宋金恬，羅玉秋，陳雪梅，鄧慶雯，伍國(guó)俊，黃志華 綜述 趙會(huì)民 審校

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530007；2.廣西重點(diǎn)急危重癥實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007

我國(guó)臨床用血需求快速增長(zhǎng)，供血緊張問題長(zhǎng)期存在，對(duì)紅細(xì)胞替代物有巨大需求[1-3]。幾十年來，血紅蛋白氧載體(hemoglobin based oxygen carrier，HBOC)研發(fā)領(lǐng)域已取得豐富進(jìn)展，但受血紅蛋白基本結(jié)構(gòu)特性制約，在循環(huán)半衰期過短與縮血管副作用方面進(jìn)展緩慢，至今難以向臨床轉(zhuǎn)化[4-6]。血紫蛋白(hemerythrin，Hr)屬于呼吸蛋白家族成員，生理情況下不依賴紅細(xì)胞發(fā)揮攜氧作用，天然具備較哺乳動(dòng)物血紅蛋白(hemoglobin，Hb)更佳的理化穩(wěn)定性和血液相容性，有希望成為新型紅細(xì)胞替代品，是國(guó)際氧載體研發(fā)新動(dòng)向?，F(xiàn)就Hr分離提純、結(jié)構(gòu)鑒定、氧載體構(gòu)建和性能驗(yàn)證等方面的新進(jìn)展綜述如下：

1 Hr的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

Hr屬呼吸蛋白家族成員，主要存在于刺胞動(dòng)物門、星蟲動(dòng)物門、腕足動(dòng)物門、鰓曳動(dòng)物門、環(huán)節(jié)動(dòng)物門、以及某些細(xì)菌、真菌和原蟲中，攜氧中心為多肽和鐵原子，非卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)，與氧結(jié)合時(shí)呈紫色，脫氧時(shí)呈褐色[7]。蚯蚓沒有紅細(xì)胞，Hr只存在于血液中，而星蟲的Hr在紅細(xì)胞與血漿中均有分布，目前研究資料主要來源于蚯蚓。

Hr分子是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多聚體。Hr分子包含144個(gè)珠蛋白和36個(gè)連接蛋白，其組裝首先由四種珠蛋白亞基(A、B、C和D1、D2或D3)形成十二聚體，再與四種連接蛋白(L1、L2、L3和/或L4)形成的三聚體聚合為原聚體，最后12個(gè)原聚體結(jié)合形成直徑約30 nm的六邊形雙層高級(jí)多聚體，見圖1[8]。這種組裝依賴亞基和連接蛋白的氨基酸序列及特定空間結(jié)構(gòu)，其中連接蛋白可能起核心作用，特別是三股螺旋線圈的正確排列[9]?；钚灾行臑棣?O橋聯(lián)的雙核鐵配合物與附近多個(gè)氨基酸殘基配位，捕捉或釋放氧分子，見圖2[10]。

圖1 Hr空間結(jié)構(gòu)圖

圖2 脫氧Hr(A)和氧合Hr(B)的活性中心模型[10]

Hr的分子量巨大。目前Hr的分子量測(cè)定結(jié)果尚不完全一致，比較公認(rèn)的是3.6 MDa的十二聚體模型。然而一些學(xué)者通過光散射或超離心等不同手段檢測(cè)出Hr的分子量4.1～4.4 MDa[11]，導(dǎo)致這種差異的主要原因可能在于天然Hr包含3.6 MDa單體及一系列不同大小的多聚物。哺乳動(dòng)物和人類的Hb是分子量為64.5 kDa的四聚體結(jié)構(gòu)，直徑為5～7 nm，失去紅細(xì)胞保護(hù)后很容易解離成更小的二聚體，通過血管內(nèi)皮間隙中滲出，引起縮血管反應(yīng)，誘發(fā)高血壓、腎毒性等并發(fā)癥。而Hr由于超大分子量和尺寸不會(huì)滲漏到血管外，理論上循環(huán)滯留時(shí)間更長(zhǎng)，也不易產(chǎn)生血壓升高、腎毒性等問題。此外，Hr巨大的表面積還可以充當(dāng)陽離子交換樹脂，結(jié)合某些離子、小分子或活性蛋白分子，具有天然免疫作用，在氧載體開發(fā)方面有明顯優(yōu)勢(shì)[12]。

Hr有良好的攜氧活性。不同品種蚯蚓的Hr的結(jié)構(gòu)和活性存在差異。目前的Hr主要來自陸正蚓[13]、赤子愛勝蚓[14]、優(yōu)雅遠(yuǎn)環(huán)蚓[15]、巴西蚯蚓[16]及海洋多毛綱沙蠋[17]等，雖然均有相似的六邊形雙層結(jié)構(gòu)，但在氨基酸序列上不全相同，理化特性也有較大差別。ZIMMERMAN等[14]報(bào)道了6種寡毛綱環(huán)節(jié)動(dòng)物的Hr在氧化速率、等電點(diǎn)、熱穩(wěn)定性、攜氧能力等性能的差異。其中陸正蚓的血紫蛋白(lumbricus terrestris erythrocruorin，LtEc)和赤子愛勝蚓的血紫蛋白氧化速率較低且穩(wěn)定性較好，尤其LtEc具有與人類全血相似的氧親和力，被認(rèn)為是最有希望的候選者。而其他四種蚯蚓的Hr較易發(fā)生氧化和解離，相比之下不適合作為血液替代品，見表1[14]。HARRINGTON等[18]報(bào)道LtEc具有正氧化還原電位(Eo=112 mV)，較Hb的負(fù)氧化還原電位(Eo=-50 mV)更不容易氧化，具備無細(xì)胞HBOC的天然優(yōu)勢(shì)。

表1 不同種蚯蚓的Hr的活性比較[14](±s)

表1 不同種蚯蚓的Hr的活性比較[14](±s)

注：LtEc，Lumbricus terrestris erythrocruorin(陸正蚓血紫蛋白)；EvEc，Eisenia veneta erythrocruorin(威尼斯愛勝蚓血紫蛋白)；EhEc，Eiseniahortensis erythrocruorin(赤紅艾森氏體)；EfEc，Eisenia fetida erythrocruorin(赤子愛勝蚓血紫蛋白)；EeEc，Eudrilus eugeniae erythrocruorin；AgEc，Amynthas gracilis erythrocruorin(優(yōu)雅遠(yuǎn)環(huán)蚓血紫蛋白)；1 mmHg=0.133 kPa。

項(xiàng)目氧親和力(P50 mmHg)Hill系數(shù)(n)氧化速率(hr-1×103)高價(jià)鐵含量(%Fe3+)熱穩(wěn)定性(℃)LtEc 26.25±0.63 2.39±0.02 3.17±0.48 4.00 56.00 EvEc 13.62±0.30 2.13±0.01 9.79±1.65 7.40 60.00 EhEc 13.01±0.29 1.97±0.08 3.35±0.68 7.80 55.00 EfEc 12.47±0.29 2.39±0.09 1.79±0.22 14.50 57.00 EeEc 9.68±0.16 1.96±0.06 1.41±0.18 6.20 51.00 AgEc 9.29±0.15 2.16±0.11 0.85±0.18 24.70 53.00

2 Hr分離純化方法

2.1 切向流超濾法(tangential flow filtration，TFF)基于Hr的超大分子量，適當(dāng)孔徑的濾膜理論上可以用于分離純化，已經(jīng)在國(guó)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到證實(shí)。ELMER等[13]報(bào)道將陸生蚯蚓勻漿通過0.22 μm TFF過濾器去除大顆粒，然后用500 kDa TFF過濾器進(jìn)行超濾，約1 000條蚯蚓可以獲得5～10 g LtEc。但0.22 μm TFF過濾器在使用過程中容易被堵塞和污染，而且不能高壓滅菌，無法長(zhǎng)時(shí)間使用。SAVLA等[19]進(jìn)一步改用0.65 μm預(yù)過濾器，顯著減少了0.22 μm過濾器的污染，延長(zhǎng)了過濾器的使用壽命，并將獲得純度提高到99%以上。

2.2 層析法基于樣品各組分理化性質(zhì)差異，層析法以特定固相誘導(dǎo)各組分不同分布而實(shí)現(xiàn)分離，主要包括陰離子交換層析法(anion exchange chromatography，AEX)與固定化金屬親和層析法(immobilized metal affinity chromatography，IMAC)。TIMM等[20]報(bào)道了AEX與IMAC兩種方法分離LtEc，其中IMAC法使用Tosoh AF-Chelate 650 M樹脂為固定相并加載金屬螯合劑Zn2+，而AEX法使用Tosoh DEAE 650 M樹脂為固定相，均以Tris緩沖液保持pH=7.4，以乙二胺四乙酸洗脫，結(jié)果表明IMAC顯著誘導(dǎo)LtEc氧化及亞基解離，而AEX更有利于保持LtEc分子完整性和攜氧活性。另外，ZIMMERMAN等[21]研究了多種金屬離子對(duì)LtEc的鹽析效果，結(jié)果表明Zn2+獲得率最高。

2.3 其他方法新近Hr氧載體研發(fā)引起了國(guó)內(nèi)學(xué)者關(guān)注，若干實(shí)驗(yàn)室相繼使用簡(jiǎn)單設(shè)備建立了活性Hr分離純化技術(shù)，其核心技術(shù)均基于聚乙二醇-水相萃取及層析，具體萃取體系和層析方法略有不同，雖然產(chǎn)量較低，但純度較高，并且產(chǎn)品保持良好攜氧性，適合于實(shí)驗(yàn)室開展Hr氧載體的基礎(chǔ)研發(fā)工作[22-23]。

3 Hr氧載體制備技術(shù)

失去紅細(xì)胞保護(hù)的游離Hb分子很快會(huì)解離成二聚體，隨后被機(jī)體單核-內(nèi)皮系統(tǒng)捕捉降解，因此HBOC制備必須用適當(dāng)方法進(jìn)行化學(xué)修飾或生物膜封裝[24]。目前一些方法已經(jīng)在Hr中應(yīng)用并獲得良好效果。

3.1 聚乙二醇交聯(lián)法聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)的羥基可與蛋白質(zhì)的氨基、羧基分別發(fā)生酰胺反應(yīng)、酯化反應(yīng)，一些活化的PEG如馬來酰亞胺-PEG還可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)巰基的修飾。JANI等[25]報(bào)道將LtEc與2-亞氨基硫烷和馬來酰亞胺-PEG-5000在pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中于4℃下孵育過夜，完成PEG修飾后在倉(cāng)鼠稀釋貧血模型中觀察到(66.8±1.8)h的半衰期，這是單純LtEc半衰期的4倍。SAVLA等[26]的進(jìn)一步研究表明，聚乙二醇與LtEc最佳摩爾比為0.4～0.5∶1，進(jìn)一步增加交聯(lián)比將導(dǎo)致LtEc的結(jié)構(gòu)解離。

3.2 聚丙烯酸和乙二胺交聯(lián)經(jīng)活化的聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA)上的羧基可與蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行脫水縮合而實(shí)現(xiàn)共價(jià)連接，再與乙二胺(ethylenediamine，EDA)交聯(lián)可進(jìn)一步提高聚合物的穩(wěn)定性。SPIVACK等[27]先將LtEc與PAA按1∶1 000的摩爾比制備LtEc-PAA(LP)，再與EDA交聯(lián)得到LtEc-PAA-EDA偶聯(lián)物的納米粒子，顯著提高了LtEc納米粒子的熱穩(wěn)定性[Tm=(72±0.84)℃vs Tm=62±0.6)℃]和氧親和力[P50=(6.85±0.13)mmHg vs P50=(26.25±0.63)mmHg]。

3.3 戊二醛交聯(lián)戊二醛的活潑醛基，可與蛋白質(zhì)中的氨基發(fā)生醛胺縮合反應(yīng)生成希夫堿而共價(jià)交聯(lián)。RAJESH等[28]報(bào)道不同濃度的戊二醛與LtEc交聯(lián)對(duì)穩(wěn)定性有顯著影響，其中按摩爾比128∶1交聯(lián)的LtEc具有高達(dá)68℃的熔點(diǎn)，37℃下的氧親和力P50為(19.3±0.3)mmHg，在pH=10時(shí)才開始解離。HATHAZI等[29]報(bào)道一種戊二醛-紅素氧還蛋白(rubredoxin，Rbr)-Hr共聚物能夠有效抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的氧自由基釋放。此外，有學(xué)者報(bào)道Hr與戊二醛和人血清白蛋白交聯(lián)后抗原性進(jìn)一步減低[30]。

3.4 多聚糖納米微粒封裝殼聚糖是天然多聚糖，具備良好生物相容性，已成為許多蛋白和藥物的包埋介質(zhì)。吳忠平[31]報(bào)道改性殼聚糖[N-羧乙基殼聚糖(N-carboxyethylchitosan，ACS)]與三聚磷酸鈉(tripolyphosphate，TPP)在5∶2配比下獲得ACS/TPP納米囊，對(duì)LtEc的包埋率達(dá)98%左右。

4 Hr氧載體安全性與有效性評(píng)價(jià)

縮血管反應(yīng)是目前HBOC產(chǎn)品主要的嚴(yán)重不良反應(yīng)。一氧化氮(nitric oxide，NO)是血管舒縮反應(yīng)的重要調(diào)通分子，在高濃度時(shí)使血管舒張，在低濃度時(shí)使血管收縮[8]。基于哺乳動(dòng)物Hb構(gòu)建的HBOC在循環(huán)中解離后，脫氧Hb與NO結(jié)合產(chǎn)生高度穩(wěn)定的亞硝酰Hb衍生物，或通過NO與含氧Hb的NO雙加氧酶反應(yīng)產(chǎn)生高鐵血紅蛋白清除NO和硝酸鹽，進(jìn)而導(dǎo)致縮血管反應(yīng)，誘發(fā)肺動(dòng)脈高壓、體循環(huán)高血壓、卒中、腎損傷甚至猝死等嚴(yán)重不良反應(yīng)[20，25]。目前最接近臨床應(yīng)用的HBOC產(chǎn)品是經(jīng)戊二醛交聯(lián)牛Hb改性的HBOC-201，其仍無法完全避免血管收縮反應(yīng)，不良反應(yīng)發(fā)生率高，現(xiàn)僅在南非附條件使用[32-33]。盡管有學(xué)者報(bào)道在輸注HBOC-201的同時(shí)補(bǔ)充硝酸甘油(nitroglycerin，NTG)可以提高NO濃度，從而抑制縮血管反應(yīng)，但也有學(xué)者認(rèn)為補(bǔ)充NTG需要適時(shí)監(jiān)測(cè)血液NO濃度，無法穩(wěn)定發(fā)揮作用，臨床應(yīng)用前景黯淡[34-35]。盡管如此，HBOC改良研究仍在持續(xù)，一些新的產(chǎn)品不斷出現(xiàn)，比如新近報(bào)道一種新型牛Hb交聯(lián)物YQ23，在大鼠、兔、豬等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中尚未觀察到異常高血壓及相關(guān)器官損傷，有待進(jìn)一步驗(yàn)證[36-37]。還有一些產(chǎn)品尚處于試管階段，比如ROCHE等[38]報(bào)道一種基于Hr的NO雙加氧酶對(duì)NO的消耗水平低且氧化速率遠(yuǎn)低于Hb，但尚未進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)階段。

已有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明Hr氧載體具備良好的安全性和有效性。2012年美國(guó)學(xué)者ELMER等[39]報(bào)道將純化的LtEc經(jīng)靜脈輸入20只倉(cāng)鼠體內(nèi)，當(dāng)血漿濃度達(dá)到5～15 g/L時(shí)，觀察到微循環(huán)小血管輕微舒張，功能毛細(xì)血管密度(functional capillary density，F(xiàn)CD)顯著增加，而平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)無明顯升高，且未見過敏反應(yīng)等其他副作用[13]。同年ELMER等[39]也報(bào)道以血液稀釋法建立倉(cāng)鼠貧血模型(紅細(xì)胞比容hematocrit，HCT=0.18)，隨后以100 g/L的高濃度LtEc進(jìn)一步稀釋至HCT=0.11，所有動(dòng)物均能維持有效MAP，且FCD和氧輸送能力良好。JANI等[25]報(bào)道以PEG-LtEc、LtEc對(duì)倉(cāng)鼠實(shí)施40%換血處理，48 h內(nèi)未觀察到血管收縮反應(yīng)或高血壓表現(xiàn)，PEG-LtEc組能夠維持更長(zhǎng)時(shí)間的組織灌注及氧輸送指標(biāo)，循環(huán)半衰期較LtEc延長(zhǎng)4倍。2020年SAVLA等[19]報(bào)道改進(jìn)提純工藝，獲得純度高達(dá)99%的LtEc，實(shí)驗(yàn)表明倉(cāng)鼠能夠耐受更高濃度的LtEc，同時(shí)組織灌注和氧輸送指標(biāo)更好。TOMA等[40]報(bào)道，給大鼠靜脈滴注nHr(天然Hr)、pHr(戊二醛交聯(lián)的Hr)、HrHSA(人血清白蛋白交聯(lián)的Hr)、HrRbr(紅素氧還蛋白交聯(lián)的Hr)，觀察34 h后全部存活，與空白對(duì)照組相比攜氧能力維持更好，機(jī)體氧化應(yīng)激減少，但也觀察到總蛋白下降、部分抗體增加、纖維蛋白原升高、輕度腎衰和脾輕度鐵沉積等不良反應(yīng)?？傮w來看，Hr氧載體在嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具備良好的安全性和攜氧能力，但尚需中大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行多樣化驗(yàn)證。

Hr氧載體循環(huán)半衰期明顯優(yōu)于HBOC。人類同種異體濃縮紅細(xì)胞循環(huán)內(nèi)半衰期約48～51 d，游離Hb的血漿半衰期為2～4 h，經(jīng)戊二醛聚合的人Hb的半衰期為24 h，而經(jīng)戊二醛修飾的牛Hb在人體循環(huán)內(nèi)的半衰期約19～24 h[34-35]。純化LtEc在倉(cāng)鼠體內(nèi)的循環(huán)半衰期僅有13～17 h[39]，但經(jīng)PEG修飾的LtEc將循環(huán)半衰期進(jìn)一步延長(zhǎng)至(66.8±1.8)h[25]，這是目前HBOCs領(lǐng)域報(bào)道的改性Hb的最長(zhǎng)半衰期。Hr分子獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性在提升HBOC長(zhǎng)循環(huán)性能方面的優(yōu)勢(shì)相當(dāng)明顯。

5 Hr在其他方面的應(yīng)用

雖然HBOC研發(fā)的最終目標(biāo)是替代性攜氧，但在細(xì)胞保護(hù)劑等領(lǐng)域也有應(yīng)用。一些報(bào)道表明來自海洋環(huán)節(jié)動(dòng)物沙蠋的Hr作為治療性氧載體具有潛在的抗炎、抗菌和抗氧化特性，能降低缺血再灌注損傷，可在心肺肝腎胰腺的移植手術(shù)中用作移植物/器官防腐劑[41-43]。HATHAZI等[29]報(bào) 道Hr聚合物 對(duì)人臍靜 脈內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用顯著優(yōu)于聚合人Hb。EVAFISCHER-FODOR等[44]報(bào)道使用戊二醛聚合的Hr處理人淋巴細(xì)胞，24 h內(nèi)淋巴細(xì)胞的存活率顯著提升。

6 結(jié)語

Hr獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性在新型氧載體研發(fā)領(lǐng)域具備優(yōu)越潛質(zhì)。目前已能夠應(yīng)用切向流超濾法等方法有效地從蚯蚓中分離出高純度的活性Hr，若干化學(xué)改性和納米封裝技術(shù)已在Hr氧載體研發(fā)中得到應(yīng)用。初步研究結(jié)果表明在嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中可以獲得更長(zhǎng)的循環(huán)半衰期，且未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重縮血管反應(yīng)。但Hr氧載體仍缺乏中大型動(dòng)物評(píng)價(jià)，在主要臟器功能、炎癥與免疫和內(nèi)分泌等多方面的系統(tǒng)評(píng)價(jià)也明顯不足，距臨床應(yīng)用尚有很遠(yuǎn)距離。盡管如此，Hr氧載體在低毒性和更長(zhǎng)循環(huán)半衰期方面的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)初步顯現(xiàn)，是極具希望的研發(fā)方向。