周富貴， 李玉蘭， 蔡曉蓉， 薛 蓮， 鄧張雙*

(1.三峽大學天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室， 湖北 宜昌 443002；2.宜昌市中心人民醫(yī)院三峽大學第一臨床醫(yī)學院， 湖北 宜昌 443003；3.三峽公共檢驗檢測中心， 湖北 宜昌 443000； 4.宜昌東陽光制藥有限公司， 湖北 宜昌 443311)

脫氫彎孢霉菌素(dehydrocurvularin，DCV)是一種天然來源的聚酮類化合物，結(jié)構(gòu)上由一個間二羥基苯環(huán)與一個十二元內(nèi)酯環(huán)相連，最初由Musgrave等[1]從彎孢屬(Curvulariasp.)真菌的次級代謝產(chǎn)物中分離獲得.DCV具有植物毒性[2]、抗菌[3]、抗炎[4]、抗線蟲[5]以及廣泛的抗腫瘤活性[6-7]，應用前景廣闊.課題組前期篩選獲得了一株脫氫彎孢霉菌素的高產(chǎn)菌株曲霉Aspergillussp. WG4，經(jīng)PDB搖瓶發(fā)酵后乙酸乙酯萃取和重結(jié)晶操作，能實現(xiàn)DCV的千克級制備(DCV產(chǎn)率30%)[8]，同時對DCV的抗炎[9]、抗腫瘤靶點[10]進行了研究，利用化學探針結(jié)合蛋白質(zhì)組學，確證了DCV作用靶點為ATP-檸檬酸裂解酶(ACLY)[11].目前文獻研究主要涵蓋了DCV的微生物來源、生物活性以及有機和生物合成研究[12]，暫未見DCV代謝相關研究報道.本文以結(jié)構(gòu)相似的彎孢霉菌素(curvularin，簡稱CV)作為內(nèi)標，建立了HPLC檢測方法用于檢測DCV濃度，考察了DCV在不同種屬來源肝微粒體中的代謝速率差異，并推測了可能的代謝產(chǎn)物，對DCV代謝特點做了初步探索，為DCV可藥性開發(fā)提供一定參考.

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國Dionex公司)；Synapt G2型UPLC-Q-TOF-MS儀(美國waster公司)；Vortex genie 2漩渦儀(上海芃奇科學儀器有限公司)；Centrifuge 5418 R高速冷凍離心機(Eppendorf中國有限公司)；DK-8A型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；FA2104B分析天平(上海越平科技有限公司).

1.2 藥物與試劑

待測原型藥脫氫彎孢霉菌素，實驗室自制[8]，HPLC檢驗純度95%左右.內(nèi)標化合物彎孢霉菌素，實驗室自制[13]，HPLC檢測純度95%左右.混合雄性SD大鼠、比格犬、恒河猴以及男性人肝微粒體酶(20 mg·mL-1)；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生系統(tǒng)(A 液和B 液)；配套磷酸緩沖液(PBS)均購自北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司，于-80°C保存.

2 實驗方法

2.1 實驗測定條件

2.1.1 高效液相測定條件 Ultimate 3000型高效液相色譜儀；YMC-Pack ODS-A型 C18色譜柱；檢測波長：220 nm；流動相：水(A)/乙腈(B)，梯度洗脫(0～35 min，5%～50%B體積比)；體積流量：1 mL·min-1；進樣體積10 μL.

2.1.2 質(zhì)譜測定條件 UPLC-MS系統(tǒng)使用ESI離子源，負離子模式，采集范圍為m/z100～1 200，毛細管電壓為2.5 kV，噴霧電壓4.5 kV，霧化氣體為N2.流動相： 水(A)/乙腈(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～50%B體積比).

2.2 DCV含量測定方法學考察

肝微粒孵育體系(500 μL)： PBS溶液420 μL，NADPH體系A液25 μL和B液5 μL在冰水浴上臨時混合后加入體系，再加入DCV工作液5 μL，37 °C預熱5 min后加入混合肝微粒體酶溶液，37 °C水浴孵育.溫孵后處理：向適量溫孵液中加入等體積含內(nèi)標的冰乙腈溶液，旋渦混勻，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液分析，每組平行3次分析結(jié)果取平均值.

2.2.1 專屬性及線性關系考察 專屬性：取相同濃度DCV工作液5 μL分別加入各500 μL的流動相溶劑、空白肝微粒體孵育液以及空白血清中，按上述溫孵后處理方式處理，考察DCV和CV在2.1.1分析條件下是否受空白肝微粒體孵育液中基質(zhì)干擾.

檢測限和定量限：經(jīng)預實驗確定DCV能檢出的濃度范圍，然后準確稱取DCV溶解，依次稀釋成不同濃度的樣品溶液并檢驗，經(jīng)分析HPLC譜圖中DCV峰面積與其保留時間附近的噪音峰比值確定該方法下待測化合物DCV的檢測限(信噪比≥3)和定量限(信噪比≥10)，每組重復檢驗3次.

標準曲線：精確稱取DCV，依次稀釋配制成濃度分別為1、2、4、8、16 mg·mL-1的DCV標曲工作液，各取5 μL加入500 μL的肝微?？瞻诇胤躞w系(孵育體系中加入失活的肝微粒體酶)，即DCV理論濃度相應為10、20、40、80、160 μg·mL-1，按照孵育后處理，HPLC分析，以DCV理論濃度為橫坐標，所檢測的DCV與CV的峰面積比值為縱坐標進行線性擬合.

2.2.2 準確度和精密度考察 另外配制高、中、低(100、50、10 μg·mL-1)三種質(zhì)量濃度(下同)的DCV質(zhì)控工作液按上述處理方法分析，帶入上述標準曲線獲得測定濃度，每個濃度平行3～5份， 計算各質(zhì)控樣品的回收率以及各組相對標準偏差(%)來考察準確度和精確度.

2.3 脫氫彎孢霉菌素體外肝微粒體孵育條件篩選

2.3.1 溫孵時長對DCV代謝的影響 溫孵體系暫選用DCV工作液濃度為8 mg·mL-1，暫定體系中肝微粒體酶濃度為2 mg·mL-1.于0、30、60、90、120、150 min從體系中取出溫孵液100 μL，立刻加入等體積的內(nèi)標溶液混勻，離心取上清液分析.將孵育0 min的DCV濃度作為100%，其他各時間點的底物剩余濃度相應轉(zhuǎn)化為剩余百分數(shù)，獲得底物剩余量百分數(shù)與孵育時間的關系.

2.3.2 肝微粒體酶濃度對DCV代謝的影響 向500 μL體系中分別添加20 mg·mL-1的肝微粒體酶 0、10、 20、 30、 40、 50 μL，即混合肝微粒體酶在體系中的理論濃度分別為：0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·mL-1，溫孵后同上述溫孵后處理取樣分析，獲得底物剩余量百分數(shù)與肝微粒體酶濃度的關系.

2.3.3 初始DCV濃度對其代謝的影響 向500 μL體系中分別加入5 μL不同濃度的 DCV工作液(1、2、4、8、16 mg·mL-1)溫孵，即體系中DCV初始理論濃度分別為10、20、40、80、160 μg·mL-1，溫孵時長和肝微粒體濃度取2.3.1及2.3.2項下相應合適條件實驗.溫孵后同上述方式處理，獲得底物剩余量百分數(shù)與DCV初始濃度的關系.

2.4 DCV肝微粒體代謝速率種屬差異性研究

在最佳體外肝微粒體溫孵條件下，考察DCV在不同來源肝微粒體酶中的代謝穩(wěn)定性，每30 min從溫孵體系中取樣分析.將孵育0 min的DCV濃度作為100%，其他各時間點的底物剩余濃度與其對比轉(zhuǎn)化為剩余百分數(shù)，獲得不同種屬肝微粒體酶與DCV的剩余百分數(shù)隨時間的變化關系.將各個時間點DCV剩余百分數(shù)的自然對數(shù)與孵育時間經(jīng)線性回歸，獲得斜率k，然后按下述公式計算半衰期t1/2和清除率CLint.

t1/2=0.693/k，

2.5 DCV肝微粒體代謝產(chǎn)物研究

將所得四種肝微粒體孵育處理液在2.1.2質(zhì)譜條件下進行檢測，用軟件MassLynx 5.1分析數(shù)據(jù)，并推測可能的代謝產(chǎn)物和代謝位點.

3 結(jié)果與分析

3.1 DCV含量測定方法學考察

在2.1.1分析條件下，經(jīng)過稀釋重復進樣，考察了HPLC數(shù)據(jù)中DCV與其附近噪音峰的峰面積比值并重復檢驗確定DCV的檢測限為0.625 μg·mL-1，定量限為1.25 μg·mL-1(圖1)，且該檢測條件下DCV與CV能達到基線分離(圖2)，出峰時間分別為33.36和35.33 min.檢測不受包括空白肝微粒體孵育體系中各基質(zhì)干擾，可用于各樣品中DCV含量測定.利用GraphPad Prism 7.0軟件數(shù)據(jù)處理求得直線回歸方程為y=0.05194x+0.3458 (R2=0.9948).各質(zhì)控樣品的平均回收率分別為108.12%、102.44%和98.74%，高、中、低濃度工作液組內(nèi)RSD分別為7.63%、9.02%和9.24%，即樣品DCV濃度在10～160 μg·mL-1范圍內(nèi)該檢測方法可行.

a. 空白對照；b. 濃度為10 μg·mL-1的DCV樣品；c. 稀釋濃度為5 μg·mL-1的DCV樣品；d. 稀釋濃度為1.25 μg·mL-1的DCV樣品；e.濃度為0.625 μg·mL-1的DVC樣品圖1 DCV的定量限和檢測限Fig.1 Detection limit and quantitative limit of DCV

圖2 DCV與內(nèi)標CV的HPLC分離示意圖Fig.2 Resolution of DCV and CV

3.2 體外肝微粒體孵育條件優(yōu)化

以SD大鼠來源肝微粒體酶為例，考察在孵育體系中孵育時長、酶濃度和底物濃度孵育時長對底物剩余百分數(shù)的影響，各關系曲線如圖3所示.選擇底物消耗基本不再增加的孵育時長(150 min左右)，以及與底物剩余百分數(shù)呈線性關系的體系酶濃度(1.6 mg·mL-1)和底物初始濃度(80 μg·mL-1)進行后續(xù)試驗.

圖3 DCV剩余百分率與孵育時長(a)肝微粒體酶濃度(b)及底物濃度(c)的關系Fig.3 Correlation between residual percentage of DCV and incubation duration (a)， liver microsomal enzyme concentration (b) and substrate concentration (c)

3.3 DCV肝微粒體代謝種屬性差異

如圖4所示，以孵育時間為橫軸，以底物剩余百分比的自然對數(shù)為縱軸，GraphPad Prism 7.0軟件數(shù)據(jù)處理獲得相應的線性關系為人(H)：y=-0.006076x+4.472 (R2=0.9243)；恒河猴(M)：y=-0.009819x+4.605 (R2=0.9767)；比格犬(D)：y=-0.003133x+4.573 (R2=0.9671)；SD大鼠(R)：y=-0.003743x+4.479 (R2=0.8425).利用上述曲線斜率k值求得DCV在各種屬肝微粒體酶中相應的半衰期t1/2和肝微粒體固有清除率CLint，數(shù)據(jù)結(jié)果見表1.

圖4 不同肝微粒體中DCV剩余百分數(shù)的 自然對數(shù)與孵育時間的線性關系Fig.4 Metabolism rate differences of DCV during incubation with different liver microsomes

3.4 體外肝微粒體代謝產(chǎn)物推測

3.4.1 UPLC-MS推測產(chǎn)物 如圖5所示，四組樣品UPLC-MS結(jié)果相近，負離子模式下除了DCV(289 [M-1]-)和內(nèi)標CV (291 [M-1]-)的離子峰，出現(xiàn)了與底物DCV離子峰質(zhì)荷比一樣的另一個M2： 289 [M-1]-離子峰以及M1： 305 [M-1]-和M3： 339 [M+H2O-1]-離子峰，其中M3為主要代謝產(chǎn)物.根據(jù)DCV的結(jié)構(gòu)特點，雙鍵可能是最主要的代謝位點.其中，離子峰289 [M-1]-的形成推測有兩種可能機制：一種是DCV的α，β不飽和雙鍵因烯醇互變在水溶液中以DCV和M2兩種結(jié)構(gòu)存在(圖6途徑A1)；另一種可能是雙鍵先被羥基進攻形成11-羥基彎胞霉菌素中間體，然后該結(jié)構(gòu)中的11位羥基與7位的羥基經(jīng)分子內(nèi)脫水縮合成六元環(huán)結(jié)構(gòu)M2′，即化合物curvulopyran (圖6途徑A2).此外，DCV的雙鍵也可能先發(fā)生環(huán)氧化反應生成epoxycurvularin，給出305 [M-1]-離子峰M1，然后進一步被羥基進攻開環(huán)生成10，11-鄰羥基彎胞霉菌素，在質(zhì)譜中脫去一分子水形成339 [M-1]-離子峰M3(圖6途徑B).

表1 DCV在不同種屬肝微粒體中的半衰期(t1/2)和 體內(nèi)固有清除率(CLint)Tab.1 t1/2 and CLint of DCV incubation with different hepatic microsomes

3.4.2 DCV穩(wěn)定性探討 文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，DCV的11位羥基加成產(chǎn)物在眾多產(chǎn)DCV真菌的次級代謝產(chǎn)物中均有發(fā)現(xiàn)[4，7，14]，但Vederas等[15]認為11位羥基的生成為一種化學反應過程而非真菌代謝產(chǎn)生.為進一步考察DCV的穩(wěn)定性，本實驗建立了DCV的穩(wěn)定性試驗，考察溶液pH值對其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響.配制pH值分別為6、7、8的磷酸緩沖液(PBS)，各取5 mL，分別加入脫氫彎孢霉菌素標準品5 mg，渦旋使盡量分散均勻，超聲2～3 h后室溫靜置24 h.過濾后各取20 μL樣品用于HPLC分析，并設置乙腈溶解的DCV作為對照分析，流動相：水(A)/乙腈(B)，全梯度洗脫(0～30 min，體積分數(shù)10%～100%B).液相分析結(jié)果如圖5所示，DCV的保留時間為17.5 min，在各緩沖液中有明顯區(qū)別于DCV的峰，其保留時間為12.3 min(將該峰記為M12.3min).M12.3min與DCV峰的峰面積比值由0.53 (pH=6)上升到0.91(pH=8)，與緩沖液pH值呈正相關.表明在PBS中DCV可能發(fā)生了非酶催化的化學轉(zhuǎn)變，形成烯醇異構(gòu)或與水的加成產(chǎn)物，且該轉(zhuǎn)變程度與溶液OH-濃度正相關.

圖5 DCV肝微粒體代謝UPLC-MS離子流Fig.5 UPLC-MS results of hepatic microsomal metabolism of DCV

圖6 DCV肝微粒體代謝歷程推測Fig.6 Speculative route of DCV in liver microsomal metabolism

4 結(jié)論

DCV是一種活性優(yōu)異的真菌次級代謝產(chǎn)物，有望成為臨床抗腫瘤候選藥物，本文為首次報道的對該類化合物代謝研究，對DCV的可藥性開發(fā)提供了一定參考.實驗表明DCV在不同的體外肝微粒體孵育體系中表現(xiàn)出了種屬性速率差異，其代謝產(chǎn)物可能與結(jié)構(gòu)中α、β不飽和雙鍵密切相關.可能的代謝產(chǎn)物curvulopyran[16]和epoxycurvularin[17]也見于產(chǎn)DCV的真菌次級代謝產(chǎn)物中，這表明肝微粒體和真菌發(fā)酵液中可能同時具有起類似作用的氧化酶和縮合酶.而DCV在PBS中的穩(wěn)定性試驗則暗示在水溶液中DCV存在非酶催化的稀醇互變異構(gòu)體或者羥基取代衍生物，后者或在孵育條件下進一步分子內(nèi)脫水形成curvulopyran，這也可能是肝微粒代謝結(jié)果中出現(xiàn)兩處289 [M-1]-離子峰的原因.

a. 乙腈溶解的DCV樣品； b. pH值為6的PBS中溶解的DCV樣品； c. pH值為7的PBS中溶解的DCV樣品； d. pH值為8的PBS中溶解的DCV樣品圖7 DCV在PBS中的穩(wěn)定性Fig.7 Instability of DCV in PBS

DCV結(jié)構(gòu)中的α、β不飽和雙鍵是良好的Michael加成位點，也是DCV活性的重要結(jié)構(gòu)，其還原及取代產(chǎn)物所表現(xiàn)出的抗腫瘤活性都明顯低于DCV，有必要對雙鍵采取一定的保護措施以維持DCV的活性和控制藥效時長.化合物roseopurpurin[18]的活性研究報道為保護α、β不飽和雙鍵活性部位提供了重要的思路，即通過可逆向的Michael加成反應使前體化合物在適宜的條件下轉(zhuǎn)變成真正的活性化合物脫氫彎孢霉菌素進而發(fā)揮藥用.