冉岑霞 劉思恒 李佳 彭賢貴 張洪洋

(陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院·新橋醫(yī)院 1.血液科；2.血液病醫(yī)學中心，重慶 400037)

彌漫性大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是原發(fā)于淋巴結或淋巴組織的惡性腫瘤，占中國非霍奇金淋巴瘤的50%，且30%DLBCL是難治性或者在治療后易復發(fā)[1-2]。研究發(fā)現，趨化因子可通過與靶細胞膜上的趨化因子受體特異性結合使靶細胞產生定向遷移作用，對靶向抑制腫瘤細胞轉移侵襲可能有積極意義[3-4]。趨化因子CXCL9是ELR-陰性CXC趨化因子亞家族成員之一，可被干擾素-γ(IFN-γ)誘導產生，CXCL9與其受體CXCR3結合，可聚集CXCR3+細胞，如效應T細胞、調節(jié)性T細胞(Tregs)等[5-6]。有研究發(fā)現，CXCL9、CXCR3在急性皮炎患者的皮損中表達上調[7]；利用動物實驗研究發(fā)現急性皮炎纖維化依賴于CXCL9和CXCR3，二者可能參與急性皮炎的發(fā)病機制[8]。最近一項研究報道稱，腫瘤相關樹突細胞(TADCs)可產生高水平的CXCL9并降低其抗原性以誘導T細胞增殖[9]。CXCL9、CXCR3在DLBCL中的作用較少見報道，因此本研究通過檢測DLBCL腫瘤組織中CXCL9、CXCR3表達水平與患者病理特征的關系，初步討論其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月～2016年1月在我院采用R-CHOP化療方案治療的92例DLBCL患者，均通過淋巴結活檢獲取DLBCL腫瘤組織標本，及50例病灶旁正常淋巴組織標本。標本均用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4℃保存。92例患者中男性51例，女性41例，年齡24～83歲，平均(55.69±7.12)歲；原發(fā)部位：腹股溝淋巴結39例，胃腸道27例，頸部17例，其他9例；Ann Arbor分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期19例，Ⅲ期35例，Ⅳ期24例；組織學分型：生發(fā)中心型52例，非生發(fā)中心型40例。所有患者均為首次治療，無合并其他腫瘤，無嚴重心、肝、腎等功能異常者；臨床資料完整。Ki67陽性率≤70% 45例，>70% 47例；乳酸脫氫酶水平正常27例，升高65例；國際預后指數(IPI)評分0～2分56例，3～4分36例。患者及家屬均已簽訂知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會批準(批準文號：1412-1601)。

1.2 方法

1.2.1 數據庫分析 GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是由北京大學團隊開發(fā)的數據庫，是一個癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據分析和可視化的網站。基于該數據庫，統(tǒng)計分析CXCL9、CXCR3 mRNA在淋巴樣腫瘤彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)組織及正常淋巴組織中的差異性表達。

1.2.2 免疫組織化學染色法檢測CXCL9、CXCR3蛋白水平 將保存的石蠟組織標本連續(xù)4 μm切片，脫蠟后進行梯度乙醇脫水，使用枸櫞酸鈉溶液進行抗原修復。一抗采用羊抗多克隆抗體試劑盒(美國Sigma公司)，室溫孵育30 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，加入二抗孵育。二氨基聯苯胺(DAB)溶液染色，蘇木素復染，風化、脫水、透明、封片。利用PBS代替一抗作為陰性對照。染色結果由兩位病理科專業(yè)醫(yī)師采用雙盲法進行讀片，采用半定量評分系統(tǒng)進行結果評定。隨機取5個高倍鏡視野，用2種評分體系評分后取平均值：①按染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，淡黃色或黃棕色2分。②按陽性細胞百分比評分：無陽性細胞記0分，≤25%記1分，26%～50%記2分，>50%記3分。將兩種評分方法所得評分相乘，乘積≥2分定義為表達陽性(+)，<2分定義為表達陰性(-)；同時定義得分乘積≥3分為高表達，<3分為低表達。

1.3 隨訪與觀察 DLBCL患者開始化療時即納入觀察，采用門診復查或電話、短信等方式隨訪5年，最終隨訪時間為2021年1月1日，并獲得全部患者隨訪記錄。其中復發(fā)患者54例，未復發(fā)患者38例，分析腫瘤組織CXCL9、CXCR3蛋白表達與患者復發(fā)的關系。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析，計數資料以n或(%)表示，采用2檢驗分析CXCL9、CXCR3蛋白表達與DLBCL患者臨床病理特征的關系；采用Kaplan-Meier法分析CXCL9、CXCR3蛋白表達水平與DLBCL復發(fā)的關系；采用COX回歸分析影響DLBCL患者復發(fā)的危險因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1CXCL9、CXCR3基因在DL-BC腫瘤組織和正常淋巴組織中的表達情況 分析TCGA數據庫中47例DL-BC腫瘤組織和337例正常淋巴組織中CXCL9、CXCR3基因的表達水平，結果顯示CXCL9、CXCR3基因在DLBCL腫瘤組織中表達水平與正常淋巴組織比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 TCGA數據庫中CXCL9、CXCR3基因在DLBCL腫瘤組織和正常淋巴組織中的表達

2.2 CXCL9、CXCR3免疫組化結果及在DLBCL腫瘤組織中的陽性表達 免疫組化結果顯示，CXCL9、CXCR3主要定位于細胞質或者細胞膜(見圖2)。CXCL9、CXCR3蛋白在DLBCL腫瘤組織中的陽性表達率明顯高于其在正常淋巴組織組織中的陽性表達率(P<0.05)，見表1。

表1 CXCL9、CXCR3蛋白在DLBCL腫瘤組織和正常淋巴組織中的表達情況比較[n(×10-2)]

圖2 CXCL9、CXCR3蛋白在DLBCL腫瘤組織和正常淋巴組織中的染色結果(SP, 200×)

2.3 DLBCL腫瘤組織中CXCL9、CXCR3蛋白的表達關系 本研究結果顯示，CXCL9蛋白與CXCR3蛋白共表達陽性DLBCL患者46例，共表達陰性DLBCL患者21例，僅CXCL9蛋白陽性表達的DLBCL患者14例，僅CXCR3蛋白陽性表達的DLBCL患者11例，差異有統(tǒng)計學意義(2=15.836，P<0.001)，見表2。

表2 DLBCL腫瘤組織中CXCL9、CXCR3蛋白的表達關系

2.4 CXCL9、CXCR3蛋白表達水平與DLBCL患者臨床病理特征的關系 CXCL9、CXCR3蛋白表達水平與DLBCL患者年齡、性別、原發(fā)部位、乳酸脫氫酶水平、IPI評分無關(P>0.05)，與Ann Arbor分期、組織學分型、Ki67陽性率有關(P<0.05)，見表3。

表3 CXCL9、CXCR3蛋白表達水平與DLBCL患者臨床病理特征的關系

2.5 CXCL9、CXCR3蛋白表達水平與DLBCL復發(fā)的關系 DLBCL患者腫瘤組織CXCL9高表達組5年累積復發(fā)率明顯高于低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(68.52%vs36.84%,2=9.788，P<0.001)；CXCR3高表達組5年累積復發(fā)率，明顯高于低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(73.68%vs28.57%,2=17.610，P<0.001)，見圖3。

圖3 CXCL9、CXCR3蛋白表達水平與DLBCL復發(fā)的關系

2.6 影響DLBCL患者復發(fā)的危險因素分析 單因素分析結果顯示，CXCL9、CXCR3、Ann Arbor分期、組織學分型、Ki67陽性率是影響DLBCL患者復發(fā)的危險因素(P<0.05)；多因素分析結果顯示，CXCL9高表達、CXCR3高表達、Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期、非生發(fā)中心型是影響DLBCL患者復發(fā)的獨立危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響DLBCL患者復發(fā)的危險因素分析

3 討論

DLBCL是一種常見的侵襲性淋巴瘤，由于淋巴系統(tǒng)的分布特點，使得淋巴瘤成為一種全身性疾病，幾乎可侵犯到全身的任何組織和器官[10-11]。DLBCL的發(fā)病機制和原因尚不明確，患者確診時大多已處于晚期，治療效果及藥物耐受性均較差，嚴重威脅患者生命健康。近年來，生物標志物在腫瘤早期診斷及復發(fā)中的作用研究成為熱點。

趨化因子是一類誘導趨化、促進免疫細胞分化、引起組織外滲的蛋白質，其在腫瘤環(huán)境中的抗腫瘤免疫反應作用越來越引起人們關注[12]。CXCL9是一種被IFN-γ誘導產生的單核因子，可在炎癥條件下由腫瘤微環(huán)境中的髓細胞產生；另外CXCL9介導淋巴細胞和各種免疫細胞，包括活化的T細胞和自然殺傷細胞，并已被證明在免疫檢查點療法中發(fā)揮作用[13]。Razis等[14]研究發(fā)現，趨化因子CXCL9與乳腺癌亞型和不良預后相關，可作為乳腺癌患者預后的生物標志物。DLBCL的發(fā)生、發(fā)展受多種因素、多條信號通路調節(jié)[15]，CXCL9在DLBCL中的作用方式和機制尚未闡明。Cheng等[16]報道稱，CXCL9在DLBCL組織和細胞系中均呈高表達，并與患者臨床進展和較短總生存期密切相關，且其以β-catenin蛋白依賴的方式促進腫瘤進展，這為CXCL9作為DLBCL腫瘤的潛在治療靶點提供依據。本研究首先利用TCGA數據庫查詢可知，CXCL9基因在淋巴樣腫瘤彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)中表達水平高于正常組織，利用免疫組化染色結果顯示，CXCL9蛋白在DLBCL腫瘤組織中的陽性表達率明顯高于正常淋巴組織，免疫印跡法進一步證實CXCL9蛋白表達水平在腫瘤組織中表達上調，表明CXCL9在DLBCL中發(fā)揮癌基因作用，可能參與DLBCL腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程。進一步分析結果顯示，CXCL9蛋白水平與DLBCL患者Ann Arbor分期、組織學分型、Ki67陽性率有關，與患者年齡、性別、原發(fā)部位、乳酸脫氫酶水平、IPI評分無關，Ann Arbor Ⅲ～Ⅳ期、非生發(fā)中心型、Ki67陽性率>70%的DLBCL患者腫瘤組織CXCL9高表達占比更高。國內學者龔予希等[17]研究發(fā)現，DLBCL患者分期Ⅲ～Ⅳ期、IPI評分3～5分是DLBCL患者發(fā)生復發(fā)的危險因素，與本研究結果稍有差異，推測可能與地域因素、檢測方法、納入病例數等有關。后續(xù)應擴大樣本量，進一步開展多中心、前瞻性研究以對本研究結果進行驗證。

研究發(fā)現，CXCL9、CXCL10、CXCL11/CXCR3軸可調節(jié)免疫細胞遷移、分化和激活，導致腫瘤抑制(旁分泌軸)，然而也有研究報道該軸參與腫瘤的發(fā)展、轉移(自分泌軸)[18-20]。CXCL9可以直接作用于表達CXCR3受體的腫瘤細胞，促進細胞遷移和上皮間質轉化[21-22]。Bai等[23]的最新一項研究利用基因表達譜交互分析評估DLBCL和橋本甲狀腺炎的重疊差異表達基因(DEGs)，結果顯示鑒定出的15個基因中CXCR3在DLBCL中表達高于正常組織，與本研究結果一致。本研究利用TCGA數據庫可知，CXCR3基因在DLBCL腫瘤組織中的表達水平明顯高于正常組織，其免疫組化結果顯示CXCR3蛋白陽性表達率在DLBCL患者腫瘤組織中表達升高，主要表達于細胞質或細胞膜，其表達水平與患者Ann Arbor分期有關，表明CXCR3表達上調參與DLBCL發(fā)展進程，發(fā)揮癌基因作用。另有研究發(fā)現，致表皮B細胞淋巴瘤的CD20陽性腫瘤細胞表達CXCR3，與其特異性配體結合可能導致患者病情進展緩慢，提示CXCR3在不同類型B細胞淋巴瘤中可能與其配體結合發(fā)揮不同的生理作用[24]。本研究結果顯示，CXCR3蛋白在DLBCL腫瘤組織中表達水平明顯高于正常淋巴組織，其表達水平與腫瘤Ann Arbor分期、組織學分型、Ki67陽性率有關，Ann Arbor Ⅲ～Ⅳ期、非生發(fā)中心型、Ki67陽性率>70%的患者腫瘤組織中CXCR3高表達人數占比更大，表明高水平的CXCR3與腫瘤細胞遷移、浸潤及增殖活性有關。進一步分析患者預后發(fā)現，高水平CXCL9、高水平CXCR3的DLBCL患者復發(fā)率明顯升高；COX回歸分析結果顯示CXCL9高表達、CXCR3高表達、Ann Arbor Ⅲ～Ⅳ期、非生發(fā)中心型時，DLBCL患者5年復發(fā)的風險增加，表明CXCL9、CXCR3可能成為DLBCL患者5年復發(fā)的潛在指標。

4 結論與啟示

趨化因子CXCL9及其受體CXCR3在DLBCL患者腫瘤組織中高表達，且二者表達存在一定相關性，表明CXCL9、CXCR3可能共同作用參與DLBCL發(fā)生發(fā)展過程，高水平的CXCL9、CXCR3提示DLBCL患者5年復發(fā)風險增加，為臨床指示DLBCL患者預后提供潛在生物指標。