黃 嵐，張洪波，莊 紅

動脈粥樣硬化(AS)是高血壓病、冠心病等多種心血管疾病的主要原因，嚴重危害中老年人的身體健康。血管平滑肌細胞是血管壁的主要成分，其異常增殖和遷移是AS的病理機制，抑制其增殖與遷移對AS的治療尤為重要[1]。氧化應激反應絲氨酸豐富1反義RNA 1(OSER1-AS1)是一種位于人染色體20q13.12的長鏈非編碼RNA(lncRNA)，由2個外顯子組成，全長1482 nt。目前，OSER1-AS1研究多集中在腫瘤方面，其發(fā)揮促癌基因作用，可促進腎癌、肝癌、非小細胞肺癌等腫瘤細胞侵襲、增殖、遷移等惡性生物學行為，敲減其表達有利于延緩腫瘤發(fā)展進程[2-4]。但OSER1-AS1在AS發(fā)生發(fā)展中的作用還未知。lncRNA常通過競爭性吸附微小RNA(miRNA)并調(diào)控miRNA靶基因的表達發(fā)揮生物學調(diào)控作用[5]。StarBase靶基因在線軟件預測顯示，OSER1-AS1可能與miR-373-3p存在相互作用。韓文靜等[6]研究顯示，上調(diào)miR-373-3p可降低血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導血管平滑肌細胞的遷移能力，提示miR-373-3p可能是AS治療的分子靶點。但OSER1-AS1能否靶向miR-373-3p影響AS的發(fā)生發(fā)展也還未知。本研究旨在觀察OSER1-AS1和miR-373-3p在AS患者血清、AngⅡ誘導的人主動脈血管平滑肌細胞(HASMCs)中的表達及OSER1-AS1能否靶向miR-373-3p調(diào)控AngⅡ誘導HASMCs的增殖與遷移，以期闡明OSER1-AS1/miR-373-3p在AS發(fā)生發(fā)展中的作用，為其治療提供新靶點。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2019年5月—2020年12月于本院就診的41例AS，男23例、女18例，年齡(62.39±8.51)歲。納入標準：冠狀動脈造影顯示至少一支狹窄程度>50%；近3個月內(nèi)未使用抗炎、抗菌藥物；近3個月內(nèi)未進行免疫治療。排除標準：合并糖尿病、高血壓病等慢性疾病者；合并腫瘤者；肝、腎等功能障礙者。另選取同時期41例體檢健康者做對照，男25例、女16例，年齡(60.28±7.69)歲。納入研究者自愿簽署本研究知情同意書。

1.2細胞與試劑 正常HASMCs原代細胞、平滑肌細胞培養(yǎng)液購自美國ScienCell公司；AngⅡ購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；OSER1-AS1小干擾RNA(si-OSER1-AS1)、小干擾RNA陰性序列(si-NC)、miR-373-3p模擬物(mimic)、模擬對照序列(miR-NC)、miR-373-3p抑制劑(anti-miR-373-3p)、抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、引物序列、野生型(WT)和突變型(MUT)OSER1-AS1熒光素酶報告基因載體購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒、CCK-8試劑盒、RIPA試劑購自北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3研究方法

1.3.1細胞培養(yǎng)：復蘇HASMCs，接種至平滑肌細胞專用培養(yǎng)液中，放置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱(溫度37 ℃)中培養(yǎng)。

1.3.2RT-qPCR法測定OSER1-AS1與miR-373-3p表達：①取受試者清晨空腹肘靜脈血5 ml，350×g離心10 min，測定上清中OSER1-AS1與miR-373-3p表達。②HASMCs接種至6孔板中，密度為1.0×105個/孔。培養(yǎng)4 h后，分為對照組(Con組)和AngⅡ組，分別用含0、1×10-7mol/L的AngⅡ[7]培養(yǎng)液干預24 h，干預后收集各組細胞，測定細胞中OSER1-AS1與miR-373-3p表達。用RNA提取試劑盒分別提取血清、細胞中總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR擴增。引物序列：OSER1-AS1上游序列為5'-AATCACGCAATTGAAGGAAAAA-3'，下游序列為5'-CCTTGTTTTCCAACCCTTAGACT-3'；GAPDH上游序列為5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游序列為5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；miR-373-3p上游序列為5'-CCAGGGCTTTTCAAAAATGA-3'，下游序列為5'-CCGATCCAATCTGTTCTGGT-3'；U6上游序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3'，下游序列為5'-AACGATTCACGAATTTGCGT-3'。2-ΔΔCt法計算OSER1-AS1、GAPDH、miR-373-3p的相對表達量。

1.3.3細胞轉(zhuǎn)染：接種HASMCs至6孔板中，密度為1.0×105個/孔。培養(yǎng)24 h后，分別轉(zhuǎn)染si-OSER1-AS1、si-NC、miR-373-3p mimic、miR-NC或共轉(zhuǎn)染si-OSER1-AS1與anti-miR-373-3p、si-OSER1-AS1與anti-miR-NC至HASMCs，轉(zhuǎn)染步驟嚴格參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染24 h后，采用RT-qPCR法測定細胞中OSER1-AS1或miR-373-3p表達。

1.3.4CCK-8法測定HASMCs增殖活性：接種轉(zhuǎn)染后及未轉(zhuǎn)染的各細胞于96孔板中，密度為2.5×104個/孔。培養(yǎng)4 h后，轉(zhuǎn)染的各細胞均用含1×10-7mol/L AngⅡ的培養(yǎng)液干預24、48和72 h，依次記為AngⅡ+si-OSER1-AS1組、AngⅡ+si-NC組、AngⅡ+miR-373-3p組、AngⅡ+miR-NC組、AngⅡ+si-OSER1-AS1+anti-miR-373-3p組、AngⅡ+si-OSER1-AS1+anti-miR-NC組。未轉(zhuǎn)染的細胞分為Con組和AngⅡ組，分別用含0、1×10-7mol/L AngⅡ的培養(yǎng)液干預24、48和72 h。干預結(jié)束后，向各孔加10 μl的CCK-8孵育2 h后，酶標儀測定450 nm波長處各孔光密度(OD)值。OD值越大說明細胞增殖活性越強。

1.3.5Transwell小室實驗測定HASMCs遷移能力：接種轉(zhuǎn)染后及未轉(zhuǎn)染的各細胞于Transwell小室上室，密度為2.5×104個/室，下室加500 μl完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)4 h后，將上室按照“1.3.4”分組干預24 h。干預后，取出小室，將下室細胞用多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)即為遷移細胞數(shù)。

1.3.6Western blot法測定增殖、遷移相關(guān)蛋白表達：接種轉(zhuǎn)染后及未轉(zhuǎn)染的各細胞于6孔板中，密度為1.0×105個/孔。培養(yǎng)4 h后，按照“1.3.4”分組干預24 h。干預后，RIPA試劑提取各組細胞中總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度后，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。分離后蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。分別用Ki-67(1︰1000)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2，1︰500)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9，1︰500)、GAPDH(內(nèi)參，1︰1000)一抗在4 ℃冰箱中孵育12 h，洗膜，再用山羊抗小鼠二抗(1︰2000)于37 ℃搖床中孵育1 h。顯影，曝光，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灉y定OSER1-AS1與miR-373-3p靶向關(guān)系：接種HASMCs至6孔板中，密度為1.0×105個/孔。培養(yǎng)24 h后，分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-OSER1-AS1與miR-373-3p mimic(或miR-NC)、MUT-OSER1-AS1與miR-373-3p mimic(或miR-NC)，轉(zhuǎn)染步驟嚴格參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染24 h后，裂解各組細胞，350×g離心10 min。將上清液20 μl與螢火蟲或海腎熒光素酶反應液100 μl充分混合，測定螢火蟲或海腎熒光強度，以二者比值表示細胞熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1OSER1-AS1和miR-373-3p在AS患者血清及AngⅡ誘導血管平滑肌細胞中的表達 AS患者血清中OSER1-AS1表達較體檢健康者升高(4.70±0.32 vs 1.00±0.14，P<0.05)，miR-373-3p表達較體檢健康者降低(0.31±0.03 vs 1.00±0.11，P<0.05)。AngⅡ組HASMCs中OSER1-AS1表達較Con組升高(3.47±0.26 vs 1.00±0.00，P<0.05)，miR-373-3p表達較Con組降低(0.40±0.04 vs 1.00±0.00，P<0.05)。

2.2干擾OSER1-AS1表達對AngⅡ誘導血管平滑肌細胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染si-OSER1-AS1的HASMCs中OSER1-AS1表達較轉(zhuǎn)染si-NC的HASMCs降低(0.23±0.02 vs 1.00±0.00，P<0.05)。AngⅡ組HASMCs增殖活性較Con組升高，同時增殖相關(guān)蛋白Ki-67表達較Con組升高(P<0.05)。AngⅡ+si-OSER1-AS1組HASMCs增殖活性較AngⅡ+si-NC組降低，同時增殖相關(guān)蛋白Ki-67表達較AngⅡ+si-NC組降低(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 干擾OSER1-AS1表達對AngⅡ誘導HASMCs增殖的影響

2.3干擾OSER1-AS1表達對AngⅡ誘導血管平滑肌細胞遷移的影響 AngⅡ組HASMCs遷移數(shù)較Con組升高，同時遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9表達較Con組升高(P<0.05)。AngⅡ+si-OSER1-AS1組HASMCs遷移數(shù)較AngⅡ+si-NC組降低，同時遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9表達較AngⅡ+si-NC組降低(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 干擾OSER1-AS1表達對AngⅡ誘導的HASMCs遷移的影響

2.4OSER1-AS1靶向調(diào)控miR-373-3p表達 StarBase靶基因在線軟件預測顯示OSER1-AS1與miR-373-3p的結(jié)合位點見圖3。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-OSER1-AS1與miR-373-3p mimic的HASMCs熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-OSER1-AS1與miR-NC的HASMCs降低(0.43±0.05 vs 0.98±0.06，P<0.05)；共轉(zhuǎn)染MUT-OSER1-AS1與miR-373-3p mimic的HASMCs熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染MUT-OSER1-AS1與miR-NC的HASMCs比較差異無統(tǒng)計學意義(0.99±0.07 vs 1.01±0.07，P>0.05)。同時，轉(zhuǎn)染si-OSER1-AS1的HASMCs中miR-373-3p表達較轉(zhuǎn)染si-NC的HASMCs升高(3.08±0.23 vs 1.00±0.00，P<0.05)。

2.5miR-373-3p過表達對AngⅡ誘導血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響 轉(zhuǎn)染miR-373-3p mimic的HASMCs中miR-373-3p表達較轉(zhuǎn)染miR-NC的HASMCs升高(3.18±0.31 vs 1.00±0.00，P<0.05)。AngⅡ+miR-373-3p組HASMCs增殖活性、遷移數(shù)較AngⅡ+miR-NC組降低，同時增殖、遷移相關(guān)蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9表達較AngⅡ+miR-NC組降低(P<0.05，P<0.01)。見圖4、表3。

表3 miR-373-3p過表達對AngⅡ誘導HASMCs增殖和遷移的影響

2.6下調(diào)miR-373-3p表達聯(lián)合干擾lncRNA OSER1-AS1表達對AngⅡ誘導HASMCs增殖和遷移的影響 共轉(zhuǎn)染si-OSER1-AS1與anti-miR-373-3p的HASMCs中miR-373-3p表達較共轉(zhuǎn)染si-OSER1-AS1與anti-miR-NC的HASMCs降低(0.47±0.03 vs 1.00±0.00，P<0.05)。AngⅡ+si-OSER1-AS1+anti-miR-373-3p組HASMCs增殖活性、遷移數(shù)較AngⅡ+si-OSER1-AS1+anti-miR-NC組升高，同時增殖、遷移相關(guān)蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9表達較AngⅡ+si-OSER1-AS1+anti-miR-NC組升高(P<0.05，P<0.01)。見圖5、表4。

表4 下調(diào)miR-373-3p表達聯(lián)合干擾OSER1-AS1表達對AngⅡ誘導HASMCs增殖和遷移的影響

3 討論

AS是一種發(fā)病率逐年升高的慢性炎癥性疾病[8]，其發(fā)生發(fā)展與血管平滑肌細胞的異常增殖和遷移有關(guān)，抑制病理狀態(tài)下血管平滑肌細胞的增殖與遷移對AS的治療十分關(guān)鍵。

AngⅡ是目前已知的縮血管活性物質(zhì)，其參與維持血管壁結(jié)構(gòu)和功能的完整性，對血管平滑肌細胞增殖與遷移起促進作用[9]。本研究HASMCs經(jīng)AngⅡ干預后，其增殖與遷移能力明顯增強，與張永安等[1]報道結(jié)果一致。

研究顯示，lncRNA參與調(diào)控血管平滑肌細胞增殖或遷移，對AS在內(nèi)的心血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要影響，是心血管疾病治療的潛在分子靶點[10]。本研究結(jié)果表明，OSER1-AS1在AS患者血清、AngⅡ誘導HASMCs中表達均上調(diào)，干擾其表達可降低AngⅡ誘導HASMCs增殖與遷移能力，提示干擾OSER1-AS1有利于抑制或延緩AS的發(fā)展進程，可能為AS治療提供新途徑。Ki-67是細胞增殖的標志性分子[11]。MMP-2和MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，其通過降解細胞外基質(zhì)和基底膜促進細胞遷移[12]。本研究顯示，干擾OSER1-AS1抑制AngⅡ誘導HASMCs增殖和遷移能力與其調(diào)控細胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達有關(guān)。

研究顯示，miR-373-3p在肝癌、宮頸癌等腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤基因作用，上調(diào)其表達有利于腫瘤治療[13]；上調(diào)miR-373-3p通過靶向抑制SOX4阻礙軟骨細胞凋亡及細胞外基質(zhì)降解，為骨關(guān)節(jié)炎提供了有效的治療靶點。本研究結(jié)果顯示，miR-373-3p過表達降低了AngⅡ誘導HASMCs增殖與遷移能力，提示miR-373-3p過表達可能為AS治療提供了新策略。同時，本研究證實OSER1-AS1可靶向結(jié)合并負調(diào)控miR-373-3p，且下調(diào)miR-373-3p導致干擾OSER1-AS1對AngⅡ誘導HASMCs增殖與遷移的抑制作用明顯減弱，提示干擾OSER1-AS1通過靶向上調(diào)miR-373-3p表達可抑制AngⅡ誘導HASMCs的增殖與遷移能力。

綜上，OSER1-AS1在AS患者血清、AngⅡ誘導的HASMCs中表達上調(diào)，而miR-373-3p表達下調(diào)；干擾OSER1-AS1抑制AngⅡ誘導HASMCs的增殖和遷移與干擾其表達引起細胞中miR-373-3p表達上調(diào)有關(guān)，其有可能成為AS治療的新靶點。