子對(duì)接和虛擬篩選的方法來尋找潛在的ACP 抑制劑是可行的。鑒于此，通過同源建模構(gòu)建ACP 蛋白結(jié)構(gòu)，并以此為靶點(diǎn)，利用虛擬篩選，從中藥數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找更加實(shí)用、安全和有效的ACP 抑制劑，然后，結(jié)合紫外吸收光譜、內(nèi)源熒光光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜技術(shù)研究ACP 與抑制劑的作用機(jī)理，探究篩選出小分子與ACP 作用過程中的構(gòu)象變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

ACP 從海鱸魚肝中分離純化得到。十六烷二酸、苯甲酸、二氫白藜蘆醇和苯甲酸 （HPLC≥98%），四川省維克奇生物科技有限公司；酸性磷酸酶和總蛋白定量測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；醋酸鈉、冰醋酸，上海源葉生物科技有限公司。

970CRT 熒光分光光度儀，上海精密儀器儀表有限公司；UV-2550 紫外-可見分光光度儀，島津儀器（蘇州）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 同源建模及模型驗(yàn)證 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）中下載三色魚的ACP 的氨基酸序列 （登錄號(hào)：AEV45926.1），將ACP 氨基酸序列提交到SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org） 網(wǎng)站進(jìn)行ACP 蛋白酶的同源建模，構(gòu)建海鱸魚ACP 的晶體結(jié)構(gòu)[8]，并將構(gòu)建好的ACP 的模型用拉氏構(gòu)象圖（Ramachandran plots）和SAVES v6.0（https：//saves.mbi.ucla.edu）對(duì)模型進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。SWISS-MODEL 是常用的同源建模的一種方法，它是利用已知蛋白的一段氨基酸序列預(yù)測(cè)未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)[9]。

1.2.2 虛擬篩選 以同源建模得到的1nd6.1.A 蛋白為靶點(diǎn)虛擬海鱸魚ACP 的抑制劑。將建好的蛋白模型用Discovery Studio （DS）4.5 進(jìn)行預(yù)處理，包括加氫、去雜原子、刪除水分子和修補(bǔ)非完整的氨基酸殘基等，最后用CHARMM（哈佛大學(xué)高分子力學(xué)化學(xué)）固定對(duì)蛋白進(jìn)行能量最小化，使該結(jié)構(gòu)能正確用于分子對(duì)接過程。利用DS4.5 的Define and Edit Binding Site 工具，通過PDB 位點(diǎn)記錄估算受體空腔或活性位點(diǎn)，預(yù)測(cè)配體結(jié)合位點(diǎn)[10]。中藥小分子取自TCSMP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform） 庫(kù)（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/index.php）。選取分子質(zhì)量小于500 的小分子進(jìn)行添加氫原子和能量最小化（Minimize Ligand）操作，并用DS4.5 的LibDock 和CDOCKER 程序?qū)ζ溥M(jìn)行篩選。篩選過程如下：

首先采用LibDock 快速篩選方法 （LibDockfast）進(jìn)行對(duì)接，選取對(duì)接得分（LibDockScore）前20%的小分子，再用LibDock 高質(zhì)量篩選方法（LibDock-high quality searching method） 與ACP蛋白進(jìn)行對(duì)接，然后選取對(duì)接得分大于100 的小分子，最后采用CDOCKER 程序與所建的ACP 蛋白模型進(jìn)行對(duì)接，選取得分大于50 的小分子進(jìn)行購(gòu)買及酶抑制活性測(cè)試。

1.2.3 所篩選物質(zhì)對(duì)ACP 活性的抑制 ACP 酶活性為700 U/mL，蛋白質(zhì)含量為1.4 mg/mL（海鱸魚肝中分離純化得到，已達(dá)到電泳純）。取一定量的所篩選的小分子物質(zhì)溶液，加入ACP 酶液1 mL，用20 mmol/L NaAc-HAc 緩沖液[pH 5.0，含5 mmol/L β-巰基乙醇（ME）]稀釋。將小分子物質(zhì)與ACP 混合物混勻，4 ℃黑暗中反應(yīng)15 min。采用酸性磷酸酶（ACP）測(cè)試盒和總蛋白定量測(cè)試盒測(cè)定ACP 酶活和蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 十六烷二酸對(duì)ACP 的內(nèi)源熒光光譜分析 十六烷二酸對(duì)ACP 的內(nèi)源熒光光譜分析根據(jù)Zhou 等[11]方法。十六烷二酸對(duì)ACP 的同步熒光光譜分析參考王曉霞等[12]方法。十六烷二酸對(duì)ACP的三維熒光光譜分析： 三維熒光光譜測(cè)定溶液配制過程同內(nèi)源熒光光譜。參數(shù)設(shè)置為狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度為60 000 nm/min，在激發(fā)波長(zhǎng)為200～360，發(fā)射波長(zhǎng)200～500 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行三維熒光掃描。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD）表示，每組樣品最少重復(fù)3 次。用Origin 8.0 進(jìn)行作圖。采用SPSS16.0 進(jìn)行方差分析，當(dāng)P＜0.05 認(rèn)為數(shù)據(jù)差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 同源建模結(jié)果及模型評(píng)價(jià)

將查到的已知三色魚的ACP 蛋白的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL 網(wǎng)站進(jìn)行同源建模，結(jié)果如表1所示。對(duì)于ACP，1nd6.1.A 的序列相似性最高為46%，GMQE 得分為0.71。序列相似性可以反映兩條序列的相似程度。GMQE 得分可以初步評(píng)價(jià)所建模型的質(zhì)量，GMQE 得分越高，表明模型的質(zhì)量越好。

表1 ACP 蛋白的三維結(jié)構(gòu)及描述Table 1 Descriptions and structures of ACP protein models

局部質(zhì)量圖1a，所建模型的大部分氨基酸得分都高于0.6，表明這個(gè)ACP 模型具有較好的質(zhì)量。QMEAN 的Z-score 得分可以反映蛋白結(jié)構(gòu)與所建模型結(jié)構(gòu)的一致性程度，以此評(píng)估模型的質(zhì)量[13]。通過QMEAN 得分可知，同源建模方法所建的ACP 蛋白模型的Z-score 得分大于-4.0，這表明所建的模型結(jié)構(gòu)是合理的。此外，在拉氏構(gòu)象圖（圖1b）顯示了ACP 所有氨基酸在處于最適區(qū)、允許區(qū)域、一般允許區(qū)域以及不允許區(qū)域的氨基酸數(shù)量占總量的百分比分別為90.0%，9.1%，0.7%和0.2%。由此也表明1nd6.1.A 模型具有很好的質(zhì)量，可作為進(jìn)行虛擬篩選ACP 抑制劑的靶點(diǎn)。Hollingsworth 等[14]用同源建模的方法建立了HIV-1 的gp 120 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)并利用拉氏構(gòu)象圖以及ANOLEA 得分評(píng)價(jià)了所建模型質(zhì)量。史艷麗等[15]利用同源建模得到柞蠶小吐白水軟化病毒（Ap IV）3C 蛋白酶的三維模型并進(jìn)行優(yōu)化，選用Profile-3D 和Ramanchandran Plot 進(jìn)行評(píng)估。

圖1 酸性磷酸酶（ACP）蛋白模型質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果Fig.1 Evaluation results of ACP protein models

2.2 虛擬篩選結(jié)果

虛擬篩選結(jié)果如表2所示。對(duì)于ACP 蛋白，篩選到7 個(gè)物質(zhì)。在評(píng)估了7 種化合物的對(duì)接分?jǐn)?shù)、實(shí)用性和已知功能之后，選擇苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氫白藜蘆醇進(jìn)行酶活抑制驗(yàn)證，這4 種化合物來自草藥或者植物。苯甲酸是一種芳香酸類有機(jī)化合物[16]，在某些植物的葉和莖中以游離酸的形式存在，低毒無味常用作食品添加劑，具有抑制細(xì)菌繁殖生長(zhǎng)的作用。槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，存在于多種蔬菜、水果和茶葉中，在生物學(xué)和藥理學(xué)方面發(fā)揮重要作用，如抗癌、抗氧化、抗病毒、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗炎等活性[17]。十六烷二酸是用于人類血壓調(diào)節(jié)研究的一種中藥中間體，來源于白附子、椿皮、苦陳皮等。二氫白藜蘆醇具有較強(qiáng)的抗氧化性，它是一種典型的非黃酮類多酚，來源于珍貴中藥材石斛蘭，可用于治療急性胰腺炎和相關(guān)肺損傷[18]。因此，可以預(yù)見，它們應(yīng)用于食品上的潛力很大。

表2 TCSMP 數(shù)據(jù)庫(kù)虛擬篩選ACP 抑制劑的結(jié)果Table 2 Virtual screening results for ACP of weever from the TCSMP database

2.3 篩選物質(zhì)對(duì)ACP 活性的影響

苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氫白藜蘆醇與ACP 的分子對(duì)接圖和對(duì)ACP 的抑制作用如圖2所示，由圖2可知苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氫白藜蘆醇對(duì)接在ACP 活性位點(diǎn)中心，它們與ACP 蛋白結(jié)合良好。苯甲酸對(duì)ACP 活性的抑制具有濃度依賴關(guān)系。隨著苯甲酸濃度的增加，ACP 的剩余酶活性持續(xù)降低。當(dāng)苯甲酸濃度處于0.3～1.2 mmol/L 范圍時(shí)，ACP 的酶活下降較慢，之后下降速度加快，當(dāng)苯甲酸濃度達(dá)到2.1 mmol/L 時(shí)，ACP的剩余酶活性僅為13.76%。在圖2B 中，當(dāng)槲皮素濃度范圍為2～12 mmol/L 時(shí)，ACP 剩余酶活隨著槲皮素濃度上升而下降，但當(dāng)槲皮素濃度為14 mmol/L 時(shí)，槲皮素對(duì)ACP 活性的抑制效果趨于穩(wěn)定，故而認(rèn)為槲皮素對(duì)ACP 活性的最佳抑制濃度約為12 mmol/L。十六烷二酸對(duì)ACP 活性有很強(qiáng)的抑制作用，濃度越大，抑制效果越好，酶活性下降50%（IC50） 的十六烷二酸抑制濃度約為0.38 mmol/L。當(dāng)濃度達(dá)到0.7 mmol/L 時(shí)，ACP 的活性僅剩余3.16%。在二氫白藜蘆醇濃度為0.2～1.4 mmol/L 時(shí)，ACP 的剩余酶活性下降較慢。當(dāng)二氫白藜蘆醇濃度達(dá)到1.4 mmol/L 時(shí)，ACP 的剩余酶活性為40.29%。苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氫白藜蘆醇的IC50分別為1.42，6.03，0.38 和1.18 mmol/L，故而十六烷二酸對(duì)ACP 活性抑制效果最好，因此可以將其作為新的抑制劑進(jìn)一步探究十六烷二酸與ACP 蛋白的相互作用。

圖2 苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸和二氫白藜蘆醇對(duì)ACP 活性的影響及對(duì)接圖Fig.2 Effects of benzoic acid，quercetin，hexadecanoic acid and dihydroresveratrol on ACP activity and docking diagram

2.4 十六烷二酸與ACP 相互作用的機(jī)制

2.4.1 十六烷二酸對(duì)ACP 內(nèi)源熒光光譜的影響 在280 nm 左右的激發(fā)波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)中的內(nèi)源熒光基團(tuán)包括酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）殘基，對(duì)蛋白的微環(huán)境非常敏感[19]，通過熒光分子中熒光基團(tuán)的信息可以反映蛋白的結(jié)構(gòu)變化。如果酪氨酸和色氨酸殘基接近羰基或離子化，使蛋白熒光強(qiáng)度降低[20]。

十六烷二酸對(duì)ACP 內(nèi)源熒光光譜的影響如圖3a 所示。隨著十六烷二酸濃度的增加，ACP 的內(nèi)源熒光強(qiáng)度不斷降低，但當(dāng)十六烷二酸濃度大于0.6 mmol/L 后，內(nèi)源熒光強(qiáng)度的降低幅度趨于緩慢。0.8 mmol/L 十六烷二酸處理后，ACP 蛋白殘基的熒光強(qiáng)度為原酶熒光強(qiáng)度的42.3%。熒光猝滅可能是由于酪氨酸和色氨酸氧化的影響[21]。最大熒光發(fā)射峰可以反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的程度[22]。ACP 蛋白熒光紅移越大，在變性過程中的三級(jí)構(gòu)象變化越大。在圖3b，ACP 蛋白的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移，最大熒光發(fā)射峰從333.6 nm 移動(dòng)到336.6 nm。這是因?yàn)槭槎崤cACP 相互作用，導(dǎo)致ACP 的色氨酸和酪氨酸殘基折疊而向極性環(huán)境偏移，致使熒光基團(tuán)周圍的微環(huán)境改變，酶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)改變，最大發(fā)射波長(zhǎng)多數(shù)發(fā)生紅移。

圖3 十六烷二酸對(duì)ACP 內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.3 Effect of various concentrations hexadecanedioic acid on intrinsic fluorescence emission spectrum of ACP

2.4.2 十六烷二酸對(duì)ACP 同步熒光光譜的影響 同步熒光光譜可以提供熒光基團(tuán)構(gòu)象的變化，具有窄化譜帶、簡(jiǎn)化光譜和較少光譜重疊等優(yōu)勢(shì)[23]。通常情況，Δλ 設(shè)為15 nm 時(shí)，顯示ACP 中酪氨酸（Tyr） 殘基的熒光光譜特性；Δλ 設(shè)為60 nm時(shí)，反映ACP 中色氨酸（Trp）殘基的特征熒光光譜特性[24]。十六烷二酸與ACP 相互作用的同步熒光光譜如圖4所示，加入十六烷二酸后，ACP 的酪氨酸和色氨酸代表的發(fā)射峰強(qiáng)度均降低。隨著十六烷二酸濃度的提高，ACP 的兩個(gè)熒光吸收峰均不斷猝滅。表明十六烷二酸改變了ACP 蛋白質(zhì)熒光基團(tuán)殘基微環(huán)境，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變得疏松，極性增加，疏水性減小[25]。這與內(nèi)源熒光光譜所測(cè)結(jié)果一致。

圖4 十六烷二酸與ACP 的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous flourescence spectra of hexadecanedioic acid and ACP

2.4.3 十六烷二酸與ACP 三維熒光 三維熒光的光譜數(shù)據(jù)相比二維熒光光譜，具有更多的坐標(biāo)點(diǎn)，故而三維熒光顯示的信息更精準(zhǔn)，選擇性更高。圖5為ACP 和十六烷二酸與ACP 體系的三維熒光圖及剖面圖，“山脊” 狀的Peak a 和Peak b是典型的瑞利散射峰 （λex＝λem）?！榜劮濉?狀的Peak1 和Peak2 是常見的熒光峰（2λex＝λem）分別代表酪氨酸和色氨酸殘基的光譜特征[26]。當(dāng)十六烷二酸與ACP 相互作用后，Peak1 和Peak2 的熒光強(qiáng)度明顯降低，同時(shí)峰位發(fā)生紅移，表明十六烷二酸的加入使ACP 的酪氨酸和色氨酸殘基周圍的微環(huán)境極性發(fā)生變化，親水性增強(qiáng)，疏水性減小。十六烷二酸對(duì)ACP 的肽鏈骨架結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，Peak a 的熒光強(qiáng)度在加入十六烷二酸后略有下降，說明十六烷二酸與ACP 結(jié)合后使ACP 蛋白發(fā)生解聚作用，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分散、粒徑變小，造成ACP 熒光強(qiáng)度降低。這與熒光光譜和同步熒光光譜的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

圖5 十六烷二酸與ACP 相互作用前（a 和b）后（c 和d）的三維熒光光譜Fig.5 The three-dimensional fluorescence spectra of ACP and hexadecanedioic acid before （a and b）and after （c and d） reaction

2.5 十六烷二酸對(duì)ACP 分子對(duì)接模擬

配體-蛋白質(zhì)相互作用可通過DS4.5 進(jìn)一步分析。十六烷二酸與ACP 的相互作用如圖6所示，發(fā)現(xiàn)其與ACP 蛋白酶的活性區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸形成了多種相互作用，如傳統(tǒng)氫鍵、電荷相互作用和范德華力等。由圖6的十六烷二酸與ACP 相互作用的分子對(duì)接模擬圖及氨基酸殘基的2D 和3D 示意圖可知，十六烷二酸的小分子對(duì)接在ACP蛋白的活性中心位置，同時(shí)2D 圖顯示了十六烷二酸與ACP 結(jié)合作用貢獻(xiàn)較大的氨基酸殘基，其中十六烷二酸與ARG99 和LYS223 氨基酸殘基之間存在氫鍵作用力 （Conventional hydrogen bond）。十六烷二酸與HIS 278、ILF 38、TRP 194、ASP 79、LYS 226、TYR 299、ARG 35 等氨基酸殘基之間存在范德華作用力（Van der Waals），這說明十六烷二酸與ACP 通過多種作用力穩(wěn)定結(jié)合且氫鍵和范德華力是結(jié)合反應(yīng)的主要作用力。通過分子對(duì)接和熒光技術(shù)，十六烷二酸與ACP 基于氫鍵和范德華相互作用的酸性磷酸酶結(jié)合，從而導(dǎo)致酸性磷酸酶的靜態(tài)猝滅[27]。因此推測(cè)，在這個(gè)氫鍵復(fù)合體中，力占主導(dǎo)地位。

圖6 分子對(duì)接分析配體-蛋白相互作用Fig.6 Analysis of ligand-protein interactions by molecular docking

3 結(jié)論

1） 通過將ACP 蛋白的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL 中進(jìn)行同源建模，并用QMEAN 方法以及拉氏構(gòu)象圖對(duì)所建蛋白模型進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)所建的1nd6.1.A 模型的質(zhì)量較好，打分高，作為進(jìn)行虛擬篩選抑制劑的靶點(diǎn)。

2） 進(jìn)行ACP 的虛擬篩選后，選取LibDock Score 和-CDOCKER ENERGY 打分較高的小分子，篩選了7 個(gè)小分子物質(zhì)。選取實(shí)用性強(qiáng)的4 種物質(zhì)進(jìn)行ACP 活性抑制驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，苯甲酸、槲皮素、十六烷二酸、二氫白藜蘆醇對(duì)ACP 酶活都具有很強(qiáng)的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為1.42，6.03，0.38 和1.18 mmol/L。

3） 選取抑制酶活性最強(qiáng)的十六烷二酸檢驗(yàn)其對(duì)ACP 結(jié)構(gòu)的影響。十六烷二酸與ACP 結(jié)合后，導(dǎo)致酶的內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降，最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移。同步熒光光譜表明，十六烷二酸使ACP的色氨酸（Try）殘基附近微環(huán)境極性增大，親水性增強(qiáng)，導(dǎo)致ACP 的構(gòu)象改變。三維熒光光譜法分析可知，十六烷二酸對(duì)ACP 的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生猝滅，證明了十六烷二酸改變熒光分子的周圍微環(huán)境極性，進(jìn)一步證實(shí)了ACP 二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

4） 分子對(duì)接模擬表明，十六烷二酸分子對(duì)接在ACP 的活性中心，結(jié)合作用力有氫鍵、電荷相互作用和范德華力，闡明了十六烷二酸對(duì)ACP 的作用機(jī)理。