莫金英 余 希 周 靜 肖蒲軍 瞿志軍

深圳市龍崗中心醫(yī)院感染科，廣東深圳 518116

據(jù)統(tǒng)計，全球大約有2.4億人感染乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）。在我國，HBV的感染者超過9000萬例。目前，主要通過核苷（酸）類藥物[nucleos （t）ide analogues，NAs]抑制乙肝病毒脫氧核糖核酸（hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV DNA）的復制，延緩肝硬化、肝癌的發(fā)生。長期的抗病毒治療不僅會帶來乳酸酸中毒、腎功能損害、肌炎等藥物相關(guān)毒副作用，還會增加患者的經(jīng)濟及心理負擔，部分患者因無法忍受長期服藥而自行停藥，從而導致肝炎再活動甚至肝衰竭、肝硬化的發(fā)生。因此，尋找有效的生物學標志物評估患者停藥的安全性仍是慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）治療中急需解決的問題之一。共價閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸（covalently closed circular deoxyribonucleic acid，cccDNA）是導致CHB患者停藥后復發(fā)的重要原因。相關(guān)研究表明，乙肝病毒前基因組核糖核酸（hepatitis B virus prege nomic ribonucleic acid，HBVpgRNA）是HBV復制的中間產(chǎn)物，由cccDNA轉(zhuǎn)錄而來，與肝細胞內(nèi)的cccDNA轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)。本研究主要比較CHB患者停用NAs治療后病毒學復發(fā)組與未復發(fā)組患者血清中HBVpgRNA、乙肝病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）等相關(guān)指標的差異性，探討HBVpgRNA表達水平對CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年1月深圳市龍崗中心醫(yī)院肝病門診就診的42例CHB停藥患者作為研究對象，對入組患者進行24個月的隨訪，將病毒學復發(fā)作為隨訪終點，根據(jù)隨訪結(jié)果分為病毒學復發(fā)組（20例）和未復發(fā)組（22例）。病毒學復發(fā)組中，男16例，女4例；年齡30～50歲，平均（39.50±5.99）歲。未復發(fā)組中，男18例，女4例；年齡28～53歲，平均（42.27± 7.09）歲。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。停藥時病毒學復發(fā)組有7例患者的HBVpgRNA檢測陽性，未復發(fā)組有2例HBVpgRNA檢測陽性。兩組間的HBVpgRNA檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。納入標準：①CHB患者停藥前接受NAs治療4年；②停藥時乙肝病毒e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陰性，且HBV DNA＜20 U/ml，肝功能丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ala nine aminotransferase，ALT）、門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）均在正常值范圍內(nèi)。排除標準：①合并其他病毒如丙型肝炎病毒、艾滋病病毒感染者；②合并自身免疫性肝病或其他結(jié)締組織病需長期使用激素或免疫抑制劑治療者；③合并肝癌或肝硬化患者；④合并妊娠的患者?；颊呒捌浼覍倬橥獗狙芯?，且本研究經(jīng)深圳市龍崗中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批[批準文號：20210426022（SZLG）250001]。

1.2 方法

分別于患者停藥時、停藥后前3個月每個月及隨后的每3個月各采集外周血15～20 ml，室溫下用3500 r/min（離心機半徑13.5 cm）的速度離心處理10 min分離出血清。使用美國ABI Prism 7500熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀，采用磁珠法進行HBVpgRNA檢測，試劑盒購自北京熱景生物技術(shù)股份有限公司；使用美國VIIA7熒光定量PCR儀，采用熒光定量PCR技術(shù)進行HBV DNA檢測，試劑盒購自湖南圣湘生物科技股份有限公司；使用美國雅培I2000SR免疫分析儀，采用化學發(fā)光法進行乙肝五項定量測定，試劑盒購自美國雅培公司；使用羅氏全自動生化分析儀（C702-2），采用酶法檢測肝功能，試劑盒購自羅氏集團有限公司，均嚴格按說明書操作。

1.3 觀察指標及評價標準

病毒學復發(fā)定義為HBV DNA＞2000 U/ml，隨訪終點為病毒學復發(fā)，無病毒學復發(fā)患者最長隨訪24個月。比較病毒學復發(fā)組與未復發(fā)組患者停藥時及隨訪結(jié)束時的HBVpgRNA、HBsAg滴度水平，并分析與病毒學復發(fā)相關(guān)的危險因素。HBVpgRNA≥300 copies/ml為陽性，將未檢測到HBVpgRNA的樣本賦值為150 copies/ml進行數(shù)據(jù)分析。HBsAg正常范圍為0.00～0.05 U/ml，HBV DNA檢測下限值為20 U/ml，ALT正常范圍為7～40 U/L，AST正常范圍為13～35 U/L。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兩組間相關(guān)指標的比較

病毒學復發(fā)組在停藥時及隨訪結(jié)束時血清中的HBVpgRNA和HBsAg滴度水平均明顯高于未復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。病毒學復發(fā)組隨訪結(jié)束時的HBsAg和HBVpgRNA滴度水平均明顯高于停藥時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。未復發(fā)組隨訪結(jié)束時血清中的HBsAg滴度水平明顯高于停藥時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。未復發(fā)組停藥時及隨訪結(jié)束時血清中的HBVpgRNA滴度水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組患者停藥時的肝功能ALT、AST水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；隨訪結(jié)束時，病毒學復發(fā)組的ALT、AST水平顯著高于未復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組相關(guān)指標的比較（±s）

2.2 病毒學復發(fā)及預測因素分析

采用單因素COX回歸分析篩選出影響患者停藥后病毒學復發(fā)的2個相關(guān)因素，即停藥時的血清HBVpgRNA陽性、HBsAg＞1000 U/ml（表2），同時對相關(guān)因素進行賦值（表3）。停藥時血清中的HBVpgRNA陽性是導致CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的獨立危險因素（P=0.045），與HBVpgRNA陰性患者相比，HBVpgRNA陽性患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的風險明顯升高（HR=3.99，95%CI：1.03～15.38）。停藥時HBsAg＞1000 U/ml是導致CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的另一獨立危險因素（P=0.000），HBsAg＞1000 U/ml的患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的風險要明顯高于HBsAg≤1000 U/ml患者（HR=20.81，95%CI：4.66～92.99）（表4）。

表2 單因素回歸分析篩選出相關(guān)因素

表3 相關(guān)因素賦值

表4 多因素回歸分析結(jié)果

2.3 乙肝病毒前基因組核糖核酸與乙肝病毒表面抗原預測病毒學復發(fā)的效能

ROC曲線顯示，HBVpgRNA單獨預測CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的曲線下面積（the area under the curve，AUC）為0.857（95%CI：0.71～0.95，P＜0.05），敏感性為65.00%，特異性為100.00%。HBsAg單獨預測CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的AUC為0.886 （95%CI：0.75～0.96，P＜0.05），敏感性為90.00%，特異性為77.27%。HBsAg與HBVpgRNA聯(lián)合檢測的AUC為0.936，與兩者單獨預測的AUC值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），敏感性為90.00%，特異性為86.36%（表5、圖1）。

圖1 乙肝病毒前基因組核糖核酸與乙肝病毒表面抗原預測病毒學復發(fā)的ROC曲線圖

表5 乙肝病毒前基因組核糖核酸與乙肝病毒表面抗原預測病毒學復發(fā)的效能

3 討論

目前，在現(xiàn)有的國內(nèi)外的CHB防治指南中并未提出能有效預測NAs安全停藥的生物學標志物。既往主要依據(jù)HBeAg血清學轉(zhuǎn)換、HBVDNA轉(zhuǎn)陰、肝功能ALT復常等情況為患者提供停藥建議，但復發(fā)率非常高。還有研究建議結(jié)合HBsAg檢測情況評估患者停藥的安全性，但結(jié)果并不理想。相關(guān)研究認為，CHB患者停用抗病毒藥物時的HBsAg表達水平與停藥后的病毒學復發(fā)無明顯相關(guān)性。因此，尋找能有效預測NAs安全停藥的生物學標志物指導CHB患者停藥具有非常重要的臨床意義。

HBVpgRNA是cccDNA最長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其長度大約為3.5 kb。相關(guān)研究證實，cccDNA轉(zhuǎn)錄為HBVpgRNA的過程不會被NAs的治療所阻斷。在本研究中，42例經(jīng)過4年及以上長期使用NAs治療的CHB患者在停藥時HBVDNA＜20 U/ml的情況下，仍有9例患者的HBVpgRNA檢測陽性；同時，病毒學復發(fā)組在停藥時基線及出現(xiàn)病毒學復發(fā)時血清中的HBVpgRNA和HBsAg滴度水平均明顯高于未復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示在停藥時如果CHB患者血清中還檢測到HBVpgRNA存在，則肝細胞內(nèi)仍然存在具有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA，預示停藥后復發(fā)風險大。另一項研究也顯示，相對于其他病毒學標志物，血清中的HBVpgRNA表達水平在NAs治療的背景下可以更好地反映肝細胞內(nèi)cccDNA的活性。小樣本臨床研究顯示，停藥時血清HBVpgRNA的表達水平可以預測停藥后HBV反彈的情況。在本研究中，多因素COX回歸分析顯示，停藥時血清中的HBVpgRNA陽性是導致病毒學復發(fā)的獨立危險因素（HR=3.99，95%CI：1.03～15.38，P=0.045），停藥時的HBsAg＞1000 U/ml是導致病毒學復發(fā)的另一獨立危險因素（HR=20.81，95%CI：4.66～92.99，P=＜0.001），這與Fan等的研究結(jié)果相類似。Fan等對40例患者（初治時HBeAg陽性，使用恩替卡韋或替諾福韋治療）進行停藥后隨訪5.5年發(fā)現(xiàn)，停藥時HBV DNA及HBV RNA檢測均為陰性的患者4年后的臨床復發(fā)比例（2/35）明顯低于HBV DNA或RNA陽性的患者（32/ 102）（P=0.018）。但是，在另一項研究中卻顯示，HB-sAg≤100 U/ml可作為指導CHB患者安全停藥的獨立預測因子，而HBV RNA的表達水平不是預測患者停藥后出現(xiàn)病毒學或臨床復發(fā)的獨立危險因素。這些研究結(jié)果的差異可能與停藥時患者的HBeAg狀態(tài)、HBsAg滴度水平以及HBV RNA檢測的敏感性有關(guān)。此外，本研究的ROC曲線結(jié)果顯示，HBVpgRNA表達水平對CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)具有較好的預測價值，AUC為0.857，特異性為100%，但敏感性較差（僅為65.00%）；與HBsAg聯(lián)合檢測后，AUC高達0.936，敏感性也提高到90%，可以為CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的判斷提供輔助依據(jù)。由此可見，停藥時患者血清中的HBVpgRNA和HBsAg表達水平可以作為CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的預測因子，對指導CHB患者安全停藥具有一定的臨床參考價值。由于本研究不是多中心大數(shù)據(jù)臨床研究，研究結(jié)論可能會存在一定的偏倚，關(guān)于HBVpgRNA 在CHB患者安全停藥方面的價值仍有待更多的臨床研究進一步證實。

綜上所述，病毒學復發(fā)患者停藥時的HBVpgRNA及HBsAg表達水平均顯著高于未復發(fā)患者，HBVpgRNA陽性和HBsAg＞1000 U/ml是CHB患者停藥后出現(xiàn)病毒學復發(fā)的獨立危險因素，對預測CHB患者安全停藥具有一定的臨床價值。