張 剛，李哲麗，劉玉鳳，鄭少華，趙 芝，牛國(guó)超

據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)腸癌發(fā)病率居胃腸道惡性腫瘤的第3位，發(fā)病機(jī)制與遺傳、環(huán)境等多種因素導(dǎo)致結(jié)腸黏膜上皮基因改變密切相關(guān)[1]。明確相關(guān)基因作用機(jī)制對(duì)早期防治結(jié)腸癌具有重要意義[2-3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況聯(lián)系緊密。有研究表明，LncRNA母系印記基因3(LncRNA MEG3)在正常組織中表達(dá)，但在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)表達(dá)缺失現(xiàn)象，具有抑癌作用[4]。微小RNA(miRNA)屬于內(nèi)源性單鏈小分子非編碼RNA，其中miR-31異常表達(dá)會(huì)影響腫瘤相關(guān)基因活性，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲過(guò)程[5]。但關(guān)于二者在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用仍不明確。故本研究嘗試探討LncRNA MEG3與miR-31在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用及意義，旨在為防治結(jié)腸癌及癌前病變提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2016年6月—2018年8月手術(shù)切除的62例結(jié)腸腺瘤組織、62例結(jié)腸腺瘤癌前病變組織、62例結(jié)腸癌組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)內(nèi)鏡形態(tài)學(xué)及病理檢查證實(shí)腫瘤性質(zhì)；未合并其他部位惡性腫瘤；所有組織標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切除后冷凍保存；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤性質(zhì)難以明確者；合并其他惡性腫瘤者；存在其他結(jié)直腸疾病者。62例結(jié)腸腺瘤患者中男35例，女27例；年齡34～68(48.67±4.06)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為17～30(21.95±1.46)kg/m2。62例結(jié)腸腺瘤癌前病變患者中男33例，女29例；年齡32～69(48.13±5.05)歲；BMI為18～30(22.18±1.22)kg/m2。62例結(jié)腸癌患者中男36例，女26例；年齡33～70(49.03±5.34)歲；BMI為18～31(22.30±1.43)kg/m2。3組性別、年齡、BMI比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 取100 mg凍存的結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸腺瘤癌前病變、結(jié)腸癌組織放置于研磨器中，加入Trizol 1 ml后置于液氮中將組織標(biāo)本磨成粉末狀，提取RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在-80 ℃恒溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。LncRNA MEG3、miR-31、GAPDH引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。遵循美國(guó)BIOMIGA公司SYBR Green Ⅰ說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系，取cDNA采用LightCycler96熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管循環(huán)閾值，以GAPDH作為L(zhǎng)ncRNA MEG3內(nèi)參，U6作為miR-31內(nèi)參，以2-ΔΔCq法計(jì)算LncRNA MEG3、miR-31相對(duì)表達(dá)量。

1.3觀察指標(biāo) ①不同序列轉(zhuǎn)化階段LncRNA MEG3、miR-31相對(duì)表達(dá)量；②LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)在不同序列轉(zhuǎn)化階段的相關(guān)性；③LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用；④LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)與結(jié)腸癌患者病理特征的相關(guān)性；⑤LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者生存率與死亡危險(xiǎn)度的影響。

2 結(jié)果

2.1不同序列轉(zhuǎn)化階段LncRNA MEG3、miR-31相對(duì)表達(dá)量 LncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)量在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中呈逐漸下降趨勢(shì)，miR-31相對(duì)表達(dá)量在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中呈逐漸升高趨勢(shì)(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 不同結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化階段LncRNA MEG3、miR-31相對(duì)表達(dá)量

2.2LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)在不同序列轉(zhuǎn)化階段的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，LncRNA MEG3與miR-31在結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸腺瘤癌前病變、結(jié)腸癌組織中均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.741、-0.753、-0.774，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用 LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用分析顯示,LncRNA MEG3單獨(dú)低表達(dá)所致結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化的OR值為13.050，miR-31單獨(dú)高表達(dá)所致的結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化的OR值為4.641，二者同時(shí)存在時(shí)，交互作用OR值為30.375，γ為2.244，提示LncRNA MEG3低表達(dá)與miR-31高表達(dá)在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中呈正向交互作用(為次相乘模型)。見(jiàn)表2。

表2 LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中的交互作用

2.4LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)與結(jié)腸癌患者病理特征的相關(guān)性 LncRNA MEG3、miR-31相對(duì)表達(dá)量與結(jié)腸癌患者年齡、性別、腫瘤直徑無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)；LncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)量與結(jié)腸癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，與結(jié)腸癌組織分化程度呈正相關(guān)，miR-31相對(duì)表達(dá)量與結(jié)腸癌組織臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與結(jié)腸癌組織分化程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)與結(jié)腸癌患者病理特征的相關(guān)性

2.5LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者生存率與死亡危險(xiǎn)度的影響 KM生存曲線分析，LncRNA MEG3低表達(dá)結(jié)腸癌患者3年生存率低于高表達(dá)患者，miR-31高表達(dá)的結(jié)腸癌患者3年生存率低于低表達(dá)患者(P<0.05)，見(jiàn)圖2。經(jīng)RR檢驗(yàn)，LncRNA MEG3低表達(dá)結(jié)腸癌患者3年內(nèi)死亡危險(xiǎn)度是高表達(dá)患者的7.000倍(95%CI：1.027，47.704)；miR-31高表達(dá)結(jié)腸癌患者3年內(nèi)死亡危險(xiǎn)度是低表達(dá)患者的4.810倍(95%CI：1.846，12.536)。見(jiàn)表4。

表4 LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌死亡危險(xiǎn)度的影響

3 討論

結(jié)腸腺瘤是臨床常見(jiàn)胃腸道良性腫瘤，發(fā)病與居民飲食習(xí)慣、生活方式等因素密切相關(guān)，若未得到及時(shí)有效干預(yù)，隨著病情進(jìn)展可引發(fā)癌前病變，最終發(fā)展為結(jié)腸癌[6-8]。因此，積極探索結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中基因改變的作用機(jī)制對(duì)降低癌前病變、結(jié)腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)結(jié)腸癌患者生存期具有重要意義。LncRNA是一類長(zhǎng)度>200 nt的非編碼RNA，具有廣泛的生物學(xué)功能，可通過(guò)調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄在多種疾病中發(fā)揮作用。LncRNA MEG3屬于小鼠母體印記基因Glt2的人類同系物，定位于染色體14q32，是第一個(gè)有腫瘤抑制功能的LncRNA[9-10]。既往多項(xiàng)研究表明，LncRNA MEG3在肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮調(diào)控腫瘤細(xì)胞作用，且在上述惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)量在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中呈逐漸下降趨勢(shì)，可見(jiàn)LncRNA MEG3低表達(dá)能促進(jìn)結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化過(guò)程。分析原因，主要是由于LncRNA MEG3可作為抑癌因子發(fā)揮作用，能夠啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制，激活內(nèi)源性凋亡途徑，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子、Bcl-2活性，上調(diào)Bax表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化過(guò)程中LncRNA MEG3為滿足抑制腫瘤細(xì)胞、增殖需求而被過(guò)度損耗，呈現(xiàn)低表達(dá)甚至表達(dá)缺失現(xiàn)象[13]。胥光熱等[14]報(bào)道證實(shí)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中敲減LncRNA MEG3后腫瘤細(xì)胞增殖顯著加快。本研究數(shù)據(jù)表明，LncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)量與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤分化程度呈正相關(guān)，與上述研究結(jié)論相符，說(shuō)明LncRNA MEG3低表達(dá)會(huì)加快結(jié)腸癌進(jìn)展，可作為臨床預(yù)測(cè)結(jié)腸腺瘤向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)化的重要指標(biāo)。

miRNA屬小分子單鏈非編碼RNA，廣泛表達(dá)于真核生物內(nèi)，成熟的miRNA具有調(diào)控基因表達(dá)作用。miR-31是與腫瘤相關(guān)的熱點(diǎn)基因，定位于9p21.3，具有調(diào)節(jié)胚胎著床、發(fā)育功能，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-17]。張翌等[18]研究顯示，miR-31過(guò)表達(dá)能促進(jìn)結(jié)腸腺瘤惡性轉(zhuǎn)化，加快結(jié)腸癌發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，miR-31相對(duì)表達(dá)量在序列轉(zhuǎn)化中呈逐漸升高趨勢(shì)，且與結(jié)腸癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，提示miR-31過(guò)表達(dá)不僅會(huì)促進(jìn)結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化，還與結(jié)腸癌患者病理進(jìn)展顯著相關(guān)。推測(cè)主要原因：①miR-31過(guò)表達(dá)能下調(diào)上皮標(biāo)志物表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤增殖能力，促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展[19]；②miR-31能異常激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，導(dǎo)致該信號(hào)通路靶基因異常表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生及進(jìn)展[20]；③miR-31基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化會(huì)導(dǎo)致miR-31異常表達(dá)，影響下游轉(zhuǎn)錄因子活性，加快腫瘤細(xì)胞分化、浸潤(rùn)[21]。故miR-31有望成為結(jié)腸腺瘤向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)化的標(biāo)志物，能為臨床制定科學(xué)防治措施提供有效信息。

本研究嘗試探討LncRNA MEG3與miR-31在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)系及交互作用，結(jié)果顯示二者在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化過(guò)程中呈負(fù)相關(guān)，且LncRNA MEG3低表達(dá)與miR-31高表達(dá)在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中呈正向交互作用(為次相乘模型)，提示LncRNA MEG3低表達(dá)與miR-31高表達(dá)對(duì)結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3低表達(dá)結(jié)腸癌患者3年生存率低于高表達(dá)患者，死亡危險(xiǎn)度是高表達(dá)患者的7.000倍，miR-31高表達(dá)結(jié)腸癌患者3年生存率低于低表達(dá)患者，死亡危險(xiǎn)度是低表達(dá)患者的4.810倍，佐證了LncRNA MEG3低表達(dá)與miR-31高表達(dá)會(huì)對(duì)結(jié)腸癌患者生存狀況產(chǎn)生明顯影響。但本研究屬于單中心、小樣本分析，可能造成數(shù)據(jù)偏倚，需收集更多病例做進(jìn)一步分析，以獲取更為可靠的數(shù)據(jù)支持。

綜上，LncRNA MEG3低表達(dá)與miR-31高表達(dá)在結(jié)腸腺瘤-癌序列轉(zhuǎn)化中具有正向交互作用，且二者均與結(jié)腸癌患者病理特征、生存狀況密切相關(guān)，能為臨床制定治療方案、預(yù)測(cè)預(yù)后提供有效信息。