鄭小紅，金正偉，董慶煥，謝 楊

胃癌是全球極為常見(jiàn)的惡性腫瘤，盡管針對(duì)胃癌相關(guān)的分子研究不斷深入，但是胃癌病死率依舊呈上升趨勢(shì)[1]。由于胃癌發(fā)病早期無(wú)明顯特異性癥狀，與胃炎和胃潰瘍等疾病極為相似，極易造成誤診，延誤治療時(shí)機(jī)[2]。隨著病情的不斷發(fā)展，胃癌晚期患者會(huì)出現(xiàn)胃痛、惡心嘔吐，部分患者會(huì)出現(xiàn)吞咽困難等局部癥狀[3]。胃癌晚期患者可能出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是造成患者治愈率不高、預(yù)后不佳的主要原因[4]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多環(huán)狀RNA(circRNA)被發(fā)現(xiàn)，成為研究者關(guān)注的重點(diǎn)。circRNA是一類(lèi)特殊的非編碼RNA分子，呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解[5]。既往研究表明circRNA_103809可調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖[6]。但其在胃癌中的作用機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一定論。本文旨在分析circRNA_103809調(diào)節(jié)胃癌干樣細(xì)胞特性和線粒體的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要細(xì)胞 胃癌細(xì)胞株(SGC-7901)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、兔抗人單克隆抗體(Bax)、裂解半胱天冬酶9(cleaved cas9)/半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)、裂解半胱天冬酶3(cleaved cas3)/半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)和相應(yīng)二抗購(gòu)自武漢博歐特生物科技有限公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；兔抗人circRNA_103809抗體和抗人β-actin抗體購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；兔抗人細(xì)胞黏附分子44(CD44)、胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(SOX2)和八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(OCT4)抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.2circRNA_103809干擾序列設(shè)計(jì) circRNA_103809 shRNA及空載質(zhì)粒均購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所。將SGC-7901細(xì)胞分成Control組、shRNA-NC組、circRNA_103809-shRNA1組、circRNA_103809-shRNA2組和circRNA_103809-shRNA3組，分別接種于6孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，shRNA-NC組采用空轉(zhuǎn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，circRNA_103809-shRNA1組、circRNA_103809-shRNA2組和circRNA_103809-shRNA3組導(dǎo)入circRNA_103809基因。按照RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄后的樣品為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，設(shè)置反應(yīng)條件。選擇β-actin作為內(nèi)參，檢測(cè)circRNA_103809水平。確定circRNA_103809-shRNA1組、circRNA_103809-shRNA2組和circRNA_103809-shRNA3組轉(zhuǎn)染成功，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3RT-PCR測(cè)定CD44、SOX2和OCT4 分別收集穩(wěn)定篩選的細(xì)胞，Trizol用于提取總RNA，NanoDrop2000分光光度儀測(cè)定RNA濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，在RT-PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增,設(shè)置反應(yīng)條件。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3組平行重復(fù)。CD44上游引物序列為5'-CGGACACCATGGACAAGTTT-3'，下游引物序列為5'-CCGTCCGAGAGATGCTGTAG-3'。SOX2上游引物序列為5'-GAAAAGGCGTGTGGTGTGAC3-3′，下游引物序列為5′-CGCTGATTGGTCGCTAGAAAC-3′。OCT4上游引物序列為5′-AGGATCCCCCGCCGGAACAA-3′，下游引物序列為5′-GAGTTCCCGCGTTGCCCCTC-3′。根據(jù)樣本的Ct值計(jì)算2-ΔΔCt值，計(jì)算每個(gè)腫瘤樣品中的目的基因?qū)τ谡悠返谋稊?shù)差異。

1.4顯微觀察腫瘤細(xì)胞成球情況 取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于6孔板中進(jìn)行培育，1周后收集成球細(xì)胞，重制成單細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，分別檢測(cè)培育1周后每團(tuán)細(xì)胞超過(guò)100個(gè)的成球細(xì)胞數(shù)目及成球細(xì)胞的成球直徑。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位 SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位采用JC-10染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將各組細(xì)胞制成密度為1×105個(gè)/ml懸液，接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后加入JC-1染色液1 ml，37 ℃避光孵育，1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入緩沖液沖洗，后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)JC-1熒光信號(hào)。

1.6Western blot法檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物 檢測(cè)各組干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、SOX2和OCT4蛋白表達(dá)水平，取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1200 r/min離心10 min后加入裂解液重懸細(xì)胞并裂解、離心，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取待測(cè)蛋白，用BCA法測(cè)量蛋白濃度并定量。凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜2 h。5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，一抗孵育過(guò)夜，取出使用PBST反復(fù)洗滌3次，添加相應(yīng)二抗于室溫孵育1.5 h。選擇β-actin作為內(nèi)參，采用軟件獲得蛋白條帶并計(jì)算每組條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1干擾circRNA_103809穩(wěn)定細(xì)胞株的建立 相比Control組和shRNA-NC組，circRNA_103809-shRNA1組、circRNA_103809-shRNA2組和circRNA_103809-shRNA3組中circRNA_103809 mRNA水平均降低(P<0.05)；相比circRNA_103809-shRNA2組和circRNA_103809-shRNA3組，circRNA_103809-shRNA1組circRNA_103809 mRNA最低(P<0.05)；Control組和shRNA-NC組比較無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1。選擇干擾效果最好的circRNA_103809-shRNA1組做后續(xù)研究，簡(jiǎn)寫(xiě)為sh-circ103809。

2.2干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、SOX2和OCT4表達(dá)比較 相比Control組和shRNA-NC組，sh-circ103809組CD44、SOX2和OCT4蛋白及mRNA水平明顯降低(P<0.05)；Control組和shRNA-NC組CD44、SOX2和OCT4蛋白及mRNA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表1和表2。

表1 各組干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、SOX2和OCT4 mRNA水平比較

表2 各組干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、SOX2和OCT4 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

2.5干擾circRNA_103809表達(dá)對(duì)凋亡蛋白的影響 Control組和shRNA-NC組Bax/Bcl-2、Caspase9/β-actin、Caspase3、β-actin蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與shRNA-NC組和Control組相比，sh-circ103809組Bax/Bcl-2、Caspase9/β-actin、Caspase3/β-actin蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖4和表4。

表4 各組凋亡蛋白表達(dá)水平比較

2.3干擾circRNA_103809表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞體外成瘤能力 sh-circ103809組細(xì)胞成球率低于Control組和shRNA-NC組(P<0.05)；sh-circ103809組成球直徑明顯小于Control組和shRNA-NC組(P<0.05)；Control組與shRNA-NC組細(xì)胞成球率和成球直徑比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞成球率及成球直徑比較

3 討論

胃癌是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因，其具有惡性程度高、生長(zhǎng)迅速、轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)[7]。目前，臨床上采取的主要治療措施是放化療和手術(shù)切除瘤體，但是治療后患者的生存率依舊不高[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，相比Control組和shRNA-NC組，sh-circ103809組CD44、SOX2和OCT4蛋白及mRNA水平明顯降低，提示干擾circRNA_103809基因表達(dá)可以減少干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、SOX2和OCT4表達(dá)水平。CD44是腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物之一，廣泛存在于淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、中胚層細(xì)胞等各類(lèi)細(xì)胞表面，其與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[9-12]。SOX2是SOX基因家族的重要成員，有大量文獻(xiàn)報(bào)道其與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和維持腫瘤干細(xì)胞自我更新具有密切聯(lián)系，并在人類(lèi)胃黏膜上皮細(xì)胞的分化過(guò)程中具有重要作用[13-15]。有研究表明，SOX2蛋白表達(dá)變化與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[16]。OCT4基因具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，可轉(zhuǎn)錄不同的mRNA亞型，從而翻譯成多種蛋白質(zhì)[17]。OCT4廣泛表達(dá)于胚胎及生殖干細(xì)胞內(nèi)，并維持該類(lèi)細(xì)胞潛能分化及自更新功能[18]。有研究報(bào)道，OCT4在胃癌、肝癌、乳腺癌中均有表達(dá)，參與腫瘤的形成和發(fā)展[19]。于洋等[20]發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4在膀胱癌組織中高表達(dá)，且與膀胱癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，患者遠(yuǎn)期預(yù)后不良。本研究結(jié)果說(shuō)明，干擾circRNA_103809基因表達(dá)可能通過(guò)抑制CD44、SOX2和OCT4表達(dá)，抑制腫瘤干細(xì)胞的形成，從而達(dá)到抑制胃癌進(jìn)展的效果。

本研究發(fā)現(xiàn)sh-circ103809組細(xì)胞成球率明顯降低，成球直徑明顯減少，提示干擾circRNA_103809基因表達(dá)可抑制其體外成瘤能力。本研究結(jié)果還顯示，干擾circRNA_103809基因表達(dá)，sh-circ103809組細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降。線粒體是細(xì)胞中重要的組成部分，參與細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程，而線粒體膜電位則是評(píng)估線粒體功能的重要指標(biāo)[21-22]。當(dāng)細(xì)胞受到外界因素的刺激，線粒體膜電位下降，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道開(kāi)放，大量凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而使得細(xì)胞加速死亡[23]。因此，促進(jìn)線粒體膜電位下降則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，干擾circRNA_103809基因表達(dá)，Bax/Bcl-2、Caspase9/β-actin、Caspase3/β-actin蛋白表達(dá)水平明顯增加，提示干擾circRNA_103809基因表達(dá)可調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。通常通過(guò)抑制腫瘤抗凋亡基因表達(dá)和促進(jìn)促凋亡基因表達(dá)等方式，來(lái)加速腫瘤細(xì)胞凋亡，其中Bcl-2家族在凋亡基因調(diào)控中起重要作用[24]。本研究結(jié)果提示，干擾circRNA_103809基因表達(dá)后，可通過(guò)上調(diào)促凋亡Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌的發(fā)展進(jìn)程。

綜上，干擾circRNA_103809表達(dá)可以降低線粒體膜電位，有效抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)，其調(diào)控機(jī)制可能是通過(guò)抑制干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的表達(dá)及促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)、抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌的發(fā)展進(jìn)程。