田慧芹，荊雪寧，房俊楠，高熒

（山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥理教研室，山東煙臺 264100）

近年來，許多學(xué)者針對中藥提取物抗腫瘤活性進(jìn)行了廣泛深入研究。對于細(xì)梗香草皂苷的研究，十年以來成為了熱點(diǎn)，它們具有顯著的抗腫瘤增殖和誘導(dǎo)凋亡的活性。浙江大學(xué)于秀穎課題組研究發(fā)現(xiàn)，在3個單體皂苷細(xì)梗香草總皂苷-A（LC-A）、LC-B、LC-C中，LC-B 和LC-C 溶血性較強(qiáng)，制備成單體藥物具有一定的困難； 而LC-A 溶血性低，具有相對較大的研究利用價(jià)值[1]。經(jīng)過進(jìn)一步的研究，制定出了較完善的LC-A 制備工藝，并進(jìn)行了相關(guān)藥代動力學(xué)研究。山東中醫(yī)藥大學(xué)宮明華對LC-A 的體內(nèi)外抗腫瘤藥效進(jìn)行了評價(jià)，通過LC-A 在體外對幾種常見人源腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制作用研究，得到該藥的抗瘤譜，結(jié)果顯示LC-A 對結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞有明顯的抑制作用[2]。在對細(xì)梗香草總皂苷對非小細(xì)胞肺癌放療增敏作用的研究中，浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳素梅發(fā)現(xiàn)細(xì)梗香草總皂苷具有抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力[3]。LC-A對SW620細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是否也有作用，之前尚未研究。大量研究表明，結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κB信號通路的異常激活發(fā)揮了重要作用。結(jié)腸癌細(xì)胞中，核因子-κB（NF-κB ）通路持續(xù)激活，活化后的NF-κB 通過促進(jìn)B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、c-Myc、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）等下游基因的高表達(dá)，引起結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[4]。本研究進(jìn)一步檢測LC-A抑制SW620細(xì)胞增殖的活性。通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)，檢測LC-A對SW620細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。若出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果，最后將采用蛋白質(zhì)印跡（WB）法檢測侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2，MMP-9和NF-κB通路激活因子腫瘤細(xì)胞因子-α（TNF-α），環(huán)氧化酶-2（COX-2）等的表達(dá)，探討其可能的NF-κB信號通路機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 完全DMEM（高糖）培養(yǎng)基（KGM12800S，凱基生物）、不完全DMEM（高糖）培養(yǎng)基（KGM12800N，凱基生物）、FBS（10099-141，Gibco）、胰蛋白酶-EDTA消化液（T1300，Solarbio）、PBS（0.01M，pH=7.4）（KGB5001，凱基生物）、SW620（S30140、源葉生物）、LC-A（B21177，源葉生物）、CCK-8法細(xì)胞增殖檢測試劑盒（KGA317，凱基生物）、RIPA細(xì)胞裂解液（C1053，普利萊基因技術(shù)）、BCA蛋白定量試劑盒（CW0014S，康為世紀(jì))、30% 丙烯酰胺（A1010，Solarbio）、1M Tris-HCL緩沖液（pH=6.8）（T1020，Solarbio）、1.5M Tris-HCL、緩沖液（pH=8.8）（T1010，Solarbio）、SDS（151-21-3，西隴科學(xué)股份有限公司）、過硫酸銨（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）、甘氨酸（G8200，Solarbio）、四甲基乙二胺（TEMED）（T105496，阿拉丁）、Marker（#26617，Thermo）、PVDF 膜（IPVH00010，Millipore）、封閉專用脫脂奶粉（P1622，普利萊基因技術(shù)）、牛血清白蛋白（BSA）（A8020，索萊寶）、超敏發(fā)光液（RJ239676，賽默飛）結(jié)晶紫染色液（G1061，Solarbio）抗體根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)選擇，內(nèi)參一抗：Mouse Monoclonal Anti-βACTIN（TA-09，中杉金橋，1/2 000）；二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）（ZB-2305，中杉金橋，1/2 000）；目的一抗：Rabbit Anti MMP-2 （AF0577，Affinity，1/500）；目的一抗：Rabbit Anti MMP-9（AF5228，Affinity，1/500）；目的一抗：Rabbit Anti TNF-α （AF7014，Affinity，1/500）；目的一抗：Rabbit Anti COX2 （AF7003，Affinity，1/500）；二抗：辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（ZB-2301，中杉金橋，1/2 000）。本研究經(jīng)山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 ①細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620購于源葉生物（B21177），SW620細(xì)胞傳代擴(kuò)培，鋪96孔板。實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞加藥處理，24 h完成造模進(jìn)行CCK8檢測，摸索藥物最佳濃度。LC-A濃度摸索分組如下：空白組、5 μg/ml LC-A處理組、10 μg/mL LC-A處理組、15 μg/mL LC-A處理組、20 μg/mL LC-A處理組、25 μg/mL LC-A處理組、30 μg/mL LC-A處理組、40 μg/mL LC-A處理組、45 μg/mL LC-A處理組、50 μg/mL LC-A處理組、60 μg/mL LC-A處理組、70 μg/mL LC-A處理組。②實(shí)驗(yàn)分組。對照組：用10 μg/mL的LC-A處理SW620細(xì)胞；低劑量組（Medium succinate acid group）：用10 μg/mL的LC-A處理SW620細(xì)胞；中劑量組（Low succinate acid group）： 用 15 μg/mL 的LC-A處理SW620細(xì)胞；高劑量組（High succinate acid group）：用20 μg/mL的LC-A處理SW620細(xì)胞。③CCK8法。藥物處理前12 h鋪板，密度稀釋為每孔5×103個SW620細(xì)胞，每孔加懸液100 μL；培養(yǎng)過夜后加入4種不同濃度的LC-A，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸掉培養(yǎng)基，每孔加10 μLCCK8試劑，于培養(yǎng)箱中孵育96孔板2 h；采用酶標(biāo)儀（北京市六一儀器廠，型號：WD-2102B）測定在450 nm處每孔的吸光值，計(jì)算存活率。④劃痕實(shí)驗(yàn)。將SW620細(xì)胞接種于6孔板，待貼壁的單層細(xì)胞密度達(dá)到90%以上，用200 μL槍頭在孔內(nèi)劃線，每孔劃3條平行線，PBS清洗3次洗去劃下的SW620細(xì)胞，再換用不含血清的培養(yǎng)基，加入不同濃度的LC-A，采用倒置顯微鏡（OLYMPUS，型號：CX41）觀察并給每孔的劃痕拍照（0 h）；培養(yǎng)箱孵育48 h后再次拍照（48 h）。測量0 h和48 h劃痕的寬度，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞的遷移速率。遷移速率=遷移距離/遷移時(shí)間×100%。⑤Transwell實(shí)驗(yàn)。將造模后的SW620細(xì)胞消化、收集、離心，用無血清的培養(yǎng)處理細(xì)胞，計(jì)數(shù)，每個小室細(xì)胞數(shù)5×104個；在侵襲小室下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，上室細(xì)胞與無血清培養(yǎng)基總體積300 μL；培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后染色。⑥WB檢測。取指數(shù)生長期SW620細(xì)胞接種于6孔板，過夜，待細(xì)胞貼壁后，各孔中分別加入不同濃度的LC-A孵育48 h。棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍，在冰上每孔加入100 μL的細(xì)胞裂解液。將細(xì)胞刮至一側(cè)，移液槍吸入已做好標(biāo)記的EP管中。采用高速離心機(jī)（Eppendorf，型號：5424R ）以12 000 r/min離心10 min，取上清液移至新的EP管（BCA測定），蛋白變性，置于-20 ℃環(huán)境下保存。上樣、電泳（SDSPAGE）1.5 h，用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h。將轉(zhuǎn)有蛋白質(zhì)的PVDF膜放入一抗孵育盒，4 ℃冰箱孵育過夜，次日將PVDF膜放入二抗孵育盒，室溫2 h，洗膜，顯影成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)。組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LC-A 對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖影響 通過CCK8法檢測LC-A對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 增殖的抑制情況，LC-A 濃度大于或等于15 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖受到顯著抑制，見圖1。

圖1 不同濃度的LC-A 對SW620細(xì)胞增殖的影響

2.2 LC-A 對SW620細(xì)胞遷移影響 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，處理組與對照組低、中、高劑量的發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、圖3。

圖2 Transwell（不帶膠小室）檢測不同劑量LC-A 對SW620細(xì)胞遷移的影響

圖3 Transwell（不帶膠小室）檢測不同劑量LC-A 對SW620細(xì)胞遷移能力定量分析

2.3 LC-A對SW620細(xì)胞侵襲影響 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，處理組低、中、高劑量的發(fā)生遷移的細(xì)胞侵襲少于對照組，細(xì)胞的侵襲能力受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4、圖5。

圖4 Transwell（帶膠小室）檢測不同劑量LC-A 對SW620細(xì)胞侵襲能力

圖5 Transwell（帶膠小室）檢測不同劑量LC-A 對SW620細(xì)胞侵襲能力定量分析

2.4 Western blot 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，不同劑量LC-A 的處理組中人結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9 表達(dá)均下調(diào)；NF-κB 通路激活因子TNF-α、COX2 表達(dá)也下調(diào)，見圖6。

圖6 WB 檢測侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白及NF-κB 通路激活因子的表達(dá)

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LC-A 能夠顯著抑制SW620 細(xì)胞的增殖。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選用0、10 μg/mL、15 μg/mL 和20 μg/mL作為藥物處理組的加藥濃度，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LC-A 可以顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 的遷移和侵襲，但不呈濃度依賴性。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LC-A 顯著抑制SW620侵襲，呈濃度依賴性。結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移侵襲過程中，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）與細(xì)胞之間相互作用。在各種ECM 蛋白分解過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）起到重要作用。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要一員，MMP-9通過降解基底膜的主要成分：Ⅳ型膠原蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲[5]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞中MMPs 過表達(dá)，尤其是MMP-9，所以，減少M(fèi)MPs 的表達(dá)是一種可能的抗結(jié)腸癌途徑[6]。本研究WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LC-A 明顯抑制MMP-9 和MMP-2 的表達(dá)，且呈現(xiàn)特異性蛋白-1（濃度依賴性。各種轉(zhuǎn)錄因子[如激活蛋白-1（AP- 1）、NF- κB、Sp-1 ）等]均調(diào)控MMP-9 和MMP-2 的基因表達(dá)[7]。通過WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LC-A可以明顯下調(diào)NF- κB 信號通路TNF-α、COX2 等激活因子的表達(dá)。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，NF-κB的持續(xù)激活，促進(jìn)MMP-9和MMP-2等下游目的基因的高表達(dá)，這在結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲中起到重要作用[8]，抑制NF-κB的活性可能成為抗結(jié)腸癌的重要途徑[9-10]。

綜上，LC-A 通過抑制NF-κB 信號通路的激活抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的遷移侵襲，LC-A是一種潛在的治療結(jié)腸癌的藥物。