王儀明，雷艷芳，徐俊山，魏臻武，魏 佳，閔學(xué)陽

（1. 上海鼎贏農(nóng)業(yè)有限公司, 上海 202178；2. 光明食品(集團(tuán))有限公司, 上海 200040；3. 揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州 225009）

腺苷酸代謝不僅是生命活動中初級代謝的重要組成部分，也是影響細(xì)胞代謝的主要因素之一。核酸代謝庫前體分子單磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)是構(gòu)成細(xì)胞核糖核酸的主要單核苷酸之一，AMP 的形成通常伴隨著生物體內(nèi)能量的釋放。AMP、能量分子二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)和糖類代謝庫前體三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP) 3 種形式的比例決定了能量電荷比和碳水化合物代謝，進(jìn)而直接影響植物的生長發(fā)育和對外界不良環(huán)境的適應(yīng)性[1-2]。腺苷酸激酶(adenylate kinase, ADK, EC 2.7.4.3)是維持能量代謝和各種腺苷酸庫大小平衡的單體磷酸轉(zhuǎn)移酶，催化ATP + AMP ? 2ADP 的可逆轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)[3-4]。在植物線粒體中，ADK 的活性將會顯著影響細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體中游離態(tài)與結(jié)合態(tài)鎂離子在腺苷酸庫中的代謝平衡。

通常，ADK 蛋白由一個AMP 結(jié)構(gòu)域，一個ATP結(jié)構(gòu)域和一個相對保守的核心結(jié)構(gòu)域(CORE)組成[5]。研究表明，ADK 在動植物中高度保守，其活性已在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、豌豆(Pisum sativum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)等植物中得到證實(shí)， 而ADK的亞細(xì)胞定位在不同植物中差異很大，如在細(xì)胞質(zhì)、線粒體、細(xì)胞核、質(zhì)體中等均有報道[6-10]。在擬南芥中，鑒定到一個重要的莖生長調(diào)控因子AAK6，T-DNA 插入純合突變體(Salk_015281)與野生型植株相比，突變體莖的生長減緩[11]；擬南芥ADK(At2g37250)基因的T-DNA 插入純合突變體，表現(xiàn)出氨基酸含量提高和根生長增強(qiáng)的特性[12]；另一項(xiàng)相關(guān)研究表明，擬南芥ADK(At5g47840)基因的T-DNA 插入純合突變體，植株葉綠體完整性喪失，從而導(dǎo)致早期胚胎到幼苗發(fā)育過程中出現(xiàn)白化苗，表明ADK基因在擬南芥的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[13]。在馬鈴薯中的研究表明，沉默StADK基因的表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株的腺苷酸含量和淀粉含量得到顯著提高[14]。此外，ADK3可以與葉綠體3-磷酸甘油醛脫氫酶相互作用，在綠藻(Chlorophyta)的葉綠體中形成穩(wěn)定的復(fù)合物[15]。除了在調(diào)控植物生長和發(fā)育方面發(fā)揮重要功能，ADK還廣泛參與植物對非生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。以豌豆種子為模型，研究了種子脫水吸水過程中腺苷酸的平衡情況，結(jié)果表明ADK的活性在保持種子干燥和成熟過程中腺苷酸的平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。大豆(Glycine max)GmADK基因受到鹽脅迫后，在耐鹽品種中的表達(dá)高于鹽敏感性品種，推測大豆GmADK基因參與鹽脅迫的應(yīng)答[17]。然而在番茄(Solanum lycopersicum)中，基因的微陣列分析顯示，ADK同源基因(SGN-U214214)在鹽處理的番茄組織中表達(dá)受到抑制，在耐旱番茄品種中，ADK基因(SGN-U232826)的表達(dá)受到干旱脅迫的誘導(dǎo)[18]。目前，已在擬南芥、番茄和水稻中分別鑒定到7、10 和11 個ADK基因，不同成員間的亞細(xì)胞定位，表達(dá)模式存在差異，具體的生理功能還需進(jìn)一步研究[19-20]。雖然ADK基因在生物體能量代謝中發(fā)揮重要功能，但是在豆科牧草中的研究尚未見報道。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是奶牛等草食動物的重要優(yōu)質(zhì)飼草，素有“牧草之王”的美譽(yù)[21]。近年來，國家實(shí)施振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動，有力促進(jìn)了苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。盡管已在其他植物中鑒定、分析了ADK基因家族，但是紫花苜蓿ADK基因的功能仍有待進(jìn)一步闡明。在本研究中，利用生物信息學(xué)方法從紫花苜?；蚪M中鑒定了ADK基因，并分析了序列特征、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、進(jìn)化關(guān)系、順式作用元件，以及ADK基因在不同組織和非生物脅迫下[干旱、低溫、鹽和脫落酸(abscisic acid，ABA)]的表達(dá)模式。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究MsADK家族的功能和調(diào)控機(jī)制提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 紫花苜蓿ADK 基因家族鑒定

紫花苜?；蚪M序列、蛋白質(zhì)序列、CDS 序列，以及gff 文件下載自figshare 數(shù)據(jù)庫(https://figshare.com/projects/whole_genome_sequencing_and_assembly_of_Medicago_sativa/66380)。ADK 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域序列(PF00406)下載自pfam 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)，在bio-linux 系統(tǒng)下通過“Hmmsearch”命令鑒定紫花苜蓿ADK家族成員，并在CDD 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)進(jìn)一步驗(yàn)證是否含有ADK 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。最后，利用CD-HIT(http://weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit/)軟件去除冗余序列，序列特征參數(shù)為98%。

1.2 紫花苜蓿ADK 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，亞細(xì)胞定位，二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用在線工具ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測MsADK 蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)、分子量、等電點(diǎn)、疏水性指數(shù)、穩(wěn)定指數(shù)等理化性質(zhì)。在WoLF PSORT II 網(wǎng)站(https://www.genscript.com/wolfpsort.html)預(yù)測MsADK 蛋白成員的亞細(xì)胞定位。通過在線工具SOMPA (https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)預(yù)測MsADK 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODE(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測MsADK 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

1.3 紫花苜蓿ADK 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA 7 軟件構(gòu)建34 個ADK 蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，包括紫花苜蓿(10 個MsADK)、擬南芥(7 個AtADK)、蒺 藜 苜 蓿(Medicago truncatula，7 個MtADK)和水稻(10 個OsADK)。采用最大似然法(maximum likelihood estimate, MLE)，步長值(bootstrap values)為1 000 次，其他參數(shù)設(shè)置默認(rèn)。

1.4 紫花苜蓿ADK 基因結(jié)構(gòu)、保守基序和順式作用原件分析

GSDS 2. 0 (http://gsds.gao-lab.org/index.php)工具用于分析MsADK成員的基因結(jié)構(gòu)。MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)用于預(yù)測蛋白的保守基序，保守基序數(shù)為10，其他參數(shù)默認(rèn)。PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)工具用于啟動子序列(2.0 kb)順式作用原件分析，并通過TBtools 工具進(jìn)行可視化分析[22]。

1.5 紫花苜蓿ADK 基因共線性和染色體定位分析

在Phytozome 13 (https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)網(wǎng)站分別下載擬南芥、蒺藜苜蓿以及大豆的全基因組序列和gff 文件，利用TBtools 工具對MsADK基因成員進(jìn)行共線性、基因重復(fù)事件和染色體定位分析，并實(shí)現(xiàn)結(jié)果的可視化。

1.6 紫花苜蓿ADK 基因的表達(dá)模式分析

利用BLAST 比對工具在Alfalfa Breeder’s Toolbox(https://www.alfalfatoolbox.org/)數(shù)據(jù)庫鑒定MsADK最匹配的轉(zhuǎn)錄本序列，得到MsADK基因分別在紫花苜蓿和黃花苜蓿中不同組織的表達(dá)量[23]。通過本地BLAST 程序檢索紫花苜蓿‘中苜1 號’的轉(zhuǎn)錄本序列，獲取MsADK基因分別在干旱、低溫、ABA 以及鹽脅迫下的表達(dá)模式[24-26]，并利用TBtools 工具繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿ADK 基因家族成員信息

紫花苜?；蚪M中共鑒定到10 個MsADK基因，并按照染色體上排序命名為MsADK1-MsADK10(表1)。MsADK 蛋白的平均長度為273.4 aa，其中MsADK2 最長(504 aa)，其余序列的長度均在250 aa 左右。MsADK 蛋白的平均分子量30.5 kDa，其中MsADK2 的分子量最大為56.8 kDa，其余蛋白均小于31 kDa；蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)介于5.46 (MsADK10)～9.33 (MsADK8)。MsADK 蛋白的疏水性指數(shù)(GRAVY)的平均值為-0.31，均小于0，表明MsADK 為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，MsADK2、MsADK5、MsADK9 和MsADK10 定 位 于 細(xì) 胞 質(zhì)；MsADK1 和MsADK3 定位于葉綠體；MsADK7 和MsADK8 定位于線粒體；MsADK4 定位于過氧化體；MsADK6定位于細(xì)胞核。除MsADK9 (Ⅱ = 35.91)蛋白的穩(wěn)定指數(shù)小于40，表現(xiàn)為蛋白穩(wěn)定外，其余MsADK蛋白均表現(xiàn)為不穩(wěn)定。與擬南芥基因組序列進(jìn)行BLAST 比對，結(jié)果表明，MsADK包含了擬南芥中全部的ADK同源基因。

表1 紫花苜蓿ADK 基因家族信息Table 1 Information of ADK gene family in Medicago sativa

2.2 紫花苜蓿ADK 家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

MsADK與擬南芥(雙子葉)、水稻(單子葉)、蒺藜苜蓿(豆科)ADK的進(jìn)化關(guān)系表明，10 個MsADK被劃分為5 個(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)亞家族(圖1)。每個亞家族均包含上述4 個物種的ADK成員，表明ADK在不同物種間高度保守，在單雙子葉物種分離前就已存在。MsADK 蛋白與蒺藜苜蓿ADK 蛋白高度同源，擬南芥次之，水稻最遠(yuǎn)。紫花苜蓿MsADK數(shù)目大于蒺藜苜蓿，其中MsADK6和MsADK10被劃分為單獨(dú)的分枝，說明ADK在紫花苜蓿中更為復(fù)雜。在Ⅰ亞家族中包含MsADK1、MsADK7和MsADK8；在Ⅱ亞家族中包含MsADK2和MsADK5兩個成員；在Ⅲ亞家族中僅有MsADK9；在Ⅳ亞家族中包含MsADK3、MsADK4和MsADK10；在Ⅴ亞家族中包含MsADK6一個成員。

圖1 紫花苜蓿、蒺藜苜蓿、擬南芥和水稻ADK 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Figure 1 Phylogenetic tree of ADK genes from Medicago sativa, M. truncatula, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa

2.3 紫花苜蓿ADK 保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

依據(jù)MsADK基因的進(jìn)化距離進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析(圖2)，結(jié)果表明，MsADK 蛋白的10 個基序(Motif 1～Motif 10)在不同亞家族中分布具有差異，每個基因都含有4～7 個保守基序不等。MsADK 蛋白均含有Motif 1 和Motif 3 兩個基序，表明這兩個基序是MsADK家族的核心組成。Motif 4 和Motif 7 僅 在Ⅰ和Ⅴ亞 家 族 中 存 在；Motif 9 僅在Ⅱ和Ⅲ亞家族中存在；Motif 8 僅在Ⅳ和Ⅴ亞家族中存在；不同亞家族特定的基序可能決定了MsADK基因的功能多樣性。MsADK基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖表明(圖2B)，各成員間外顯子數(shù)目4～18 個，以3～6 個居多(60%)，MsADK2基因序列最長，含外顯子數(shù)目最多為18 個。

圖2 MsADK 基因家族的保守基序(A)及基因結(jié)構(gòu)分析(B)Figure 2 Analysis of conserved motifs (A) and gene structure (B) of MsADK genes

2.4 紫花苜蓿MsADK 基因染色體定位和共線性分析

對10 個MsADK基因進(jìn)行染色體定位分析，家族成員隨機(jī)的分布在32 條同源染色體中的7 條上(圖3)。大多數(shù)MsADK基因位于染色體的近端或遠(yuǎn)端，chr4.4、chr7.1 和chr8.3 染色體上均有兩個MsADK基因；chr1.4、chr2.2、chr4.3 和chr7.3 染色體上均只有1 個MsADK基因。對MsADK基因進(jìn)行共線性分析，基因?qū)sADK1/MsADK7、MsADK3/MsADK4和MsADK7/MsADK8之間存在共線性關(guān)系，并被劃分到同一亞類，推斷上述3 對基因是經(jīng)過全基因組復(fù)制而形成的。

圖3 MsADK 基因的染色體上的分布Figure 3 Chromosomal location of MsADK genes

為了進(jìn)一步推斷ADK基因成員的系統(tǒng)發(fā)育機(jī)制，分別構(gòu)建了MsADK基因與擬南芥、水稻、蒺藜苜蓿和大豆4 個代表性物種的比較共線性圖譜，其中MsADK基因和水稻基因間不存在共線性關(guān)系(圖4)。紫花苜蓿和大豆，蒺藜苜蓿都屬于豆科植物，同源性更近。MsADK基因與21 個大豆間存在共線性關(guān)系(MsADK7/Glyma.03G176800/Glyma.10G048200/Glyma.13G136000/Glyma.19G177500、 MsADK1/Glyma.10G0 48200/Glyma.03G176800/Glyma.13G136000/Glyma.19 G177500、 MsADK3/Glyma.12G004200/Glyma.09G232 300、 MsADK6/Glyma.19G088000/Glyma.16G059400、MsADK8/Glyma.10G048200/Glyma.03G176800/Glyma.13G136000/Glyma.19G177500、MsADK4/Glyma.09G23 2300/Glyma.12G004200、 MsADK2/Glyma.15G203100/Glyma.09G096800、MsADK5/Glyma.09G234300)；10 個MsADK基因與蒺藜苜蓿間存在共線性關(guān)系(MsADK7/Medtr7g100530/Medtr1g067050、 MsADK1/Medtr7g100 530/Medtr1g067050、 MsADK3/Medtr4g035850、 MsAD K8/Medtr7g100530/Medtr1g067050、 MsADK4/Medtr4g 035850、MsADK2/Medtr2g461290、和MsADK5/Medtr4g 035170)；5 個MsADK基因與擬南芥基因存在共線性關(guān) 系 (MsADK1/AT2G37250/AT2G37250、 MsADK6/AT3G01820、 MsADK8/AT2G37250、 MsADK7/AT2G3 7250)。

圖4 紫花苜蓿與擬南芥、大豆、蒺藜苜蓿和水稻之間ADK 基因的共線性分析Figure 4 Synteny analysis of MsADK genes with Arabidopsis thaliana, Glycine max,Medicago sativa, and Oryza sativa species

2.5 紫花苜蓿ADK 基因啟動子順式作用元件分析

MsADK基因順式作用元件預(yù)測分析結(jié)果顯示(圖5)，上游2.0 kb 的啟動子序列中含有大量與激素和生長發(fā)育(如植物激素、非生物脅迫、光照、生理生長等)有關(guān)的作用元件，但是成員間含有的順式元件的類型和數(shù)量均有所差異。其中MsADK1和MsADK6所含元件種類最多為10 種。所有MsADK家族成員的啟動子序列中都含有與植物激素相關(guān)的元件，如MsADK1、MsADK2、MsADK6、MsADK7、MsADK8含有生長素(TGA-element、TGA-box)響應(yīng)元件；MsADK2、MsADK3、MsADK4、MsADK5、MsADK6、MsADK7、MsADK8含 有 赤 霉 素(P-box、TATC-box、GARE-motif)響應(yīng)元件；MsADK1、MsADK3、MsADK4、MsADK5、MsADK7、MsADK8、MsADK9含有脫落酸(abscisic acid responsiveness， ABRE)響 應(yīng) 元 件；MsADK1、MsADK3、MsADK4、MsADK6含有水楊酸(salicylic acid responsiveness，SARE 和TCA-element)響應(yīng)元件；MsADK1、MsADK2、MsADK3、MsADK5、MsADK6、MsADK10含 有 茉 莉 酸(CGTCA-motif 和TGACG-motif)響應(yīng)元件。響應(yīng)脅迫相關(guān)作用元件在MsADK家族中同樣分布比較廣泛，所有基因均含有厭氧誘導(dǎo)元件(anaerobic induction，ARE)和光響應(yīng)元件(AAAC-motif、ACE、AE-box、AT1-motif、ATC-motif、 ATCT-motif、 Box 4、 chs-CMA1a、 chs-CMA2a、 GA-motif、 Gap-box、 GATA-motif、 G-box、GT1-motif、 GTGGC-motif、 I-box、 LAMP-element、MRE、TCCC-motif、TCT-motif)，MsADK6、MsADK9、MsADK10含有防御與應(yīng)激響應(yīng)元件(TC-rich repeats)，MsADK1、MsADK2、MsADK3、MsADK4、MsADK9、MsADK10含有干旱誘導(dǎo)元件(MYB binding site involved in drought-inducibility， MBS)；MsADK1、MsADK2、MsADK4、MsADK6含 有 低 溫 響 應(yīng) 元 件(low temperature responsiveness，LTR)；此外，啟動子區(qū)域還有與生長發(fā)育和合成代謝相關(guān)的作用元件，如晝夜節(jié)律調(diào)控(Circadian)、黃酮生物合成(MYB binding site involved in flavonoid biosynthesis，MBSI)、分生組織表達(dá)(GCN4_motif)和根特異性(Motif I)等，表明MsADK同樣在紫花苜蓿的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。

圖5 MsADK 基因的啟動子序列順式作用元件分析Figure 5 The promoter cis-acting analysis of MsADK genes

2.6 MsADK 蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化將會直接影響其功能的改變，SOMPA 預(yù)測結(jié)果顯示，MsADK 蛋白的蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈所占比例較低。蛋白質(zhì)的α-螺旋占37.40%～53.72%，平均值為46.43%；無規(guī)則卷曲占27.35%～45.93%， 平 均 值 為33.89%； 延 伸 鏈 占10.71%～12.98%，平均值為11.84%；β-轉(zhuǎn)角絕大多數(shù)低于10%，介于5.69%～10.29%，平均值為8.24% (表2)。推測MsADK 蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和無規(guī)則卷曲起主要作用。

表2 MsADK 蛋白二級結(jié)構(gòu)Table 2 Secondary structure of MsADK proteins

研究表明，不同種屬ADK 蛋白的三維結(jié)構(gòu)具有相同的，由α/β 折疊構(gòu)成的“三明治”狀結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL 在線工具預(yù)測MsADK 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，MsADK 蛋白都含有α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲等空間構(gòu)象，MsADK6 和MsADK7 構(gòu)象最為接近，其余同成員間結(jié)構(gòu)具有差異性(圖6)。另外，各MsADK 成員含有的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)數(shù)目存在差異。

圖6 MsADK 蛋白三級結(jié)構(gòu)Figure 6 Tertiary structure of MsADK proteins

2.7 紫花苜蓿ADK 基因在不同組織和非生物脅迫下的表達(dá)分析

分析了MsADK基因在紫花苜蓿和黃花苜蓿不同組織中的表達(dá)量，MsADK基因在兩個品種間具有相同的表達(dá)模式(圖7)。MsADK1、MsADK3、MsADK7基因在不同組織間的表達(dá)量一致。MsADK5、MsADK8、MsADK9 基因在所有組織中均有較高的表達(dá)水平，尤其在根瘤中高表達(dá)。MsADK2的表達(dá)具有組織特異性，在根瘤和根中均不表達(dá)，而在葉片中的表達(dá)量最高。同樣，MsADK6在地上組織中的表達(dá)量要顯著的高于地下組織。MsADK4和MsADK10則在莖中的表達(dá)量高于其他組織。表明MsADK基因在調(diào)節(jié)紫花苜蓿生長發(fā)育中發(fā)揮不同的作用。

圖7 MsADK 基因在紫花苜蓿和黃花苜蓿不同組織中的表達(dá)模式Figure 7 Expression profile of MsADK genes bewteen Medicago sativa spp. sativa and M. sativa spp. falcata

為了進(jìn)一步解析MsADK基因在不同非生物脅迫的潛在功能，分析了它們分別在ABA、干旱、低溫和鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜(圖8)。用ABA 處理紫花苜蓿3 h 后，除MsADK1和MsADK8在12 h 表達(dá)量增加，剩余MsADKs基因的表達(dá)量在各處理時間段均明顯下調(diào)。同樣，在干旱和鹽脅迫下，MsADK4、MsADK6、MsADK7、MsADK9和MADKs10的表達(dá)在處理早期(干旱脅迫：1～6 h；鹽脅迫：0.5～1 h)和對照保持相對一致的表達(dá)量，但隨著處理時間的延長，上述5 個基因明顯下調(diào)。在兩種滲透脅迫下，MsADK1、MsADK3和MsADK8隨著處理時間的增加，均出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)表達(dá)，其中MsADK1和MsADK8對脅迫的反應(yīng)更為敏感。值得注意的是，低溫脅迫下MsADK基因表現(xiàn)出了不同于其他非生物脅迫的表達(dá)模式，除了MsADK2、MsADK5下調(diào)表達(dá)外，其余基因從6 h 開始，出現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)。

圖8 紫花苜蓿ADK 基因分別在不同非生物脅迫下的表達(dá)模式Figure 8 Expression profile of MsADK genes under different abiotic stresses

3 討論

腺苷酸類化合物在生物體內(nèi)的含量變化被認(rèn)為是引起細(xì)胞能量代謝的主要因素，其中腺苷酸激酶是生成ADP 和平衡磷酸化反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體等細(xì)胞器中均有分布[20,27]。研究表明ADK基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，將直接影響腺苷代謝庫容大小。目前已從大豆、甘薯(Dioscorea esculenta)、番茄等多種植物種中克隆了ADK基因。然而，尚未在紫花苜蓿中對ADK基因家族進(jìn)行全基因組水平的鑒定與分析。在紫花苜蓿、擬南芥、水稻、蒺藜苜蓿、番茄和馬鈴薯中分別鑒定到10、7、10、7、11 和12 個ADK基因，不同物種間ADK基因的數(shù)目接近，表明ADK基因在物種間高度保守，與物種基因組大小無關(guān)。用擬南芥、水稻、蒺藜苜蓿和紫花苜蓿的ADK 蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將34 個ADK 蛋白劃分為5 個亞家族，每個亞家族均包含了上述4 個物種的ADK 蛋白。蒺藜苜蓿和紫花苜蓿間表現(xiàn)出了高度的同源性，且每個紫花苜蓿的ADK蛋白都有一個高度同源的蒺藜苜蓿蛋白。此外，單雙子葉植物間無明顯的分離，表明ADK 蛋白在單雙子葉植物分化之前就已存在。紫花苜蓿MsADK基因的亞細(xì)胞定位多樣，在葉綠體、線粒體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等細(xì)胞器中均有分布，主要位于細(xì)胞質(zhì)中(40%)，與番茄和木薯(Manihot esculenta)中主要定位于線粒體中的研究結(jié)果不同[14,20]。基 序 分 析 顯 示Motif 1 和Motif 3 在 所 有MsADK 蛋白序列中都含有，但是不同亞家族成員間含有特異的基序。同樣，聚類到相同亞家族成員的外顯子數(shù)目接近，推測MsADK成員間可能存在功能差異。

非生物脅迫是影響全球農(nóng)作物產(chǎn)量的主要原因，每年約有50%的作物減產(chǎn)是由非生物脅迫造成的。ADK除了直接影響能量代謝外，還影響植物的其他方面，包括生長、發(fā)育、開花、抗逆等[11,27]。研究表明ADK基因的下調(diào)將會導(dǎo)致腺苷酸庫積累增加，進(jìn)而影響亞細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，并刺激AGPase (淀粉合成的關(guān)鍵酶)的二硫鍵斷裂，將其從非活性形式轉(zhuǎn)化為活性形式[28-29]。擬南芥細(xì)胞核定位的AAK6基因調(diào)控莖的生長速度[11]；馬鈴薯質(zhì)體中的ADK基因下調(diào)表達(dá)，使淀粉的積累量增加60%[14]。紫花苜蓿MsADK基因在不同組織中均有表達(dá)，莖中的表達(dá)量普遍高于其他組織，其中MsADK5、MsADK8和MsADK9在根瘤中高度表達(dá)，表明MsADK基因在調(diào)控紫花苜蓿地上和地下組織的生長發(fā)育中均發(fā)揮重要功能。

通過分析ADK在干旱、鹽、ABA 和低溫脅迫下的表達(dá)模式，MsADK1和MsADK8在所有非生物脅迫下具有明顯的上調(diào)表達(dá)外，多數(shù)MsADK基因在干旱、鹽和ABA 脅迫下與低溫脅迫呈現(xiàn)相反的表達(dá)模式，如MsADK4，MsADK7，MsADK9和MsADK10等在干旱、鹽和ABA 脅迫中下調(diào)表達(dá)，但是在低溫脅迫下上調(diào)表達(dá)。MsADK基因與大豆間的共線性關(guān)系最強(qiáng)，有研究分析了耐鹽(南農(nóng)1138-2)和鹽敏感(科豐1 號)品種在鹽脅迫下GmADK基因的表達(dá)模式，結(jié)果表明GmADK基因在鹽敏感品種中表達(dá)量降低，而在耐鹽品種中升高[17]。在番茄的研究中表明，大多數(shù)SlADK基因受干旱誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[20]。非生物脅迫下，ADK基因在不同物種間的表達(dá)模式存在差異，具有正向和負(fù)向兩種調(diào)控機(jī)制，推測可能與選擇的研究材料和脅迫類型有關(guān)，精確的調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究在全基因組水平鑒定了紫花苜蓿ADK基因家族，并對其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、順式作用元件等進(jìn)行分析。在此基礎(chǔ)上，對其不同組織和不同非生物脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，在不同脅迫類型下ADK基因表現(xiàn)出正、負(fù)兩種調(diào)控機(jī)制。MsADK基因在進(jìn)化過程中高度保守性，參與調(diào)控紫花苜蓿生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)，本研究對于MsADK成員功能驗(yàn)證，將為紫花苜?；诨蚬こ痰倪z傳改良提供一定基礎(chǔ)。