程志祥，邵小華，朱園園

鮑曼不動(dòng)桿菌為不動(dòng)桿菌屬的重要代表，主要引起醫(yī)院獲得性肺炎、血流感染等疾病，病死率較高，也是醫(yī)院感染控制的重要目標(biāo)。近年來廣譜抗菌藥物的大劑量和不合理使用以及免疫抑制劑的影響，使鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性顯著增加，已出現(xiàn)多重耐藥甚至是泛耐藥、全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌[1]。自1985年首個(gè)碳青霉烯類藥物亞胺培南上市以來，成為臨床抗感染治療的一線藥物，而產(chǎn)生碳青霉烯酶是碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAB)耐藥的主要機(jī)制之一。本研究旨在分析合肥市3家三級(jí)醫(yī)院(安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院、中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院、合肥市第二人民醫(yī)院)近年鮑曼不動(dòng)桿菌藥物敏感性的變化，檢測碳青霉烯酶耐藥基因的分布情況，以期更好地控制耐藥菌株的傳播，為臨床個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1Whonet數(shù)據(jù)庫分析 回顧性分析2018年1月—2020年12月合肥市3家三級(jí)醫(yī)院Whonet 5.6數(shù)據(jù)庫相關(guān)資料，統(tǒng)計(jì)3年間分離出的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株數(shù)量和藥敏結(jié)果變化情況(剔除同一患者相同部位重復(fù)菌株及同一患者分別在三個(gè)醫(yī)院住院的重復(fù)病例)。

1.2菌株來源 針對(duì)3家醫(yī)院2018—2020年凍存的非重復(fù)鮑曼不動(dòng)桿菌，根據(jù)數(shù)據(jù)庫藥敏試驗(yàn)結(jié)果隨機(jī)選擇碳青霉烯類敏感鮑曼不動(dòng)桿菌(CSAB)和CRAB的菌株，復(fù)蘇后再次利用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)抗菌藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M100-S30文件[2]判讀藥敏結(jié)果，并且對(duì)CRAB經(jīng)K-B法再次確認(rèn)：亞胺培南抑菌圈直徑≤18 mm或美羅培南抑菌圈直徑≤14 mm。篩選出對(duì)照組15株CSAB和耐藥組44株CRAB，共59株臨床菌株。

1.3儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)[梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]，藥敏卡片采用VITEK 2 AST-N335。PCR擴(kuò)增儀(艾本德中國有限公司)，核酸電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD Universal Hood Ⅱ)。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR試劑盒為：2×Taq Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，凝膠回收試劑盒：SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.4耐藥基因檢測 對(duì)-80 ℃標(biāo)本庫保存的59株臨床菌株和鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606進(jìn)行復(fù)蘇、純化，按照試劑盒要求進(jìn)行DNA模板制備。參照文獻(xiàn)[3-6]，對(duì)產(chǎn)碳青霉烯酶的常見12種耐藥基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列詳見表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，脫色后用凝膠成像系統(tǒng)讀取結(jié)果，出現(xiàn)目的條帶為檢測基因陽性。將陽性條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司測序，將測得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基因相似性分析。

表1 12種碳青霉烯酶基因引物序列

1.5質(zhì)量控制 按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)要求進(jìn)行質(zhì)量控制，質(zhì)控菌株(鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853)由國家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Whonet 5.6 軟件對(duì)抗菌藥物最小抑菌濃度(MIC)、MIC50及MIC眾數(shù)進(jìn)行分析。應(yīng)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25～P75)表示，比較采用兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)Mann-WhitneyH檢驗(yàn)。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏情況 2018—2020年3家醫(yī)院分離鮑曼不動(dòng)桿菌的總數(shù)分別為662株、660株和813株，其中CRAB分離率分別為77.49%(513株)、66.67%(440株)和70.85%(576株)。無明顯連續(xù)變化趨勢。藥敏結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、替加環(huán)素3年間耐藥率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步分析，2020年這3種藥物的耐藥率明顯高于2019年(P<0.05,P<0.01)。除替加環(huán)素、黏菌素、米諾環(huán)素外，2020年各抗菌藥物耐藥率均>50%。各抗菌藥物耐藥率、MIC50、MIC眾數(shù)詳見表2。

表2 2018—2020年3家醫(yī)院分離鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥率、MIC50及MIC眾數(shù)變化

2.259株鮑曼不動(dòng)桿菌臨床特點(diǎn)和藥敏結(jié)果分析 對(duì)照組15株CSAB來源于多個(gè)臨床內(nèi)外科室，標(biāo)本類型：分離自痰液、膿液、尿液各4株，胸腔積液、血液及引流液各1株。僅有1株對(duì)頭孢他啶出現(xiàn)耐藥，其余各抗菌藥物耐藥率均為0。耐藥組44株CRAB主要來自重癥醫(yī)學(xué)科，標(biāo)本類型：分離自痰液33株、支氣管灌洗液8株、引流液2株、血液1株。耐藥組對(duì)黏菌素耐藥率為0，對(duì)替加環(huán)素耐藥率2.27%，對(duì)米諾環(huán)素耐藥率為18.18%，對(duì)其余抗菌藥物耐藥率均>70%。44株全部為多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，20株為泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，表現(xiàn)為頭孢菌素類、青霉素+酶抑制劑類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、葉酸代謝抑制劑類及四環(huán)素類同時(shí)耐藥，無全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌。

除黏菌素外，2組不同抗菌藥物MIC分布水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。不考慮替加環(huán)素和黏菌素(2組均敏感)，對(duì)照組大多數(shù)抗菌藥物MIC中位值還有2個(gè)稀釋度才到敏感折點(diǎn)，耐藥組的MIC中位值則基本剛好位于耐藥折點(diǎn)上(頭孢他啶超出耐藥折點(diǎn)1個(gè)稀釋度，米諾環(huán)素則位于敏感折點(diǎn)上)。2組抗菌藥物MIC值比較具體見表3。

表3 2組鮑曼不動(dòng)桿菌不同抗菌藥物MIC分布水平比較(mg/L)

2.359株鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶耐藥基因的檢測結(jié)果 對(duì)照組檢測出4種耐藥基因blaOXA-23、blaOXA-51、blaOXA-58和blaTEM，各自的表達(dá)率分別為86.67%、100.00%、33.33%、6.67%。耐藥組檢測出5種耐藥基因blaOXA-23、blaOXA-51、blaOXA-58、blaTEM和blaNDM，各自的表達(dá)率分別為100.00%、100.00%、2.27%、88.64%和6.82%。未檢出blaOXA-24、blaOXA-143、blaOXA-235、blaIMP、blaVIM、blaSIM和blaKPC。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606僅檢出blaOXA-51。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，耐藥組blaOXA-23、blaTEM陽性率高于對(duì)照組，而blaOXA-58陽性率低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。對(duì)照組盡管藥敏表現(xiàn)對(duì)碳青霉烯類藥物敏感，實(shí)際仍攜帶耐藥基因，除固有基因blaOXA-51外，尤以blaOXA-23最為常見，其次為blaOXA-58，blaNDM少見。耐藥組全攜帶blaOXA-51和blaOXA-23，共表達(dá)blaTEM的有39株(含20株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌)，其中3株blaNDM陽性(均為泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌)，包括1株另外攜帶blaOXA-58，也是同時(shí)攜帶5種耐藥基因的唯一菌株。見表5。

表4 2組鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶碳青霉烯酶耐藥基因陽性率比較[株(%)]

表5 2組鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶基因共表達(dá)情況

2.4耐藥基因表達(dá)陽性菌株測序結(jié)果 代表菌株測序峰圖單峰形完整清晰，無雜峰干擾。將序列文件在NCBI網(wǎng)站上與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606序列行BLAST序列同源性比對(duì)，5種耐藥基因比對(duì)成功。選取對(duì)照組某一菌株blaTEM測序及比對(duì)結(jié)果見圖1。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是臨床常見致病菌，其多重耐藥問題嚴(yán)重，全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)CARSS歷年來發(fā)布的監(jiān)測報(bào)告[7-8]，本研究3年間3家醫(yī)院分離出的不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗菌藥耐藥率幾乎全高于當(dāng)年全國平均水平，這應(yīng)該與醫(yī)院等級(jí)、地區(qū)差異等有關(guān)。而本研究中2020年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、替加環(huán)素的耐藥率較前2年增長，說明本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥形勢嚴(yán)峻。

在實(shí)際工作中，除了嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，做好院內(nèi)感染防控外，更應(yīng)該根據(jù)國家關(guān)于抗菌藥物應(yīng)用管理文件，如《抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》《抗菌藥物臨床應(yīng)用管理辦法》和相關(guān)醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理制度等，提高醫(yī)務(wù)人員科學(xué)、合理應(yīng)用抗菌藥物的能力和積極性。同時(shí)，也要加強(qiáng)檢驗(yàn)學(xué)科建設(shè)，要采取綜合措施，一方面努力提高微生物標(biāo)本送檢質(zhì)量和比例，改進(jìn)檢測方法和手段，盡量縮短檢測時(shí)間且保障結(jié)果的準(zhǔn)確性；另一方面也可以通過參加院內(nèi)各類疑難感染疾病會(huì)診，與感染科、ICU等重點(diǎn)科室積極溝通，參與醫(yī)院感染防控和藥事管理，不斷提高感染性疾病的診治能力。

產(chǎn)碳青霉烯水解酶是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制[9]，包括以絲氨酸為活性中心的絲氨酸酶和以金屬離子為活性中心的金屬酶類。本研究中共檢出5種耐藥基因，包括blaOXA-23、blaOXA-51、blaOXA-58、blaTEM、blaNDM，其中blaOXA-23、blaTEM在CRAB中的攜帶率明顯高于CSAB。

blaOXA-51是鮑曼不動(dòng)桿菌天然攜帶的基因，多位于染色體上，平時(shí)不表達(dá)或表達(dá)水平較低，水解碳青霉烯類藥物的能力較弱。blaOXA-23可以插入染色體和質(zhì)粒中，通常由質(zhì)粒介導(dǎo)傳播，也是碳青霉烯酶中最常見的基因。本試驗(yàn)中blaOXA-51在所有菌株陽性表達(dá)，blaOXA-23除了在耐藥組菌株中全部陽性表達(dá)外，在對(duì)照組大部分菌株中也陽性表達(dá)，這同王俊等[10]研究結(jié)果較為一致。另有研究表明，位于blaOXA-23、blaOXA-51基因上游的插入序列ISAba-1是基因表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子，可以使耐藥基因高度表達(dá)，從而增強(qiáng)對(duì)碳青霉烯類藥物的抗性[11]。因此本研究中對(duì)照組blaOXA-23基因雖然暫時(shí)無法判斷其來源，但推測其功能與插入序列ISAba-1相關(guān)，還有待擴(kuò)大樣本量深入研究。

blaOXA-58基因位于非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒上，產(chǎn)生的酶能分解青霉素、苯唑西林和亞胺培南，但不分解超廣譜β-內(nèi)酰胺類藥物。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組blaOXA-58陽性率高于耐藥組，但由于對(duì)照組納入菌株數(shù)較少，是否由于樣本有限造成這種差異尚待后續(xù)研究證實(shí)。另外關(guān)于CSAB中檢出blaOXA-58的報(bào)道很少，張吉生等[12]也發(fā)現(xiàn)有10%的CSAB表達(dá)blaOXA-58，而CRAB則完全沒有?？赡芷浔磉_(dá)本身存在異質(zhì)性或與其他調(diào)控機(jī)制有關(guān)，其原因值得深究。

質(zhì)粒上blaTEM的產(chǎn)物也屬于超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，對(duì)碳青霉烯類和頭霉素類藥物敏感，活性可被克拉維酸、舒巴坦等抑制劑抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，在耐藥組中blaTEM陽性率高(88.64%)，與敏感菌株(6.67%)相比存在顯著性差異。鄭琳等[13]對(duì)102株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢測發(fā)現(xiàn)，blaTEM陽性率76.47%，為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因中最高，與本研究結(jié)果一致。

blaNDM屬金屬β-內(nèi)酰胺酶[14]。由于其對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物強(qiáng)大而廣泛的水解能力，導(dǎo)致目前產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶菌株已呈全球范圍播散，成為嚴(yán)重威脅人類健康的“超級(jí)細(xì)菌”。本研究發(fā)現(xiàn)的3株攜帶blaNDM的菌株均為泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌。國內(nèi)陳嬌等[15]、周亞玲等[16]均報(bào)道，blaNDM-1在CRAB中陽性率分別為26.56%(17/64)、26.76%(19/71)，遠(yuǎn)高于本研究的6.82%(3/44)。同時(shí)，也有許多未檢出blaNDM-1的報(bào)道[17-18]。因此認(rèn)為其在我國的分布存在地區(qū)差異，尚未形成流行趨勢。

總之，本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)于抗菌藥物的耐藥性相當(dāng)嚴(yán)重，CRAB攜帶碳青霉烯類耐藥基因主要為blaOXA-23、blaOXA-51、blaTEM，并且普遍存在多個(gè)耐藥基因共表達(dá)。因此應(yīng)嚴(yán)格做到院內(nèi)抗菌藥物應(yīng)用的規(guī)范化管理，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室與臨床科室密切溝通，強(qiáng)化臨床醫(yī)師合理使用抗菌藥物意識(shí)，注重耐藥菌感染預(yù)防控制，盡可能地減少多重耐藥菌的產(chǎn)生和擴(kuò)散。