周巧巧，匡政坤，張洪權(quán)，熊 麗，周詩(shī)毅*

(1.湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430205 ；2.湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430205；3.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430079)

2021年美國(guó)新增肝癌患者42 230例，死亡30 230例，死亡率在所有癌癥中位居第五[1].肝癌治療方法依然是傳統(tǒng)的“手術(shù)、放療、化療”，由于缺乏靶向性藥物，原發(fā)性肝癌的五年生存率依然很低，因此對(duì)肝癌細(xì)胞特異性殺傷的化合物開發(fā)顯得尤為重要[2-3].植物的天然產(chǎn)物是發(fā)現(xiàn)新藥物的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一，其中硫醚類尤其是異硫氰酸酯這一類化合物抗癌效果顯著[4].這類化合物往往通過影響細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌活性.異硫氰酸酯不是由植物本身產(chǎn)生的，而是在細(xì)胞損傷后通過黑芥子酶(β-硫代葡萄糖苷葡萄糖水解酶)將芥子油苷進(jìn)行催化反應(yīng)后釋放出的一類產(chǎn)物.迄今為止，已在蕓苔屬植物目及其分解產(chǎn)物中鑒定出大約130 種不同的芥子油苷及其催化產(chǎn)物[5].如圖1所示，異硫氰酸酯類中的異硫氰酸異丁酯(CAS 號(hào)：591-82-2)抗癌活性較為突出，它來源于十字花科植物，揮發(fā)性強(qiáng).然而關(guān)于它對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)的研究目前尚未報(bào)道.

圖1 異硫氰酸異丁酯的二維結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The two-dimensional structure of isobutyl isothiocyanate

巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種廣泛表達(dá)的促炎細(xì)胞因子，它的受體是CD74，MIF的互變異構(gòu)酶區(qū)域在MIF-CD74 相互作用中發(fā)揮著重要作用，一些MIF抑制劑正是通過靶向互變異構(gòu)酶區(qū)域，進(jìn)而抑制MIF與CD74結(jié)合[6].MIF可以通過調(diào)控下游蛋白表達(dá)參與炎癥與癌癥進(jìn)程.一些癌癥干細(xì)胞通過過表達(dá)MIF下調(diào)p53，進(jìn)而影響細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡，引起免疫失調(diào)以及誘導(dǎo)癌癥.HepG2細(xì)胞中p53為野生型，MIF能夠與細(xì)胞核內(nèi)的p53相互作用，啟動(dòng)p53的轉(zhuǎn)錄因子活性，激活下游的Bax與p21基因表達(dá)，調(diào)控癌細(xì)胞的增殖[6].當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)下，如DNA損傷、氧化應(yīng)激等，p53蛋白表達(dá)增加，影響細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡.在一些炎癥與癌癥病理狀態(tài)下，除了MIF過度表達(dá)，白介素6(Interleukin-6，IL-6)/JAK/STAT信號(hào)通路也往往過度激活，因此一些小分子化合物藥物通過抑制 IL-6/JAK/STAT 信號(hào)通路的激活，進(jìn)而治療該通路不正常激活引起的相關(guān)炎性疾病或癌癥，例如tofacitinib(托法替尼，輝瑞制藥)，ruxolitinib(蘆可替尼，Novartis)，pacritinib(帕克替尼，CTI)，AZD1480(臨床研究階段)等[7-8].

本研究結(jié)合分子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法與生物信息學(xué)技術(shù)，探索異硫氰酸異丁酯特異性抑制肝癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)，并深入闡明其作用機(jī)理，為抗肝癌靶向藥物的研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

流式細(xì)胞儀(NovoCyte，美國(guó)Agilent)，化學(xué)發(fā)光凝膠程像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS+，美國(guó)Biorad)，二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-18AC，三洋)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD，蘇州安泰)，倒置顯微鏡(IXplore，日本Olympus)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)用電泳槽、轉(zhuǎn)膜用電源及轉(zhuǎn)膜槽購(gòu)自Biorad公司.

1.2 材料與試劑

醫(yī)藥級(jí)異硫氰酸異丁酯購(gòu)自TCI試劑公司(I0186)；HepG2、L02、7701與293T細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心(CCTCC，China Center for Type Culture Collection，Wuhan，Hubei，China)，JAK2(3230S)、p-JAK2(3771)、STAT3(9139)和p-STAT3(9145S)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology公司；p53(ab1101)、MIF(ab187064)和β-actin(ab8226)購(gòu)自Abcam；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基0.05%胰酶、青霉素鏈霉素溶液、胎牛血清均購(gòu)于Hyclone公司；一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、一次性移液管等細(xì)胞培養(yǎng)一次性耗材均購(gòu)于NEST公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)雙染法試劑盒Annxein-V-FITC檢測(cè)試劑盒(C1062M)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)相關(guān)化學(xué)試劑等購(gòu)自碧云天.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、L02、293T與7701細(xì)胞系，以1×105個(gè)接種于96孔板中，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的異硫氰酸異丁酯溶液，使其終濃度分別為0、1.563、3.125、6.25、12.5、25 μg·mL-1.根據(jù)570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)得到的光吸收值結(jié)果計(jì)算細(xì)胞的存活率：存活率(%)=D(570)實(shí)驗(yàn)組/D(570)空白組×100%，通過GraphPad軟件擬合出異硫氰酸異丁酯對(duì)各細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50).

1.3.2 細(xì)胞遷移檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 劃痕實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)化合物對(duì)HepG2遷移的影響，將HepG2以2×106個(gè)接種于6孔板中，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行劃線，并且分別加入不同濃度的異硫氰酸異丁酯溶液，使其終濃度分別為0、0.875、1.75 μg·mL-1.5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h與48 h后通過顯微鏡進(jìn)行局部觀察和拍照，用Image J處理圖片，對(duì)劃痕面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，S代表劃痕面積，計(jì)算細(xì)胞遷移率：細(xì)胞遷移率(%)=(S0-St)/S0×100%.

1.3.3 生物信息學(xué)分析 SEA (similarity ensemble approach，http：//sea.bkslab.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)整合了ChEMBL和MDDR等數(shù)據(jù)庫(kù)的化合物和靶標(biāo)信息，利用Daylight分子指紋計(jì)算化合物的相似性，并將相似化合物的靶標(biāo)進(jìn)行聚類[9].通過化合物的SMILES結(jié)構(gòu)式與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，得到化合物的潛在靶標(biāo)為MIF，接著將MIF做進(jìn)一步的分子對(duì)接分析，將異硫氰酸異丁酯與MIF蛋白的天然配體分別對(duì)接到蛋白結(jié)合口袋中，結(jié)合自由能打分進(jìn)行分析.

1.3.4 流式細(xì)胞檢測(cè) 流式細(xì)胞技術(shù)用于檢測(cè)藥物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響，將HepG2以2×106個(gè)接種于6孔板中，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的異硫氰酸異丁酯溶液，使其終濃度分別為0、0.435、0.875、1.75 μg·mL-1.通過Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)處于不同階段的細(xì)胞所占的比例.

1.3.5 免疫印跡檢測(cè) 將HepG2細(xì)胞以2×106個(gè)接種到6孔板中，待細(xì)胞貼壁后向每個(gè)孔分別加入不同濃度的異硫氰酸異丁酯溶液，使其終濃度分別為0、0.435、0.875、1.75 μg·mL-1.將細(xì)胞置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集并處理細(xì)胞，提取蛋白，進(jìn)行蛋白定量，通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)JAK/STAT3信號(hào)通路蛋白，p53蛋白以及內(nèi)參蛋白β-actin表達(dá)情況.不同細(xì)胞系蛋白檢測(cè)MIF和內(nèi)參蛋白β-actin表達(dá)情況.具體步驟參見參考文獻(xiàn)[10-11].

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析 利用Excel與GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖，t檢驗(yàn)分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異顯著性，以*表示p<0.1，**表示p<0.05，***表示p<0.01，NS表示沒有顯著性差異.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 異硫氰酸異丁酯顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖

如圖2所示，MTT檢測(cè)顯示異硫氰酸異丁酯對(duì)HepG2和L02細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)較為顯著，通過數(shù)據(jù)分析表明化合物對(duì)HepG2和L02兩種細(xì)胞的IC50分別為3.5與13.0 μg·mL-1，其生長(zhǎng)抑制曲線如圖2中的a和b所示.而對(duì)293T與7701兩種細(xì)胞在最大濃度25 μg·mL-1時(shí)生長(zhǎng)抑制效應(yīng)也不顯著.實(shí)驗(yàn)表明異硫氰酸異丁酯對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)最顯著.

a.不同濃度異硫氰酸異丁酯作用24 h后HepG2細(xì)胞的存活率； b.不同濃度異硫氰酸異丁酯作用24 h后L02細(xì)胞的存活率； c.不同濃度異硫氰酸異丁酯作用24 h后293T細(xì)胞的存活率； d.不同濃度異硫氰酸異丁酯作用24 h后7701細(xì)胞的存活率圖2 異硫氰酸異丁酯顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖Fig.2 Isobutyl isothiocyanate inhibits the proliferation of HepG2 cells significantly

2.2 異硫氰酸異丁酯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步探究異硫氰酸異丁酯對(duì)HepG2細(xì)胞顯著性抑制的機(jī)理，進(jìn)一步通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響.細(xì)胞凋亡檢測(cè)的數(shù)據(jù)圖像分為四個(gè)象限，左下角為正常存活的細(xì)胞，右下角為早期凋亡細(xì)胞，右上角為晚期凋亡細(xì)胞，左上角為壞死的細(xì)胞.根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖3所示：濃度為0、0.437、0.875、1.75 μg·mL-1的異硫氰酸異丁酯處理后的正常存活的細(xì)胞比率分別為99.68%、72.82%、68.92%和54.46%，而晚期凋亡細(xì)胞的比率分別為0.05%、22.65%、24.40%和37.68%，即異硫氰酸異丁酯的濃度越高，正常存活的細(xì)胞比率越低，而晚期凋亡的細(xì)胞比率越高.這表明異硫氰酸異丁酯對(duì)HepG2細(xì)胞能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且隨著異硫氰酸異丁酯濃度的增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡效應(yīng)越顯著，即存在劑量依賴效應(yīng).

2.3 異硫氰酸異丁酯抑制HepG2細(xì)胞遷移

為了進(jìn)一步探究HepG2細(xì)胞對(duì)異硫氰酸異丁酯顯著敏感性的機(jī)理，通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該化合物是否影響HepG2的遷移.劃痕寬度變窄是由細(xì)胞遷移導(dǎo)致，實(shí)驗(yàn)組中在加入了不同濃度的異硫氰酸異丁酯以及共孵育后通過顯微鏡拍照與統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖4所示，異硫氰酸異丁酯對(duì)細(xì)胞遷移的影響效果顯著.對(duì)比各個(gè)濃度下的劃痕寬度發(fā)現(xiàn)，如圖4a與4b所示，HepG2細(xì)胞在異硫氰酸酯濃度為0 μg·mL-1時(shí)，24 h與48 h后劃痕寬度與0 h相比減小十分顯著，細(xì)胞遷移率分別為61.76±8.33%和78.07±7.57%；細(xì)胞在化合物濃度為0.875 μg·mL-1時(shí)，24 h與48 h后劃痕寬度與0 h相比有一定減小，細(xì)胞遷移率分別為12.02±3.65%和58.90±10.28%；細(xì)胞在化合物濃度為1.75 μg·mL-1時(shí)，24 h與48 h后劃痕寬度與0 h相比變化不明顯，細(xì)胞遷移率分別為2.78±2.56%和15.79±6.58%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明異硫氰酸異丁酯抑制HepG2細(xì)胞遷移，且存在劑量依賴效應(yīng).

a.0 μg·mL-1異硫氰酸異丁酯處理后的正常存活細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞比率分別為99.68%與0.05%； b.0.437 μg·mL-1異硫氰酸異丁酯處理后的正常存活細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞比率分別為72.82%與22.65%； c.0.875 μg·mL-1異硫氰酸異丁酯處理后的正常存活細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞比率分別為68.92%與24.40%； d.1.75 μg·mL-1異硫氰酸異丁酯處理后的正常存活細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞比率分別為54.46%與37.68%圖3 異硫氰酸異丁酯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡Fig.3 Isobutyl isothiocyanate induced the apoptosis of HepG2 cells

a.不同濃度異硫氰酸異丁酯作用下HepG2細(xì)胞0 h、24 h與48 h的劃痕圖片；b.0、0.875與1.75 μg·mL-1異硫氰酸異丁酯作用24 h與48 h時(shí)HepG2的細(xì)胞遷移率；標(biāo)尺長(zhǎng)度為200 μm圖4 異硫氰酸異丁酯抑制HepG2細(xì)胞的遷移Fig.4 Isobutyl isothiocyanate inhibits HepG2 cell migration

2.4 異硫氰酸異丁酯通過靶向MIF蛋白發(fā)揮作用

為了從分子水平探究異硫氰酸異丁酯抑制HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)技術(shù)分析該化合物的潛在靶標(biāo).SEA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明MIF為異硫氰酸異丁酯的潛在靶標(biāo)，如圖5a所示異硫氰酸異丁酯上的N原子可以和MIF的64號(hào)位異亮氨酸形成氫鍵，化合物尾部的甲基可以和MIF產(chǎn)生疏水相互作用.接著將MIF做進(jìn)一步的分子對(duì)接分析，將異硫氰酸異丁酯與MIF蛋白的天然配體分別對(duì)接到蛋白結(jié)合口袋中，結(jié)合自由能打分顯示異硫氰酸異丁酯為-3.9，和天然配體的打分-4.2較為接近.結(jié)果表明異硫氰酸異丁酯和MIF晶體結(jié)構(gòu)中的天然配體結(jié)合位置和模式接近(圖5b)，即MIF的天然配體和異硫氰酸異丁酯有類似的結(jié)合模式，進(jìn)一步說明MIF可能是異硫氰酸異丁酯的潛在靶標(biāo)，異硫氰酸異丁酯可能對(duì)MIF產(chǎn)生一定的生物活性，異硫氰酸異丁酯和MIF結(jié)合口袋相互作用模式如圖5b所示.為了探究HepG2、L02、293T和7701四株細(xì)胞對(duì)異硫氰酸異丁酯不同敏感性是否與細(xì)胞MIF表達(dá)水平有關(guān)，進(jìn)一步通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同細(xì)胞株中MIF表達(dá)量，結(jié)果如圖5c所示，HepG2細(xì)胞中MIF表達(dá)量最高，293T和7701細(xì)胞中MIF表達(dá)量低于HepG2和L02.

a.異硫氰酸異丁酯和MIF結(jié)合口袋相互作用模式圖； b.異硫氰酸異丁酯(綠色)和天然配體(紅色)結(jié)合模式對(duì)比圖； c.HepG2、L02、293T和7701細(xì)胞中MIF蛋白表達(dá)量圖5 異硫氰酸異丁酯生物信息學(xué)分析結(jié)果Fig.5 Results of bioinformatics analysis of isobutyl isothiocyanate

2.5 異硫氰酸異丁酯抑制HepG2細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活

為進(jìn)一步探究異硫氰酸異丁酯是否影響MIF以及下游的p53表達(dá)量，將0、0.437、0.875與1.75 μg·mL-1異硫氰酸異丁酯與HepG2細(xì)胞共孵育24 h后，收集細(xì)胞提取蛋白，通過免疫印跡法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示.不同濃度化合物作用下MIF蛋白表達(dá)量沒有差異，然而0.875與1.75 μg·mL-1濃度下p53蛋白表達(dá)量顯著降低，這表明異硫氰酸異丁酯抑制p53表達(dá).進(jìn)一步檢測(cè)JAK2/STAT3通路的激活情況發(fā)現(xiàn)，0、0.437、0.875與1.75 μg·mL-1異硫氰酸異丁酯與HepG2細(xì)胞共孵育24 h后，不影響JAK2 與STAT3的蛋白表達(dá)水平，但是能顯著性的抑制JAK2 與STAT3的磷酸化，且隨著化合物濃度增加，抑制磷酸化水平的效應(yīng)更顯著，這表明化合物能抑制JAK/STAT3信號(hào)通路的激活，且具有劑量依賴效應(yīng).

圖6 異硫氰酸異丁酯抑制HepG2細(xì)胞 JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活Fig.6 Isobutyl isothiocyanate inhibited the activation of JAK2/STAT3 signaling pathway in HepG2 cells

3 討論

本研究通過分子生物學(xué)與生物信息學(xué)方法首次發(fā)現(xiàn)異硫氰酸異丁酯能抑制原發(fā)性肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)(IC50分別為3.5 μg·mL-1)，當(dāng)濃度≥0.437 μg·mL-1時(shí)化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，當(dāng)濃度≥0.865 μg·mL-1化合物抑制細(xì)胞遷移.其分子機(jī)理可能分為兩個(gè)方面：首先該化合物能夠顯著下調(diào)JAK2和STAT3蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，從而下調(diào)STAT3調(diào)控的蛋白，抑制細(xì)胞的增殖.另一方面，由于異硫氰酸異丁酯不影響HepG2細(xì)胞MIF表達(dá)水平，但是顯著抑制p53表達(dá)量，這表明化合物可能不通過調(diào)控MIF表達(dá)，而是干擾MIF蛋白與其受體CD74相互作用，進(jìn)而抑制下游的p53表達(dá)量與功能，阻滯細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[12-13].

目前關(guān)于異硫氰酸酯類化合物的抗癌活性研究中，關(guān)于異硫氰酸烯丙酯(allyl isothiocyanate，AITC)抗癌機(jī)理的研究最為深入.高劑量(>20 μM)的異硫氰酸烯丙酯能抑制HepG2細(xì)胞的增殖與遷移，并造成DNA損傷，而低劑量的化合物(1.25～2.5 μmol·L-1)效果相反，其分子機(jī)理為異硫氰酸烯丙酯通過造成DNA損傷，阻滯細(xì)胞周期引起細(xì)胞凋亡等方式，對(duì)肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞等造成殺傷作用[14].其靶蛋白包括DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、p53蛋白與微管蛋白.除了異硫氰酸烯丙酯以外，4-(α-L-吡喃鼠李糖氧基)芐基葡糖苷異硫氰酸酯也能夠激活p53和Bax，抑制 Bcl-2 蛋白進(jìn)而誘導(dǎo)惡性星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡[13].本研究與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，異硫氰酸異丁酯可能通過影響MIF與受體相互作用，進(jìn)而調(diào)控p53，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡.

綜上所述，本文研究表明原發(fā)性肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2對(duì)異硫氰酸異丁酯的敏感性高于肝正常細(xì)胞系L02，遠(yuǎn)高于肝正常細(xì)胞系7701以及人胚腎上皮細(xì)胞系293T，即異硫氰酸異丁酯可能具有特異性的對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞癌抑癌潛能.這可能是由于HepG2細(xì)胞中MIF表達(dá)量高于不敏感細(xì)胞株，因此對(duì)異硫氰酸異丁酯更為敏感，化合物作用于靶蛋白MIF后，能更有效的調(diào)控細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-17].另外，異硫氰酸異丁酯也可能靶向HepG2細(xì)胞DNA復(fù)制與修復(fù)相關(guān)酶，進(jìn)而造成DNA損傷，阻滯細(xì)胞進(jìn)入正常的細(xì)胞周期，而DNA損傷的細(xì)胞范圍與細(xì)胞譜系密切相關(guān)，造成HepG2細(xì)胞對(duì)該化合物更為敏感[18-19].后續(xù)還需要更深入研究異硫氰酸異丁酯抗肝癌的其他分子機(jī)制，以及檢測(cè)該化合物是否對(duì)其他癌細(xì)胞也具有生長(zhǎng)抑制效應(yīng).