馮榮榮，呂桃桃，邢龍飛，李曉慧，黃樹航，秦麗娜△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488）

抑郁癥是一種復(fù)雜的情志病，常伴有精神萎靡、興趣減退、少言寡語、悲傷憂郁、失眠焦慮、不喜與外界接觸等臨床癥狀，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)自殘、甚至自殺等行為[1-2]。隨著社會(huì)壓力的增加，抑郁癥的發(fā)病率逐年增加，全球約有3.5億人正遭受著抑郁癥的折磨[3]，對(duì)家庭和患者造成了巨大的精神傷害，對(duì)社會(huì)也產(chǎn)生了難以估計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失[4]。目前西醫(yī)治療抑郁癥主要以抗抑郁藥為主，存在不良反應(yīng)明顯、療效不確定、患者依從性差等問題。中醫(yī)電針因不良反應(yīng)小、療效好而得到廣泛關(guān)注[5]。關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，傳統(tǒng)認(rèn)為主要涉及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)功能失調(diào)、非單胺類神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá)的下調(diào)和通路信號(hào)的傳遞中斷[6]。突觸可塑性理論在抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究中有利于揭示抗抑郁的新靶點(diǎn)，而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF） 對(duì)細(xì)胞的分化和突觸可塑性具有重要作用[7]。

針刺“百會(huì)”和“印堂”可以增加BDNF，直接調(diào)控PI3K-AKt通路，而PI3K-Akt與BDNF神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)、CREB磷酸化關(guān)系密切，因此電針可介導(dǎo)CREB調(diào)節(jié)抑郁大鼠的神經(jīng)可塑性[8]。自發(fā)抑郁的WKY大鼠前額皮層在PI3K信號(hào)傳導(dǎo)通路中可以發(fā)現(xiàn)突觸可塑性破環(huán)[9]，GSK-3和PI3K-AKt-mTOR信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通過不同受體激活PI3K及下游活性蛋白，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖和合成代謝[10]。在神經(jīng)元的主要信號(hào)控制通路中，激活GSK-3介導(dǎo)的mTOR抑制是通過突觸活性誘導(dǎo)L-LTP（長(zhǎng)持續(xù)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)）的關(guān)鍵，這種突觸活動(dòng)可以參與突觸可塑性相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)[11]。有證據(jù)表明，mTOR的激活和GSK-3β的抑制參與了抗抑郁的系統(tǒng)，在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用[12-13]。因此，基于突觸可塑性理論針刺WKY大鼠“百會(huì)”和“印堂”觀察對(duì)前額皮層相關(guān)蛋白mTOR和GSK-3β表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠10只，WKY大鼠30只，6周齡，體質(zhì)量（210±20）g，SPF級(jí)，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，購進(jìn)后在中日友好醫(yī)院臨床研究所動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每籠3只，動(dòng)物每日專人喂養(yǎng)，控制溫度（20～25℃）和濕度（55% ±2%），自然晝夜節(jié)律。

RIPA蛋白裂解液（#9806，Cell Signaling Technology）；BCA 蛋白定量試劑盒（#7780，Cell Signaling Technology）；mTOR 抗體（2983T，CST）；GSK-3β 抗體（12456T，CST）；山羊抗兔 IgG-HRP（111-035-003，Jackson ImmunoResearch）；山羊抗小鼠 IgG-HRP（115-035-003，Jackson ImmunoResearch）；ECL 發(fā)光液（WBKLS0500，Millipore）自制曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱：規(guī)格為80 cm×80 cm×40 cm敞形立方形，箱壁四面為黑色、箱底為白色，箱底為25個(gè)16 cm×16 cm的正方形。自制束縛袋：規(guī)格為15 cm×20 cm的帆布袋。針灸針為中研太和牌規(guī)格為0.25 mm×25 mm的毫針，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司。電針儀規(guī)格為SDZ-Ⅱ的華佗牌。蔗糖生產(chǎn)于天津市北辰方正試劑廠。低溫冷凍離心機(jī)（Fresco17，美國熱電ThermoFisher）；精密天平（Quintix35-1CN，德國賽多利斯Sartorius）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將10只Wistar大鼠設(shè)為正常組，將30只WKY大鼠隨機(jī)平均分為電針組、假針組、模型組，實(shí)驗(yàn)開始前1 d測(cè)量大鼠體質(zhì)量。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作 正常組和模型組，常規(guī)喂養(yǎng)，不予實(shí)驗(yàn)操作。電針組：10只WKY大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。使用自制布袋將WKY大鼠四肢進(jìn)行束縛，參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》定位“百會(huì)”和“印堂”，選用規(guī)格為0.25 mm×25 mm毫針，為避免實(shí)驗(yàn)差異，針刺操作始終由1人完成?！鞍贂?huì)”向后頭部，“印堂”向鼻尖方向予以平刺，針刺深度為5～10 mm。針刺后連接電針儀，正極與“百會(huì)”相連，負(fù)極與“印堂”相連，予頻率為2 Hz的連續(xù)波，電流由0.1 mA開始逐漸增大，以頭部出現(xiàn)微微顫動(dòng)而不掙扎、嘶叫為度，治療時(shí)間每次20 min，共治療21 d。治療過程中注意觀察大鼠是否耐受，如出現(xiàn)掙脫，及時(shí)予以調(diào)整電針及安撫大鼠。另外，注意保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的安靜，避免因其他原因造成的聲響使大鼠受到驚嚇。假針組：WKY大鼠10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。采取同樣的束縛方法將大鼠固定，使用同規(guī)格的針灸針刺入大鼠“百會(huì)”和“印堂”的皮層，刺入深度為1～2 mm，不刺入肌肉層，以防止非特異性針刺效應(yīng)，將針灸針與電針儀導(dǎo)線相連，但不通電。留針時(shí)間、治療療程及其他注意事項(xiàng)均與電針組相同。各組治療21 d后測(cè)定實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、糖水消耗量、mTOR和GSK-3β蛋白表達(dá)水平。

1.4 行為學(xué)測(cè)定 體質(zhì)量檢測(cè)：觀察實(shí)驗(yàn)前1 d和結(jié)束后各組大鼠體質(zhì)量的變化并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)開始前1 d、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境安靜，將大鼠放入箱底的最中間方格內(nèi)，兩名實(shí)驗(yàn)記錄者分別記錄大鼠在5 min內(nèi)的水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)的次數(shù)。大鼠3只腳跨越箱底橫格數(shù)記為水平運(yùn)動(dòng)1分；大鼠兩前肢騰空或攀附箱側(cè)壁記為垂直運(yùn)動(dòng)1分。每只大鼠檢測(cè)1次，檢測(cè)完清理大鼠殘余大小便，并用75%醫(yī)用酒精對(duì)曠場(chǎng)箱底進(jìn)行清潔擦拭，避免上1只大鼠遺留的氣味影響下1只大鼠的實(shí)驗(yàn)測(cè)評(píng)，待箱底酒精揮發(fā)后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)開始前4 d，予大鼠適應(yīng)性雙瓶飲用1%蔗糖水。第1天，兩瓶均裝1%蔗糖水；第2天，1瓶裝純凈水，1瓶裝1%蔗糖水；第3天，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食禁水。禁食禁水24 h后，在下午14：00-15：00，每籠同時(shí)予以提前稱好的 2瓶水：1瓶純凈水，1瓶1%蔗糖水，2 h后交換瓶子位置，4 h后取走2瓶，分別進(jìn)行稱重。計(jì)算公式：糖水偏好指數(shù)=糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）×100%。該實(shí)驗(yàn)分別于針刺治療前、治療后進(jìn)行測(cè)試。

1.6 Western Blot法 行為學(xué)檢測(cè)第2天后，麻醉后進(jìn)行固定斷頭冰板取大鼠額葉組織，RIPA溶液裂解后，提取蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，將濃度調(diào)成一致。電泳條件：濃縮膠80 v恒壓，約30 min后分離膠120 v恒壓，300 mA轉(zhuǎn)膜約1.5 h。電泳后用5%牛奶-TBST（5g的脫脂奶粉溶到95 mL的TBST溶液中）封閉 1 h，然后浸泡于一抗溶液（mTOR，1∶1 000；GSK-3β，1∶2 000）4℃過夜，用 TBST 洗膜 3次，每次5 min，然后加入二抗溶液（Goat-Anti-Rabbit IgGHRP，1∶10 000）孵育 1 h，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min后，用ECL發(fā)光試劑曝光成像并運(yùn)用Image J軟件分析蛋白灰度值。

Western Blot分析方法及相關(guān)蛋白條帶圖：得到目標(biāo)條帶，保存白色背景8位tiff格式，導(dǎo)入Image J進(jìn)行反轉(zhuǎn)，選中每個(gè)條帶，使用Bandpeak quantification插件，自動(dòng)分析條帶背景并得出目標(biāo)條帶灰度值，將檢測(cè)指標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參（β-actin）灰度值相比，得出相對(duì)灰度以反映相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS25.0對(duì)上述行為學(xué)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)數(shù)據(jù)做正態(tài)分布檢驗(yàn)和組間方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊的要求，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）比較各組間的差異；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 電針可以治療抑郁大鼠體質(zhì)量減輕的癥狀 治療前，正常組（Wistar大鼠）體質(zhì)量明顯高于其它組，而WKY大鼠3組間無顯著差異。治療后電針組大鼠的體質(zhì)量明顯高于假針組（表1）。結(jié)果表明，WKY大鼠有體質(zhì)量減輕的臨床癥狀，而電針可以阻止抑郁大鼠的體質(zhì)量減輕。

表1 大鼠治療前后體質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果（±s，n=10，g）

表1 大鼠治療前后體質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果（±s，n=10，g）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與電針組比較，#P＜0.05。

別 治療前 治療后正常組 2 7 0.1 9±5.7 8 4 1 1.0 9±1 4.1 5模型組 2 4 2.2 7±4.7 9* 2 7 9.8 9±7.4 5*假針組 2 4 5.3 1±6.0 2* 2 8 4.5 9±1 2.6 0#電針組 2 4 4.9 6±6.1 9* 3 1 4.2 5±1 1.6 1

2.2 電針可以增加抑郁大鼠的水平運(yùn)動(dòng)能力 治療前，正常組（Wistar大鼠）的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯大其它組，而WKY大鼠3組間無顯著差異。治療后電針組的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)大于假針組（表2）。

表2 大鼠治療前后曠場(chǎng)水平運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)測(cè)評(píng)結(jié)果（±s，n=10，分）

表2 大鼠治療前后曠場(chǎng)水平運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)測(cè)評(píng)結(jié)果（±s，n=10，分）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與電針組比較，#P＜0.05。

組別 治療前 治療后正常組 4 6.2 0±3.3 3 4 6.5 0±4.4 5模型組 1 7.8 0±2.6 2* 1 4.4 0±2.7 2*假針組 1 8.6 0±4.9 5* 1 5.4 0±4.2 0#電針組 1 8.1 0±4.3 8* 2 2.3 0±5.2 9

2.3 電針可以增加抑郁大鼠的垂直運(yùn)動(dòng)能力 治療前，正常組（Wistar大鼠）的垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)明顯大于其它組，而WKY大鼠3組間無顯著差異。治療后電針組高于假針組的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)，具有顯著差異（表 3）。

表3 大鼠治療前后曠場(chǎng)垂直運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)測(cè)評(píng)結(jié)果（±s，n=10，分）

表3 大鼠治療前后曠場(chǎng)垂直運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)測(cè)評(píng)結(jié)果（±s，n=10，分）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與電針組比較，#P＜0.05。

組別 治療前 治療后正常組 2 3.6 0±2.1 2 2 3.0 0±2.4 0模型組 5.4 0±1.5 8* 5.4 0±2.0 7*假針組 5.8 0±1.2 3* 6.1 0±1.7 3#電針組 5.9 0±1.5 2* 1 0.6 0±2.1 7

2.4 電針可以改善抑郁大鼠的快感缺失 治療前，正常組（Wistar大鼠）的糖水消耗百分比明顯多于其它組，而WKY 3組之間無顯著差異。治療后電針組大鼠的糖水消耗百分比高于假針組（表4）。這說明與正常組相比，模型組WKY大鼠的糖水喜好率明顯下降，而電針可以增加抑郁大鼠的糖水喜好率。

表4 大鼠實(shí)驗(yàn)前后糖水消耗百分比比較（±s，n=10，%）

表4 大鼠實(shí)驗(yàn)前后糖水消耗百分比比較（±s，n=10，%）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與電針組比較，#P＜0.05。

組別 治療前 治療后正常組 4 3.7 1±3.7 6 4 2.3 3±3.0 4模型組 1 7.9 1±2.6 2* 1 7.6 0±1.5 9*假針組 1 9.6 5±3.3 7* 1 8.5 6±2.2 9#電針組 1 9.4 5±1 3.1 1* 2 5.5 9±3.1 1

2.5 電針治療后WKY大鼠前額皮層mTOR和GSK-3β的蛋白表達(dá) 與正常組相比，電針組、假針組、模型組mTOR蛋白表達(dá)水平降低，GSK-3β蛋白表達(dá)水平升高；與假針組相比，電針組mTOR蛋白表達(dá)水平升高，GSK-3β蛋白表達(dá)水平降低（圖1、表5）。

圖1 不同組別的mTOR和GSK-3β蛋白表達(dá)

表5 大鼠前額皮層突觸相關(guān)蛋白mTOR和GSK-3β的表達(dá)水平（±s，n=10）

表5 大鼠前額皮層突觸相關(guān)蛋白mTOR和GSK-3β的表達(dá)水平（±s，n=10）

注：源自圖1的定量分析。與正常組比較，*P＜0.05；與電針組比較，#P＜0.05。

組別 m T O R（相對(duì)灰度） G S K-3 β（相對(duì)灰度）正常組 1.0 4±0.3 1 0.7 5±0.8 7模型組 0.4 5±0.9 8* 2.7 0±0.7 5*假針組 0.4 5±0.2 3# 2.6 7±0.7 8#電針組 0.7 5±0.2 0 1.5 4±0.1 3

3 討論

中醫(yī)對(duì)于抑郁癥早有記載，主要將其歸為“郁證”、“百合病”等，多因情志不舒、飲食不節(jié)、憂思過度，其病機(jī)主要涉及肝失疏泄、心失所養(yǎng)、脾失運(yùn)化，產(chǎn)生瘀血、痰濕等病理產(chǎn)物，繼而致氣機(jī)不暢，臟腑氣血陰陽失調(diào)郁而發(fā)病[14]。抑郁癥其病位在腦，腦為髓海，又為元神之府，主人體精神活動(dòng)，督脈入顱腦絡(luò)，總督全身陽經(jīng)氣血故取督脈穴“百會(huì)”和“印堂”以安神解郁[8]?！鞍贂?huì)”為百脈交會(huì)之處，“承天氣”為督脈與諸陽經(jīng)和足厥陰肝經(jīng)交會(huì)之處，此處陽氣較盛，針刺此處具有調(diào)神醒腦、升陽補(bǔ)虛的功效[15]。印堂位于兩眉中心，與督脈相關(guān)聯(lián)，印堂-督脈-腦調(diào)理論，具有安神通絡(luò)作用，可以調(diào)理全身氣血[8，16]。現(xiàn)代研究基于督脈調(diào)神理論將“百會(huì)”和“印堂”作為針刺治療抑郁癥的首選穴。

關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，突觸可塑性調(diào)控不良是抑郁癥新興的病因理論，可導(dǎo)致大腦區(qū)域信號(hào)連接障礙或減少，造成抑郁癥的發(fā)生[17]。研究表明阻斷突觸可塑性會(huì)導(dǎo)致前額葉皮質(zhì)突觸減弱，神經(jīng)元萎縮，而且在抑郁癥患者大腦中發(fā)現(xiàn)前額葉皮質(zhì)體積減小和脊柱樹突數(shù)量減少及功能的減弱現(xiàn)象[18]。有證據(jù)表明，WKY模型中存在著與突觸可塑性相關(guān)的電路特異性缺陷，且與抑郁患者有相近的臨床癥狀包括減重、低運(yùn)動(dòng)、降低蔗糖獲取、新奇性減退、缺乏激勵(lì)動(dòng)機(jī)等有關(guān)[19]。本實(shí)驗(yàn)表明電針可恢復(fù)抑郁大鼠的體質(zhì)量，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)行為，增加探索力和獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制，增加mTOR水平，降低GSK-3β水平，從而改善WKY大鼠的抑郁行為。尸檢中發(fā)現(xiàn)，抑郁患者額葉皮質(zhì)中mTOR有明顯缺陷，而GSK-3β的活動(dòng)可增加情感障礙，造成突觸缺陷，引起抑郁癥的發(fā)生[20]。mToR是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋落和蛋白質(zhì)合成的靶點(diǎn)，而激活則可以增加樹突的成熟和功能所需的一些蛋白質(zhì)的合成。抑制或下調(diào)GSK-3β可以負(fù)向調(diào)節(jié)mToRc1，從而可以有效保護(hù)新生的突觸細(xì)胞的丟失，緩解抑郁癥患者的不良情緒[21]。因此，電針改善WKY大鼠的抑郁狀態(tài)，可能與上調(diào)前額皮層mTOR，下調(diào)GSK-3β有關(guān)。

綜上所述，通過測(cè)定WKY大鼠行為學(xué)和額葉相關(guān)蛋白mTOR和GSK-3β的表達(dá)水平，可以得出電針可以有效改善WKY大鼠的抑郁狀態(tài)，恢復(fù)突觸可塑性，本研究為電針治療抑郁癥提供了科學(xué)依據(jù)。