李文聰，李雪妍，柯銀鉛，祝梓旋，劉呈雄，郭志勇，劉朝霞，鄒 坤

(三峽大學(xué)湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443003)

開(kāi)口箭，又名粗絲，其基源植物為百合科鈴蘭屬TupistrachinensisBaker.開(kāi)口箭植物主要分布于我國(guó)四川、云南、浙江等地.開(kāi)口箭是一種少數(shù)民族民間用藥[1]，主要治療于咽喉腫痛，白喉，胃痛等，并在《中藥大辭典》《全國(guó)中藥匯編》等藥學(xué)文獻(xiàn)中均有收錄.現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，開(kāi)口箭具有細(xì)胞毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤等藥理活性[2-6].但是目前對(duì)開(kāi)口箭多糖部位的研究尚不多見(jiàn).

趙燁等[7]通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明開(kāi)口箭粗多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸希維爾菌具有較好的抑制作用.解燕等[8]通過(guò)對(duì)開(kāi)口箭水提物研究發(fā)現(xiàn)其具有一定的免疫活性，并且在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，從DEAE-52陰離子樹(shù)脂分離得到的開(kāi)口箭粗多糖可以顯著增強(qiáng)正常小鼠的細(xì)胞活力，并且能顯著抑制S180實(shí)體腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng).本課題前期對(duì)開(kāi)口箭的粗多糖進(jìn)行免疫抗腫瘤活性的初步研究，其具有較好的藥理活性.但開(kāi)口箭多糖的純化和結(jié)構(gòu)分析，及多糖與其活性關(guān)系，尚無(wú)深入研究，本研究從此入手，從開(kāi)口箭根莖部分離提取純化得到多糖，并探究其生物學(xué)活性.

1 材料與儀器

1.1 材料

D-甘露糖(麥克林)、L-鼠李糖(麥克林)、D-無(wú)水葡萄糖(麥克林)、D-半乳糖(麥克林)、D-果糖(麥克里面)、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品T1000、T2000、T6000、T10000、T20000(麥克林)、VC(國(guó)藥集團(tuán))、DEAE-52 陰離子樹(shù)脂(科密歐)、SephadexG-200 凝膠(科密歐)、硅膠薄層板(科密歐)、其他試劑均為分析純級(jí)別.

開(kāi)口箭，采摘自湖北省宜昌市長(zhǎng)陽(yáng)土家族自治縣， 經(jīng)三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院陳發(fā)菊副教授鑒定為T(mén)upistrachinensisBaker.

1.2 儀器

紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)、CBM-10A vp Plusl液相(島津)、Ulitimate 3000高效液相(Thermo)、外接示差顯示器(Shodex)、紅外光譜儀(AoelAB)、核磁共振儀(Bruker AVANCE 500 MHz)、酶標(biāo)儀(TECAN).

2 方法

2.1 開(kāi)口箭的提取和分級(jí)醇沉

開(kāi)口箭根部50 kg，洗凈切碎，在65 ℃以 95%乙醇浸提 3次脫脂后，在殘?jiān)屑尤胝麴s水，于微沸狀態(tài)下進(jìn)行提取，濃縮干燥蒸餾得開(kāi)口箭粗多糖.稱量開(kāi)口箭粗多糖樣品102.3 g，加入1 500 mL純水，超聲加熱溶解，再分別以30%、60%、80% 不同的乙醇濃度進(jìn)行分級(jí)醇沉，采用2 500 r·min-1離心機(jī)進(jìn)行離心15 min，收集離心管下層中的沉淀，干燥稱重，得到了多糖A、B、C，并將其命名為T(mén)CP-A、TCP-B、TCP-C，計(jì)算得率，其得率計(jì)算公式為m醇沉部位/m粗樣品×100%.

2.2 醇沉部位的總糖含量測(cè)定

總糖含量測(cè)定是基于賴長(zhǎng)江生等[9]使用苯酚-濃硫酸顯色的方法，略有調(diào)整.

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取0.102 7 g，于 105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加蒸餾水定容至 100 mL.取 5 mL，再用蒸餾水定容至50 mL，配置成0.1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.

樣品溶液的配制：稱取開(kāi)口箭粗多糖，TCP-A、TCP-B、TCP-C各100 mg，分別加蒸餾水定容至100 mL.取5 mL，再用蒸餾水定容至50 mL，配置成0.1 mg·mL-1樣品儲(chǔ)備液.

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：移取上述葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 放置于 25 mL的具塞試管中，加蒸餾水至1 mL，再分別加入1 mL的苯酚和5 mL的濃硫酸.充分振搖，將其置于80 ℃水浴鍋中水浴30 min，另取蒸餾水做空白對(duì)照，于485 nm下測(cè)定樣品的吸光，對(duì)照品葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，D(485)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以計(jì)算樣品中總糖量m總糖，按照公式m總糖/m樣品×100%計(jì)算樣品中的糖含量.

2.3 對(duì)粗多糖C脫蛋白前后蛋白含量的測(cè)定

稱取TCP-C 20 g以適量的純水溶解，加入 1∶1(V/V)的 Sevage 試劑即正丁醇∶氯仿=1∶4(V/V) ，攪拌，分液，重復(fù)6次.

蛋白含量測(cè)定是基于Bohle等[10]方法，在本實(shí)驗(yàn)室具體試劑情況對(duì)其條件進(jìn)行調(diào)整.

考馬斯亮藍(lán)溶液配置：稱取考馬斯亮藍(lán) G250 10 mg放置燒杯中，加入5 mL 濃度為95%的乙醇，加入后攪拌，待到固體全部溶解，加入50 mL濃度為85%的磷酸，邊加入邊攪拌，待顏色變成均一的紅棕色，加入100 mL純水.

蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配置：稱取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，放入10 mL的容量瓶中，定容，配制成5 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.

樣品溶液配置：稱取未除蛋白粗TCP-C和已除蛋白的TCP-C 各50 mg，加入10 mL純水溶解，配置5 mg·mL-1的樣品待測(cè)液.

蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：移取上述蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 放置于25 mL的具塞試管中，加入0.15 moL·L-1NaCl溶液至5 mL，再加入5 mL上述考馬斯亮藍(lán)試劑，充分震搖，另取蒸餾水做空白對(duì)照，于595 nm下測(cè)定樣品的吸光值D(595)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

樣品中蛋白含量測(cè)定：移取上述的樣品溶液各吸取5 mL放置于25 mL的具塞試管中，再加入5 mL上述考馬斯亮藍(lán)試劑，充分震搖，另取蒸餾水做空白對(duì)照，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)量m蛋白.

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以計(jì)算樣品中蛋白m蛋白，按照公式m蛋白/m樣品×100%計(jì)算樣品中的蛋白含量.

2.4 DEAE-52 纖維素離子交換樹(shù)脂純化

將上述去蛋白后的TCP-C，加入已經(jīng)預(yù)處理的 DEAE-52 離子交換樹(shù)脂柱層析，流動(dòng)相體系為純水，0.1 mol·L-1NaCl溶液、0.3 mol·L-1NaCl溶液、0.7 moL·L-1NaCl溶液.每10 mL收集1次，按2.2方法測(cè)量其吸光度.收集各個(gè)部分，將其命名為T(mén)CP-C1、TCP-C2、TCP-C3、TCP-C4.

2.5 葡聚糖凝膠Sephadex G200純化和純度驗(yàn)證

將純水部位TCP-C使用Sephadex G200進(jìn)行純化分離，收集主峰得到 TCP-C1-1，后再采用葡聚糖凝膠Sephadex G-200 進(jìn)行純化和檢驗(yàn)，每10 mL收集1次，具體檢測(cè)方法采用苯酚-濃硫酸法檢測(cè)，方法同2.2收集主峰.

2.6 TCP-C1-1多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

該部分實(shí)驗(yàn)是基于王國(guó)佳等[11]使用葡聚糖凝膠測(cè)量多糖相對(duì)分子質(zhì)量的方法，并且根據(jù)本實(shí)驗(yàn)對(duì)其條件進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整.

標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置：分別稱取已知相對(duì)分子質(zhì)量1 000、2 000、6 000、10 000、20 000 的多糖標(biāo)準(zhǔn)品15 mg，定容至5 mL.

樣品溶液配置：取得到的均一多糖 TCP-C1-1 15 mg，定容至 5 mL.

流動(dòng)相：100% 純水35 min柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：15 μL.

樣品采用和標(biāo)準(zhǔn)同樣的色譜條件，具體為純水相.

2.7 TCP-C1-1多糖紅外光譜(IR)分析

稱取干燥的 TCP-C1-1 樣品5 mg，使用紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定.

2.8 TCP-C1-1多糖單糖構(gòu)成

該部分實(shí)驗(yàn)是基于陳凌霄等[12]對(duì)于TLC薄層色譜確定多糖的單糖構(gòu)成方法的探索，并依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況進(jìn)行方法調(diào)整.

2.8.1 溶液配置 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置：分別稱取果糖90 mg，葡萄糖 90 mg，甘露糖 90 mg，半乳糖 90 mg，鼠李糖 90 mg，分別加入 2 mL純水，振蕩，加熱，使其完全溶解后備用.

顯色劑溶液配置：稱取2 g的苯胺，量取2 mL的二苯胺，量取100 mL丙酮溶液，將苯胺和二苯胺加入其中，振蕩溶解.

展開(kāi)劑溶液配置：展開(kāi)劑體系以正丁醇：異丙醇∶水∶醋酸=7∶5∶2∶1的體積比進(jìn)行配置，即量取正丁醇1.4 mL，異丙醇1.0 mL，水0.4 mL，醋酸0.2 mL進(jìn)行混合待用.

2.8.2 TCP-C1-1多糖水解 稱取TCP-C1-1 50 mg，加入2 mL的水進(jìn)行溶解，再加入4 mL 2 mol·mL-1的三氟乙酸溶液，密封后置于烘箱中于110 ℃水解4 h，取出后待其冷卻至室溫，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，后加入甲醇洗滌，繼續(xù)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其蒸干，反復(fù)多次，直至水解樣品無(wú)酸味.取出樣品，使用0.5 mL水溶解，待用.

2.8.3 TLC薄層色譜分析 將上述標(biāo)準(zhǔn)品和多糖水解液，進(jìn)行點(diǎn)板操作，使用吹風(fēng)機(jī)將殘存溶液吹干，將苯胺-二苯胺丙酮溶液使用噴霧器噴灑其中，將其置于烘箱中90 ℃，加熱1 h.

2.9 TCP-C1-1核磁共振分析

稱取凍干的TCP-C1-1 樣品40 mg，使用D2O進(jìn)行溶解，在其中加入兩滴氘代丙酮，使用核磁進(jìn)行測(cè)定.

2.10 TCP-C1-1生物活性研究

2.10.1 DPPH清除活性研究 DPPH溶液配置：稱取5 mg DPPH，加入到無(wú)水乙醇定容到100 mL，充分溶解，避光.

陽(yáng)性對(duì)照VC梯度濃度的配置：準(zhǔn)確稱取100 mg VC定容至100 mL，分別配置成0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的梯度水溶液.

樣品梯度濃度的配置：稱取樣品 TCP-C1-1 20 mg定容至10 mL，分別配置成0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的梯度水溶液.

DPPH自由基清除率的的測(cè)定：取2 mL 樣品或VC水溶液于試管中，加入2 mL DPPH 溶液，空白組為2 mL 樣品+2 mL 無(wú)水乙醇，對(duì)照組為2 mL DPPH+2 mL ddH2O，混勻后避光反應(yīng) 2 h，517 nm 處測(cè)吸光值.

DPPH自由基清除率= [1-(D樣品-D空白)/D對(duì)照] × 100%.

2.10.2 TCP-C1-1對(duì)α-糖苷酶抑制活性 配置0.1 moL·L-1pH=6.8緩沖溶液：取0.790 g KH2PO4和1.792 1 g Na2HPO4·12H2O，溶于100 mL的純水中.

酶溶液配置：將母液100 U溶于1 mL上述配置的緩沖溶液中.

底物4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)溶液配置：稱取PNPG 15.6 mg使用上述配置的緩沖液，溶解于5 mL上述配置的緩沖溶液中.

阿卡波糖溶液配置：稱取6.5 mg的阿卡波糖，使用上述配置的緩沖溶液1 mL溶解.并且將母液兩倍稀釋 為6、3、1.5、0.75、0.375、0.187 56 mg·mL-1.

碳酸鈉溶液配置：稱取0.212 g的碳酸鈉，使用純水定容至10 mL，得到0.2 moL·L-1的碳酸鈉溶液、

TCP-C1-1樣品溶液配置：稱取TCP-C1-1樣品6.5 mg，用容量瓶定容到1 mL，配置成10 mg·mL-1的母液，并且將母液稀釋為0.20、0.41、0.81、1.63、3.25、6.50 mg·mL-1.

操作方法：使用移液槍量取40 μL上述配置的酶溶液加入到96孔板上，再加入不同濃度的抑制液80 μL，并且37 ℃水浴鍋中加熱10 min，取出后加入40 μL的底物，并再置于37 ℃水浴鍋30 min，使用微孔震蕩板500 r·min-1震蕩2 min取出后加入100 μL的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在405 nm下測(cè)量吸光度.

背景組：上述同樣的操作，不加酶溶液，不加入樣品，加入120 μL緩沖液.

近年來(lái)，威海市食品藥品監(jiān)管局堅(jiān)決貫徹“四個(gè)最嚴(yán)”和“四有兩責(zé)”要求，深入實(shí)施食品安全戰(zhàn)略，通過(guò)“全域覆蓋、全程監(jiān)管、全民共建”的創(chuàng)建模式，全力推進(jìn)國(guó)家食品安全城市和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全市“雙城聯(lián)創(chuàng)”。

空白組：上述同樣的操作，加入酶溶液，不加入樣品，加入80 μL緩沖液.

抑制率=[D空白-(D樣品-D背景)]/D空白×100%.

2.10.3 TCP-C1-1對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的抗炎活性的影響

1) 小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW264.7 的增殖實(shí)驗(yàn).將指數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW 264.7 以 1×105個(gè)/孔的密度接種在 96 孔板中.加入不同 質(zhì)量濃度(0.1857、0.375、0.75、1.5、3 μg·mL-1)TCP-C1-1，每個(gè)樣品質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行組，通過(guò)酶標(biāo)儀492 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量每一組的D(492)值，以細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞作為對(duì)照組，按照公式計(jì)算細(xì)胞活力.

細(xì)胞活力=D實(shí)驗(yàn)/D對(duì)照.

2) TCP-C1-1 對(duì)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響.Grisse 法檢測(cè) NO 的水平將小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW 264.7(2.5×105個(gè)/孔)接種到 24 孔板中，用脂多糖(LPS)1 μg·mL-1處理 2 h 后，加入不同質(zhì)量濃度的TCP-C1-1.24 h 后，收集培養(yǎng)上清液.每個(gè)樣品質(zhì)量濃度(0.375、0.75、1.5 μg·mL-1)設(shè)置 3 個(gè)平行組，同時(shí)以細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞作為對(duì)照組.根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀測(cè)量每組的D(492)值.根據(jù)D(492)值，測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的水平.

3) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.SPSS 19.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，單因素方差分析用于比較多組間差異，Dunnett-t檢驗(yàn)用于兩組間均數(shù)差異的比較：p<0.05則差異具有統(tǒng)計(jì)意義.

3 結(jié)果與分析

3.1 分級(jí)醇沉

多糖A、B、C的質(zhì)量及其得率見(jiàn)表1.

表1 分級(jí)醇沉各個(gè)部分糖質(zhì)量Tab.1 Mass of each part of graded alcohol precipitation

3.2 不同醇沉部位的總糖含量

圖1 總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 standard curve of total sugar content

表2 各個(gè)部分多糖含量

3.3 對(duì)粗多糖C脫蛋白前后蛋白含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2，線性回歸方程y=0.6222x-0.3819，R2=0.9964.計(jì)算出未除蛋白的TCP-C的蛋白含量為16.2%，已除蛋白的TCP-C的蛋白含量為1.9%，表明該部分蛋白已經(jīng)去除的較為完全.

圖2 蛋白含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of protein content determination

3.4 DEAE離子交換樹(shù)脂的洗脫曲線

DEAE離子交換樹(shù)脂洗脫曲線與洗脫組分如圖3與表3所示，其中純水部分(0～20瓶)出峰形較為對(duì)稱，收集該部分，并將其命名為T(mén)CP-C1.

3.5 均一多糖的純度驗(yàn)證

通過(guò)葡聚糖凝膠純化Sephadex G-200 對(duì)TCP-C1多糖進(jìn)行分離，得到均一多糖TCP-C1-1，并對(duì)其純度進(jìn)行驗(yàn)證(圖4)，采用葡聚糖凝膠驗(yàn)證，通過(guò)洗脫曲線可以判斷，其峰形較為對(duì)稱.可以判斷TCP-C1-1是均一多糖.

圖3 多糖C的DEAE洗脫曲線Fig.3 DEAE elution curve of TCP-C

表3 DEAE洗脫各部組分

3.6 TCP-C1-1的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

如圖5所示，不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為y=-8275.5x+167926，R2=0.9902.TCP-C1-1其高效凝膠色譜液相圖如圖6所示，從液相圖的出峰也可以判斷TCP-C1-1是均一多糖，TCP-C1-1出峰時(shí)間在18.5 min.通過(guò)計(jì)算可以得出，該均一多糖相對(duì)分子質(zhì)量為1.52×104.

圖4 TCP-C1-1均一多糖Sephaedx G-200驗(yàn)證洗脫曲線Fig.4 TCP-C1-1 validation elution curve of Sephaedx G-200 homogeneous polysaccharide

圖5 多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of polysaccharide molecular weight determination

圖6 TCP-C1-1出峰時(shí)間Fig.6 TCP-C1-1 departure time

3.7 紅外光譜測(cè)定

TCP-C1-1紅外光譜如圖7所示，3 286 cm-1為羥基的伸縮震動(dòng)，此為多糖的特征吸收峰，2 941 cm-1為糖上幾個(gè)中弱峰的C-H震動(dòng)，1 022 cm-1為 C-O 伸縮振動(dòng)峰；923 cm-1弱峰為端基碳 C-H 彎曲振動(dòng)峰；903 cm-1處有吸收說(shuō)明該糖組分中含有 β-糖苷鍵.

3.8 均一多糖TCP-C1-1 的單糖構(gòu)成

果糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖和水解后的TCP-C1-1如圖8所示，通過(guò)圖8可以判斷，水解后的TCP-C1-1和果糖的位置極為相近，所以可以判斷，該TCP-C1-1可能是由果糖組成的一種果聚糖.

圖7 TCP-C1-1紅外吸收Fig.7 TCP-C1-1 infrared absorption

圖8 標(biāo)準(zhǔn)品和TCP-C1-1酸解單糖對(duì)比Fig.8 Comparison between standard and TCP-C1-1 acidolysis monosaccharide

3.9 TCP-C1-1核磁共振分析結(jié)果

通過(guò)微譜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)TCP-C1-1中碳譜的化學(xué)位移值與Li等[13]實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的果聚糖碳譜的化學(xué)位移值高度重合，其結(jié)果如表4所示，其文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)構(gòu)如圖9所示.

表4 TCP-C1-1碳譜數(shù)據(jù)和β-(2→1)果聚糖碳譜數(shù)據(jù)Tab.4 13C NMR results of TCP-C1-1 and β-(2→1) fructan

圖9 文獻(xiàn)中所報(bào)道β-(2→1)果聚糖結(jié)構(gòu)圖Fig.9 β-(2→1) fructan structure diagram reported in the literature

果聚糖是由一分子由果糖和葡萄糖的二糖蔗糖和一個(gè)或者多個(gè)果糖形成的.Li等[13]在文獻(xiàn)中介紹了葡萄糖殘基鑒定方法，其主要采用核磁共振氫譜來(lái)進(jìn)行判斷，首先氫譜上δ=5.31位置的葡萄糖殘基上的1號(hào)氫和果糖殘基上的4號(hào)氫進(jìn)行積分相對(duì)比，從而確定葡萄糖殘基存在.

TCP-C1-1的核磁共振氫譜如圖10所示，在對(duì)δ=5.31 和葡萄糖殘基上的1號(hào)氫和δ=4.12、δ=4.14果糖殘基上的4號(hào)氫進(jìn)行積分，結(jié)果確定其存在約為83倍關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)使用葡聚糖凝膠測(cè)定TCP-C1-1相對(duì)分子質(zhì)量為15 200，以83倍的關(guān)系可以推算其相對(duì)分子質(zhì)量為15 120，這符合于TCP-C1-1的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定，所以可以證明TCP-C1-1中含有一分子葡萄糖殘基.

圖10 TCP-C1-1核磁共振氫譜Fig.10 TCP-C1-1 nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum

綜上所述，可以確定TCP-C1-1是由果糖組成的果聚糖，且存在β糖苷鍵，其相對(duì)分子質(zhì)量為15 200，連接方式為(2→1)連接，其結(jié)構(gòu)如圖11所示，是一類(lèi)菊粉果聚糖.

圖11 TCP-C1-1結(jié)構(gòu)Fig.11 TCP-C1-1 structure

3.10 TCP-C1-1生物活性研究

3.10.1 DPPH清除活性研究 TCP-C1-1多糖樣品DPPH自由基清除活性如圖12所示，TCP-C1-1多糖具有一定的 DPPH 自由基清除活性，在一定濃度范圍，隨著多糖濃度升高，活性增強(qiáng).在濃度為2 mg·mL-1時(shí)，其清除率可以達(dá)到可以達(dá)到63.3%.

圖12 VC和TCP-C1-1對(duì)DPPH自由基的清除活性Fig.12 DPPH free radical scavenging by VC and TCP-C1-1

3.10.2 TCP-C1-1對(duì)α-糖苷酶的抑制活性 TCP-C1-1對(duì)α-糖苷酶抑制活性如圖13所示，通過(guò) TCP-C1-1和阿卡波糖的對(duì)比，在保持濃度相近的情況下，TCP-C1-1其對(duì)糖苷酶的抑制活性表現(xiàn)優(yōu)越，遠(yuǎn)高于陽(yáng)性對(duì)照藥阿卡波糖，并且在濃度為6.50 mg·mL-1時(shí)，其抑制活性可以達(dá)到74.4%.

3.10.3 TCP-C1-1細(xì)胞抗炎活性 由圖14可知，TCP-C1-1對(duì)小鼠的巨噬細(xì)胞RAW 264.7作用24 h后，于對(duì)照比相比，TCP-C1-1其在0.187 5、0.375、0.75、1.5、3、6 μg·mL-1下，都能顯著促進(jìn)其細(xì)胞的增長(zhǎng).在低濃度時(shí)，其促進(jìn)細(xì)胞增殖活動(dòng)于濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，于對(duì)照組相比較，具有顯著的差異，其中在1.5 μg·mL-1促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)最明顯.

圖13 阿卡波糖和TCP-C1-1 對(duì)α-糖苷酶抑制活性Fig.13 α-GLycosidase inhibitory activity of acarbose and TCP-C1-1

如圖15所示，于LPS對(duì)照組相比，TCP-C1-1的濃度達(dá)到1.5 μg·mL-1的情況下時(shí)，其可以顯著抑制細(xì)胞產(chǎn)生NO.并且明顯低于對(duì)照組.證明TCP-C1-1可以顯著抑制由LPS誘導(dǎo)出的炎癥損傷，且成一定劑量依賴的關(guān)系.

圖15 TCP-C1-1 對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7 細(xì)胞釋放NO的影響Fig.15 Effect of TCP-C1-1 on the release of NO from RAW264.7 cell

4 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)從開(kāi)口箭根部分離提取得到均一多糖，其相對(duì)分子質(zhì)量為1.52×104，TCP-C1-1是由果糖均一多糖構(gòu)成的，其為β-(2→1)連接.通過(guò)后續(xù)對(duì)其生物活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其在清除自由基能力抗α-糖苷酶活性方面都表現(xiàn)出較好的活性.在細(xì)胞抗炎活性實(shí)驗(yàn)方面，當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥時(shí)，機(jī)體中促炎癥因子在內(nèi)毒素的作用產(chǎn)生的產(chǎn)物NO，TCP-C1-1可抑制LPS誘導(dǎo)出RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子NO的產(chǎn)生，并且在其濃度為1.5 μg·mL-1時(shí)其明顯的抑制了NO的產(chǎn)生，證明TCP-C1-1是一種具有較好抗炎活性的均一多糖.

對(duì)于TCP-C1-1結(jié)構(gòu)和其生物活性的探討，對(duì)于深入研究開(kāi)口箭活性物質(zhì)具有較為重要的意義.對(duì)中藥均一多糖結(jié)構(gòu)的研究，可為以多糖為主要成分的中藥質(zhì)量控制水平的提升奠定基礎(chǔ).