包順茹 娜仁圖雅 烏云索德 高 磊 韓塔娜

內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010

甘露養(yǎng)心丸為內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)院的院內(nèi)協(xié)定處方，由西紅花、沙棘、黃芪等29 味藥材組成。具有養(yǎng)心、通脈、利尿、平喘、助胃火的功效。主要治療慢性心力衰竭、水腫、氣喘、脈管栓塞等[1-3]。此方在傳統(tǒng)脈瀉制劑的基礎(chǔ)上，對(duì)處方進(jìn)一步優(yōu)化，使其成為處方藥味均為治療心血管病種的新型脈瀉制劑。該制劑突破傳統(tǒng)心血管疾病的組方慣例，根據(jù)臨床病例資料分析，證明其是以利尿，通脈，脈瀉為主要方式達(dá)到治療慢性心力衰竭心臟病的效果。該制劑初始標(biāo)準(zhǔn)較低，沒有定性、定量標(biāo)準(zhǔn)，為了更好地控制其質(zhì)量，本研究建立了甘露養(yǎng)心丸中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的總含量測(cè)定方法[4-8]及處方中海金沙、沙棘、葶藶子、黃芪、西紅花、螃蟹、小蜀季花和山沉香的顯微鑒別方法[4.9-17]。該方法為原料藥基原、投藥量的準(zhǔn)確和工藝的穩(wěn)定提供了保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AE-100 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ME 5 型電子天平（賽多利斯儀器有限公司），LEICA DM3000 生物顯微鏡（德國(guó)徠卡）。

1.2 試藥

甘露養(yǎng)心丸（內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)院，批號(hào)：20171204、20181143、20190731、20191229、20200429）。牛蒡子（貨號(hào)：1704001）、茯苓（貨號(hào)：1708001）、葶藶子（貨號(hào)：1712001）、芒硝（貨號(hào)：1705001）、石榴皮（貨號(hào)：1704001）、海金沙（貨號(hào)：1704001）、白豆蔻（貨號(hào)：1710001）、蓽茇（貨號(hào)：1707001）、香附（貨號(hào)：1803001）、赤芍（貨號(hào)：1702001）、肉豆蔻（貨號(hào)：1704001）、山柰（貨號(hào)：1508001）、黃芪（貨號(hào)：1701001）、紅參（貨號(hào)：1703001）、小茴香（貨號(hào)：1711001）、滑石粉（貨號(hào)：1705001）、車前子（貨號(hào)：1711001）、炒蒺藜（貨號(hào)：1803001）、肉桂（貨號(hào)：1704001）均購(gòu)自內(nèi)蒙古瑞泰藥業(yè)有限公司；山沉香（貨號(hào)：C17120701）、赤瓟子（貨號(hào)：C180606）均購(gòu)自安國(guó)潤(rùn)德藥業(yè)有限公司；五味子（貨號(hào)：18033002）購(gòu)自內(nèi)蒙古慕昕藥業(yè)有限公司，白硇砂（貨號(hào)：170801）；冬青葉（貨號(hào)：170801）、小蜀季花（貨號(hào)：170801）、方海（貨號(hào)：170801）、沙棘（貨號(hào)：170801）、廣棗（貨號(hào)：170801）均購(gòu)自安國(guó)路路通中藥飲片有限公司。西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)：111588-201704，純度：88.4%）、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ?hào)：111589-201705，純度：92.2%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純，乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（45∶55）；檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌愤m量，加稀乙醇制成濃度分別為0.259 2、0.100 8 mg/ml 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取供試品，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）20 min，取出，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方工藝制備不含西紅花的陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 專屬性考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照溶液，測(cè)定。結(jié)果顯示該方法陰性無干擾，專屬性好。見圖1。

圖1 甘露養(yǎng)心丸、對(duì)照品、陰性對(duì)照溶液色譜圖

2.1.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.5、0.8、1.2、1.6、2.0 ml 置10 ml 量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別測(cè)定，以對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，西紅花苷-Ⅰ在5.184～51.837 μg/ml 范圍內(nèi)，西紅花苷-Ⅱ在2.015～20.154 μg/ml 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。回歸方程分別為：Y=63 385.02X+1 216.36，r=1.000 0；Y=755 36.94X+5 175.98，r=1.000 0。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取供試品（批號(hào)：20171204），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次。西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ峰面積RSD 分別為0.22%、0.38%，精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品（批號(hào)：20171204）6 份，各約0.5 g，精密稱定，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定。西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ總含量的RSD 為1.26%，重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)：20171204），分別于制備后0、4、8、12、16、20、24 h 測(cè)定，以西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的峰面積值計(jì)，RSD 分別為0.47%和0.83%，提示供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.10 加樣回收試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品（批號(hào)：2017 1204，含西紅花苷-Ⅰ0.904 mg/g、西紅花苷-Ⅱ0.276 mg/g）9 份，各約0.25 g，精密稱定，分別精密加入西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ混合對(duì)照品溶液5、10、15 ml（西紅花苷-Ⅰ濃度為23.440 μg/ml，西紅花苷-Ⅱ濃度為7.039 μg/ml），再精密加稀乙醇20、15、10 ml，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，測(cè)定。見表1。結(jié)果提示該方法準(zhǔn)確度良好。

表1 加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（n=9）

2.1.11 樣品含量測(cè)定 取樣品按上述方法操作并測(cè)定（n=2），5 批樣品的西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的總含量分別為1.180 mg/g（批號(hào)：20171204）、1.369 mg/g（批號(hào)：20181143）、1.356 mg/g（批號(hào)：20190731）、2.641 mg/g（批號(hào)：20191229）、2.560 mg/g（批號(hào)：20200 429）。

2.2 顯微鑒別試驗(yàn)

取5 批次樣品，研細(xì)，制片，置顯微鏡下檢視。選擇鏡檢率高，專屬性強(qiáng)的藥材鑒別特征建立了顯微鑒別方法。

具體顯微特征歸屬：孢子淡黃色，為四面體、三角狀圓錐形，外壁有顆粒狀雕紋（海金沙）。盾狀毛由數(shù)十個(gè)單細(xì)胞毛毗連而成，末端分離，棕黃色，多破碎成扇形（沙棘）。種皮內(nèi)表皮細(xì)胞黃色，多角形或長(zhǎng)多角形，壁稍厚（葶藶子）。纖維成束散離，壁厚，表面有縱裂紋，兩端斷裂成帚狀或較平截（黃芪）?；ǚ哿o色或淡黃色，呈圓球形，表面有稀疏的細(xì)小刺狀雕紋（西紅花）。不規(guī)則碎片淡黃色或無色，表面有的可見細(xì)密波狀或直或網(wǎng)狀紋理（螃蟹）。花粉粒呈圓球形，外壁表面有短刺（小蜀季花）。木射線細(xì)胞淡黃色至黃色，徑向面觀長(zhǎng)方形，壁略連珠狀增厚，切向面觀寬1～2 列細(xì)胞，高4～13 列細(xì)胞，有的射線細(xì)胞含棕黃色物（山沉香）。見圖2。

圖2 甘露養(yǎng)心丸顯微鏡下表現(xiàn)

3 討論

西紅花苷是西紅花的重要有效活性成分，具有顯著的抗心血管疾病的藥理活性[18-23]。因此本研究選取西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ作為含量指標(biāo)來控制甘露養(yǎng)心丸的質(zhì)量。

在供試品溶液制備過程中，考察了提取溶劑稀乙醇量10、15、20、25、50 ml，隨著提取溶劑量的增多，西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的總含量也隨之增多，但提取溶劑量為25、50 ml 時(shí)，含量相差不大，考慮綠色環(huán)保經(jīng)濟(jì)因素，提取溶劑量定為25 ml。

測(cè)得的5 批樣品含量數(shù)據(jù)中，3 批樣品含量值較低，可能與原藥材來源有關(guān)[24-26]，因而在制劑配方中應(yīng)該保證原藥材來源的穩(wěn)定與可靠，以保障臨床治療效果。

該制劑為所有藥材原粉入藥，因而建立專屬性強(qiáng)的顯微鑒別方法即可以有效控制部分藥材的質(zhì)量，檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行，且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。